Hipokampal Theta Bandında Tuning In vitro: İzole edilmiş Kemirgen Protokokal Circüse Kayıt için Metodolojiler

Burada, izole edilmiş bir tüm hipokampal preparattan ritmik nöronal ağ teta ve gama titreşimleri kaydetmek için bir protokol sunuyoruz. Hipokampusun çıkarılmasından teta ritminin optogenetik pacinginin yanı sıra alan, üniter ve tüm hücre yama klemp kayıtlarının ayrıntılarına kadar olan deneysel adımları açıklıyoruz.

Bu protokolün genel amacı, tüm hipokampal preparatın çıkarılması ve optogenetik stimülasyonun yanı sıra alan, üniter ve yama-klemp kayıtları kullanılarak ritmik nöronal ağ oluşumunu keşfetmek için prosedürler sunmaktır. Bu yöntem, hipokampustaki ritmik salınımların altında yatan hücresel ve sinaptik mekanizmaların incelenmesini büyük ölçüde kolaylaştırarak, sinirbilim öğrenme ve hafıza alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hipokampal bağımlı hafıza bilgisinde çok önemli bir rol oynayan ayrıntılı salınımlardaki devreleri araştırmak için optimize edilmiş bir hazırlık kullanmasıdır.

Bu işleme başlamak için, beyni diseksiyon kabına dik pozisyonda yerleştirin, beyinciği bir jiletle çıkarın, ardından beyni orta sagital düzlem boyunca ikiye bölün ve iki izole yarım küreyi tutma odasına geri koyun. Daha sonra, tek hemiseksiyonlu beyni diseksiyon kabına dik olarak yerleştirin. Orta sagital yapılar deneyciye bakana kadar çanağı döndürün ve septal kompleksin gömülü ana hatları, talamusun iç kısmında ince armut biçimli bir doku tabakası olarak görünün.

Ardından, septumun altına kaplanmış bir spatula yerleştirin ve diseksiyon kabına ulaşılana kadar ucu aşağı doğru hareket ettirin, septum alanını samimi bir şekilde bağlayan lifleri kesin. Şimdi, aynı işlemi septumun ön kenarı boyunca tekrarlayın ve beynin ön kısmına bağlanan lifleri kesin. Spatula, korteksin iç kısmını hipokampusun hemen üzerinde dik konumda hafifçe tutarken, talamik, hipotalamik ve kalan beyin sapı çekirdeklerini dikkatlice aşağı çekmek için mikrospatulayı kullanın.

Daha sonra, çekilen dokuyu kesmek ve çıkarmak için spatulayı kullanın. Daha sonra, kaplanmış spatulayı dorsal hipokampusun rostral ucunun altındaki lateral ventriküle yerleştirin. Spatulayı, hemiseke edilmiş beynin orta sagital düzlemi ile aynı hizada yatay olarak tutun ve uç samimi bir şekilde çıkana kadar ventriküler duvarların düz konturu boyunca kaydırın.

Spatulayı hipokampusun altında tutun ve hipokampusun üstteki korteks ile birleştiği iç katman boyunca bağlantı liflerine hafifçe bastırın, ardından mikrospatulayı bu katmanın dış tarafına uygulayın ve kaplanmış spatulaya bastırın. Ekstraksiyonu tamamlamak için diseksiyon kabını döndürün ve kaplanmış spatulayı ventral hipokampusun altına yerleştirin. Hipokampusu spatula ile hafifçe tutun ve spatulaya karşı bir dilimleme hareketi kullanarak endokrin bağlantıları kesin.

İzolasyon tamamlandıktan sonra, hipokampusu tabağın üzerinde dinlendirin ve serin tutmak için bir damla buz gibi soğuk sükroz çözeltisi ekleyin. Kalan korteks ve lifleri dikkatlice kesin ve fornikse hafifçe bir tıraş bıçağı uygulayarak hipokampusu septumdan ayırın. Bundan sonra, preparatı oda sıcaklığındaki sükroz çözeltisine aktarın ve kayıt odasına aktarmadan önce 15 ila 30 dakika iyileşmesine izin verin.

Bu adımda, oksijenli ACSF akışında sürekli yüksek hız sağlamak için yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemini kurun. Ardından, ACSF akışını durdurun ve bir cam pipetin geniş ucunu kullanarak hipokampusu kayıt odasına aktarın. Sükroz doymuş preparatın batmasına ve dibe çökmesine izin verin.

Preparayı, CA1 ve subiculum'un pürüzsüz yüzeyi üstte olacak şekilde kayıt odasının ortasına yerleştirin. Hipokampusu septal ve temporal ekstremitelerin küçük ağırlıkları ile stabilize edin ve ACSF akışını yeniden başlatın. Bu prosedürde, LFP elektrodunu hipokampusun yüzeyine indirin.

LFP elektrodunu parametre katmanı boyunca ilerletin ve tek tek nöronlardan tek birim deşarj tespit edildiğinde hücre dışı sivri uç aktivitesindeki artışı gözlemleyin. Elektrodu daha da indirin ve uç radiatoma geçerken sivri uçların tekrar solmaya başladığına dikkat edin. Teta frekans aralığında açıkça görülebilen bir ağ salınımının belirginleştiğini ve kayıt konumu radiatom boyunca alçaltıldığında maksimum genliğe ulaştığını gözlemleyin.

CA1 bölgesi boyunca spontan teta salınımlarının uzamsal özelliklerini test etmek için, bir CA1 bölgesine ikinci bir LFP elektrodu yerleştirin ve CA1 teta salınımlarının büyük mesafelerde senkronize olduğunu gözlemleyin. Hipokampal katmanlar boyunca teta salınımlarının özelliklerini test etmek için, bir CA1 radiatom bölgesinde bir referans LFP elektrodu bırakın. Stratum oriens'in hemen üstünden başlayarak, parametre hücre katmanına ve radiatomun içinden ikinci bir elektrot indirin.

