N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

Bu metodolojinin genel amacı, HIV antikorlarının heteroglikan bağlanmasını tespit etmek için alüminyum oksit kaplı bir cam slayt üzerinde yeni bir glikan mikro dizisi oluşturarak, N-glikanların sentezine yönelik modüler bir kemo-enzimatik yaklaşım geliştirmektir. Bu yöntemler, gelişmiş çalışmalar için hücre virüs spesifik glikanların tanımlanmasıyla ilgili glikobiyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, zayıf bağlanmayı tespit edebilmesi ve HIV hastasından alınan antikor gibi bir proteine bağlanan şeker karışımlarını tanımlayabilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, insan hava yolları epitel hücrelerinde siyalik katabolistlerin eksprese olması ve semptomlarla birlikte yaygın görülmesi nedeniyle influenza enfeksiyonlarının teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu nedenle, gliko-dizi wild alt tiplerinin spesifikliğini belirlemek için ideal bir araç olacaktır. Bu yöntem, HIV antikorlarının glikan spesifisitesi hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, yüzeye basılmış insan spesifik serum antigenlerine karşı insan serum antikorlarının bağlanma paternine dayalı olarak çeşitli kanserlerin teşhisi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış 2-5 micromoles glikanı beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir balona ekleyin. Balona manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve kauçuk bir septumla kapatın. Balona 400 microliters taze kurutulmuş DMF ve 10-25 micromoles fosfonik asit bağlayıcı ekleyin.

Ardından, reaksiyon karışımını 800 rpm hızda beş saat boyunca karıştırın. Reaksiyon tamamlandığında, çözücüyü bir döner evaporatör kullanarak 5 ila 10 millibar vakum basıncı ve 40 °C sıcaklıkta uçurun. Bunun ardından, kurutulmuş reaksiyon karışımını 0,5 mL su ile çözün ve poliakrilamid jel yatağının üzerine yükleyin.

Ürünleri su kullanarak elüye edin ve bir ila iki mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Toplanan fraksiyonları TLC ile kontrol etmek için, her fraksiyonu bir TLC plakasına damlatın ve plakayı 0.25 molar Seryum Amonyum Molibdat içine daldırın. Ürünü görselleştirmek için boyanan plakayı bir ısıtıcı tabla ile ısıtın.

Ürünü içeren fraksiyonları birleştirdikten sonra, istenen ürünü beyaz bir toz olarak elde etmek için çözeltiyi biyodondurarak kurutun. Ardından, kurutulmuş ürünü iki mililitre su içerisinde çözün ve Palladyum Hidroksit ekleyin. Balona hidrojen içeren bir balon bağlayın ve reaksiyon karışımını hidrojen atmosferi altında 800 rpm hızında 15 saat boyunca karıştırın.

Reaksiyon tamamlandığında, karışımı bir Celite Yatağından süzün ve iki mililitre metanol ve iki mililitre distile deiyonize su ile yıkayın. Ardından, çözücüyü 300 milibar vakum basıncı ve 40 °C sıcaklıkta bir döner evaporatör kullanarak uçurun. Bunun ardından, ham karışımı yaklaşık bir mililitre suda çözün ve bir poliakrilamid jel yatağının üzerine yükleyin.

Ürünü su ile elüye edin ve bir ila iki mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Ürünü içeren fraksiyonları birleştirdikten ve çözeltiyi dondurduktan sonra, istenen ürünü beyaz bir toz şeklinde elde etmek için biyofolize edin. Ürün kuruduğunda, çözücü olarak Deuterium Oxide kullanarak enimar ve kütle spektroskopisi ile karakterize edin.

Yüzey anodizasyonu için, sıcaklık kontrollü bir inkübatörü 4 °C'ye ayarlayın. Ardından, daha önce hazırlanmış 0.3 molar sulu oksalik asit çözeltisini, içinde manyetik karıştırma çubuğu bulunan 500 ml'lik bir behere aktarın. Katot olarak 10 cm uzunluğunda bir platin çubuğu çözeltinin içine yerleştirin.

Anotlama işlemi boyunca oksalik asidi 300 rpm'de karıştırmaya devam edin. Laboratuvar izleyici yazılımında kurulum (setup) düğmesine tıklayın ve ardından Gerilim Tarama (Sweep Voltage) fonksiyon seçeneğine tıklayın. Başlangıç ve bitiş voltajını 25.8 volt olarak ayarlayın.

Nokta sayısını 100, uyumluluğu (compliance) bir ve tarama gecikmesini 1200 milisaniye olarak ayarlayın. Ardından, tamam'a tıklayın. Alüminyum kaplı bir cam lamı katoda bakacak şekilde sabitleyin.

Testi çalıştır düğmesine tıklayın ve mevcut ölçümü gözlemleyin. Yüzey anodizasyonundan sonra, lamı çift distile su ile iyice yıkayın ve nitrojen gazı ile kurutun. Lamı, daha sonra kullanılana kadar %30 bağıl nem odasında saklayın.

Fabrikasyon için, tüm monovalent glikanların etanol glikol içerisinde 10 millimolar konsantrasyondaki 100 mikrolitre çözeltilerini hazırlayın. Glikan çözeltilerini, 100 mikromolar çözeltiler elde etmek için baskı tamponu ile seyreltin. Heteroligand Çalışması için, her bir glikan çözeltisinin beş mikrolitresine beş mikrolitre MAN-5 Glikanı ekleyin.

Hazırlanan glikanları, mikroarray baskı aşaması için 384 kuyucuklu mikroplakaya aktarın. Mikroplakayı yazıcı dizin sistemine yerleştirdikten sonra, her bir alüminyum kaplı cam lam üzerine 0,6 nanolitre glikan çözeltisi çöktürerek robotik pinlerle mikroarray baskısını gerçekleştirin. Ardından, 3%BSA içeren PTSB tamponu içinde 70 mikrolitre primer antikor PG-9 hazırlayın.

Ardından, karanlık ortamda 120 µL sekonder floresan işaretli antikor Donkey ve Anti-human Immunoglobulin G ile %3 BSA içeren PBST tamponu hazırlayın. PG9 ile sekonder floresan işaretli antikoru 1:1 oranında karıştırın. Daha sonra, önceden karıştırılmış antikorları dört derece Celsius'da 30 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, 16 kuyucuğa bölünmüş olan lam inkübasyon odasına alüminyum kaplı bir cam lam yerleştirin. Önceden karıştırılmış antikorların 100 µL'sini glikan dizisine aktarın. 4 °C'de 16 saat inkübe ettikten sonra, önceden karıştırılmış antikorları bir pipet yardımıyla glikan dizisinden uzaklaştırın ve ardından lam inkübasyon odasını çıkarın.

Cam lamı PBST tamponu ve deiyonize su ile yıkayın. Ardından cam lamı 2000 ×g hızda santrifüj ederek kurutun. Sonrasında, mikroarray görüntü analiz yazılımını açın.

Cam kurutulmuş lamı, dizili özellikler aşağı bakacak şekilde dizi tarayıcısına yerleştirin. Ayarlar menüsüne tıklayın. Görüntü çözünürlüğünü piksel başına beş mikrometre olarak ayarlayın.

Dalga boyunu 635 nanometreye, PMT'yi 450'ye ve gücü %100'e ayarlayın. Lamın görüntülemesine başlamak için tarama düğmesine tıklayın. Son olarak, tarama görüntüsünü görüntü analizi için TIF formatında kaydetmek üzere dosya simgesine tıklayın. Bu çalışmada, modüler kemo-enzimatik bir strateji kullanılarak geniş bir N-Glikan yelpazesi sentezlenmiştir.

Stratejinin etkinliğini göstermek amacıyla, kemoenzimatik yöntemlerle biantenli izometrik bir yapı sentezlenmiştir. Disakkarit 1'in enzimatik galaktozilasyonu ve ardından trisakkarit 2'nin fukozilasyonu, hedeflenen tetrasakkarit 3'ü sağlamıştır. Yapı taşı iki ve üçün perasetilasyonu ve indirgen uç modifikasyonları, hedeflenen molekül dört ve beşi sağlamıştır.

Trisakkarit altının dördüncü modülünün stereoselektif üçlü O-glikozilasyonu heksasakkarit yediyi sağlamıştır. Koruyucu grupların uzaklaştırılması ve beşinci modül ile reaksiyon dekasakkarit dokuzu oluşturmuştur. Global koruyucu grup uzaklaştırılması, NMR ve kütle spektroskopi ile karakterize edilen glikan 10'u vermiştir.

Reducing ucunda Pentilamin kuyruğu içeren glikanlar, fosfonik asit bağlayıcılarla modifiye edildi ve fosfinid kimyası aracılığıyla alüminyum cam kaplı yüzeye tutturuldu. Geniş etkili nötralize edici HIV-1 antikoru PG9, HIV1 PG120 yüzeyinin V1/V2 döngüsündeki komşu heteroglikanlarla etkileşimini ilk kez göstermek amacıyla homo ve heteroglikan dizileri kullanılarak glikan özgüllüğü açısından tarandı. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülmesi durumunda glikan immobilizasyonundan beta analizine kadar tüm süreç 24 saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, Glycan 10 için taze anodize alüminyum kaplı cam lam kullanılması gerektiği unutulmamalıdır. Bu prosedürün uygulanması için med teknisyeni lamları kullanılır. İlgilenilen karbonhidrat ve protein arasındaki bağlanma etkileşimlerini nicelleştirmek amacıyla gövde sabitinin belirlenmesi işlemi gerçekleştirilebilir.

Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların Kenya'daki bulaşıcı hastalıklarda karbonhidratın rolünü daha iyi anlamalarının yolunu açmış ve hastalıklara karşı yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmuştur. Toksik ajanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve deneyler gerçekleştirilirken koruyucu kıyafet, gözlük ve maske kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.