Parametre katmanı boyunca LFP sinyalinin kademeli olarak ters çevrildiğini gözlemleyin. Sağlam hipokampusta gama salınımlarını ve teta gama eşleşmesini test etmek için, CA1 subiculum sınırına bir alan elektrodu yerleştirin ve parametre ile moleküler katmanlar arasındaki arayüze oturana kadar indirin. Bu seviyede, fazın yerel teta ritmine kilitlendiği genlikteki değişikliklerle birlikte net gama salınımları gösteren bir alan potansiyeli kaydedilebilir.

Ardından, teta gama eşleşmesinin yavaş zaman ölçeğini gözlemlemek için ölçeklendirmeyi ayarlayın. Gama patlamalarının, yavaş ve hızlı gama aralığında, devam eden LFP sinyali sırasında bant tarafından ortaya çıkarılabilen iki farklı frekans bandında meydana geldiğini unutmayın. İn vitro hipokampal teta salınımları sırasında tüm hücre yama kelepçesi kaydı için, bir PV tom fareden alınan bir hipokampal preparatın yüzeyine yakın bulunan tdTomato pozitif internöronları görselleştirmek için düşük ve yüksek güçlü büyütmeli floresan video mikroskobu kullanın.

Hipokampusun düşük büyütme görünümü altında, yama kelepçesi deneylerine hazırlanırken teta salınımlarını izlemek için CA1 subiculum'a bir LFP elektrodu yerleştirin. Ardından, 40x büyütmeye geçin ve hedefi hedef bölgenin üzerine daldırın. Üst katmanlar görünür hale gelene kadar indirin, floresan mikroskobu altında, floresan PV tom hücresini seçin ve standart hücreler arası çözelti ile doldurulmuş bir yama pipeti ile yaklaşın.

Tüm hücre konfigürasyonuna girdikten sonra, spontan hipokampal salınımlar sırasında tanımlanan PV hücresinin fizyolojik özelliklerini inceleyin. Hızlı sivri çıkma davranışı ve devam eden CA1 subiculum teta ritmi ile senkronize edilmiş aksiyon potansiyeli patlamaları ile karakterize edilen PV hücrelerinden hücre içi membran potansiyeli kaydını gözlemleyin. Bu prosedürde, CA1 subiculum alanına bir LFP elektrodu yerleştirin ve bir farenin izole edilmiş hipokampüsüne yakındaki bir parametre hücresini yamalayın, PV internöronlarında mavi ışığa duyarlı uyarıcı opcin, CHR2'yi ifade edin.

Hipokampal preparatın üzerine bir optik fiber ışık kılavuzu yerleştirin ve kaydedilen bölge üzerinde ortalayın. Optik genetik stimülasyon için 10 ila 20 milisaniyelik ışık darbelerinden veya teta frekanslarında verilen günah dalgası voltaj komutlarından oluşan bir LED kaynağından gelen mavi ışığı kullanın. Akım kelepçesinde, spontan teta salınımları sırasında kaydedilen hücrenin aktivitesini karakterize edin.

Ardından, stimülasyon protokolünü başlatın ve ışık tepkilerini kaydedin. Alan salınımlarının ve sinaptik aktivitenin ve kaydedilen nöronun, optogenetik stimülasyon sırasında giderek daha fazla senkronize hale geldiğini ve PV hücrelerinin ritmik pacing'inin, teta salınımlarının hem frekansının hem de gücünün sağlam bir şekilde kontrol edilmesiyle sonuçlandığını gözlemleyin. Burada gösterilen, teta salınımları sırasında bir parametre hücresinden kaydedilen elektrofizyolojik aktivitedir.

Mevcut klemp izleri, istirahatte kendiliğinden ancak ritmik olmayan ateşlemeyi ve yavaş ortaya çıkan LFP salınımı ile net bir şekilde senkronize olmayan inhibitör post sinaptik potansiyelleri gösterir. Gerilim kelepçesi kayıtları, karşılık gelen inhibitör post sinaptik akımların eksi 70 milivolt civarında ters potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. Ve burada, teta salınımları sırasında hızlı yükselen bir floresan PV internöronundan kaydedilen elektrofizyolojik aktivite var.

Akım kelepçesinde, bu hücre dinlenme halindeyken kendiliğinden ateşleniyordu ve kararlı LFP salınımı ile aşamalı olarak kilitlenen ritmik uyarıcı post sinaptik potansiyeller tarafından güçlü bir şekilde yönlendiriliyordu. Gerilim kelepçesi kayıtlarında, uyarıcı post sinaptik akım tersine çevirme potansiyeli yaklaşık olarak sıfır milivolttaydı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki ila üç saat içinde gerçekleştirilebilir, bu prosedürü denerken, bir çözeltiyi kuvvetli bir şekilde oksijenlendirmeyi ve elektrofizyolojik kayıtlar sırasında preparat üzerinde yüksek hızlı ancak sabit silahlı ACSF akışına izin veren bir perfüzyon sistemi kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, hipokampusta teta osilatörlerini oluşturan hücresel alt tiplerin tanımlanması gibi ek soruları yanıtlamak için optogenetik stimülasyon veya belirli hücre tipi popülasyonlarının susturulması gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, hipokampusun septal temporal ekseni boyunca teta salınımlarının dinamiklerini in vitro olarak sistematik olarak keşfetmeleri için bir yol açtı. Bu videoyu izledikten sonra, optogenetik stimülasyonun yanı sıra alan, birim ve yama klemp kayıtlarını kullanarak ritmik nöronal ağların işlevini keşfetmek için bütün bir hipokampus preparatının nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.