N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

Bu metodolojinin genel amacı, HIV antikorlarının heteroglikan bağlanmasını tespit etmek için alüminyum oksit kaplı bir cam slayt üzerinde yeni bir glikan mikrodizisi oluşturarak N-glikanların sentezine modüler bir kemo-enzimatik yaklaşım geliştirmektir. Bu yöntemler, çok fazla gelişme için hücre virüsüne özgü glikanların tanımlanması için glikobiyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin en büyük avantajı, zayıf bağlanmayı tespit etmek ve HIV hastasından alınan antikor gibi bir proteine bağlanan şeker karışımını tanımlamaktır.

Bu tekniğin etkileri, influenza enfeksiyonlarının teşhisine kadar uzanır, çünkü sialik katabolistler insan hava yollarında eksprese edilir, epitel hücreleri ve semptomlar sırasında sorunlar yaygındır. Bu nedenle, glikoarray, yabani alt tiplerin özgüllüğünü belirlemek için ideal bir araç olacaktır. Bu yöntem, HIV antikorlarının glikan özgüllüklerine içeriden girebilse de, insan serum antikorlarının yüzeye basılmış insan spesifik serum antijenlerine bağlanma paternine dayalı olarak çeşitli kanserlerin teşhisi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu işleme başlamak için, önceden hazırlanmış 2-5 mikromol glikan ve beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişe ekleyin. Şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve kauçuk bir septum ile kapatın. Şişeye 400 mikrolitre taze kurutulmuş DMF ve 10-25 mikromol fosfonik asit bağlayıcı ekleyin.

Ardından, reaksiyon karışımını beş saat boyunca 800 rpm'de karıştırın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, çözücüyü beş ila 10 milibar vakum basıncında ve 40 santigrat derecede döner bir buharlaştırıcı kullanarak buharlaştırın. Bunu takiben, kurutulmuş reaksiyon karışımını ve 0.5 mililitre suyu çözün ve poliakrilamid jel yatağının üzerine yükleyin.

Ürünleri su kullanarak elute edin ve bir ila iki mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Toplanan fraksiyonları TLC ile kontrol etmek için, her fraksiyonu bir TLC plakasına yerleştirin ve plakayı 0.25 azı dişi Seryum Amonyum Molibdat içine batırın. Ürünü görselleştirmek için lekeli plakayı sıcak bir plaka ile ısıtın.

Fraksiyonlar içeren ürünü birleştirdikten ve çözeltiyi dondurduktan sonra, istenen ürünü beyaz bir toz olarak elde etmek için biyofolize edin. Daha sonra, kurutulmuş ürünü iki mililitre su içinde çözün ve Paladyum Hidroksit ekleyin. Şişeye hidrojen içeren bir balon takın ve reaksiyon karışımını hidrojen atmosferi altında 15 saat boyunca 800 rpm'de karıştırın.

Reaksiyon tamamlandıktan sonra, karışımı bir Elit Yataktan süzün ve iki mililitre metanol ve iki mililitre damıtılmış deiyonize su ile yıkayın. Ardından, 300 milibar vakum basıncında ve 40 santigrat derecede döner bir buharlaştırıcı kullanarak çözücüyü buharlaştırın. Bunu takiben, ham karışımı yaklaşık bir mililitre suda çözün ve bir poliakrilamid jel yatağının üzerine yükleyin.

Ürünü suyla yükseltin ve bir ila iki mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Fraksiyonlar içeren ürünü birleştirdikten ve çözeltiyi dondurduktan sonra, istenen ürünü beyaz bir toz olarak elde etmek için biyofolize edin. Ürün kuruduktan sonra, çözücü olarak Döteryum Oksit kullanarak enimar ve kütle spektroskopisi ile karakterize edin.

Yüzey eloksallaması için, sıcaklık kontrollü bir inkübatörü dört santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra önceden hazırlanmış bir 0.3 molar sulu oksalik asit çözeltisini, manyetik bir karıştırma çubuğu içeren 500 mililitrelik bir behere aktarın. Çözeltiye katot olarak 10 santimetre uzunluğunda bir platin çubuk yerleştirin.

Anotlama işlemi boyunca oksalik asidi 300 rpm'de karıştırmaya devam edin. Laboratuvar izleyici yazılımında, kurulum düğmesine tıklayın ve ardından Süpürme Voltajı işlev seçimine tıklayın. Başlatma ve durdurma voltajını 25,8 volta ayarlayın.

Nokta sayısı 100'e, uyumluluk bire ve süpürme gecikmesi 1200 milisaniyeye kadar. Ardından, Tamam'ı tıklayın. Katoda bakacak şekilde alüminyum kaplı bir cam sürgüyü sıkıştırın.

Testi çalıştır düğmesine tıklayın ve mevcut ölçümü gözlemleyin. Yüzey eloksalından sonra, cam sürgüyü çift damıtılmış su ile iyice yıkayın ve nitrojen gazı ile kurulayın. Cam sürgüyü daha fazla kullanılana kadar %30 bağıl nem odasında saklayın.

İmalat için, 10 milimolar konsantrasyonda etanol glikol içinde tüm monovalent glikanlardan 100 mikrolitre çözelti hazırlayın. 100 mikromolar çözelti yapmak için glikan çözeltilerini baskı tamponu ile seyreltin. Heteroligand Çalışması için, her bir glikan çözeltisinin beş mikrolitresine beş mikrolitre MAN-5 Glikan ekleyin.

Hazırlanan glikanları mikrodizi baskı adımı için 384 kuyulu mikroplakaya aktarın. Yazıcı dizisi teknolojisine bir mikroplaka yerleştirdikten sonra, her bir alüminyum kaplı cam slayt üzerine 0,6 nanolitre glikan çözeltisi bırakarak mikrodizileri robotik pimle yazdırın. Daha sonra 70 mikrolitre primer antikor PG-9 ve% 3 BSA içeren PTSB tamponu hazırlayın.

Daha sonra karanlıkta 120 mikrolitre ikincil floresan etiket antikoru Eşek ve Anti-insan İmmünoglobulin G ve %3 BSA içeren PBST tamponu hazırlayın. PG9 ve ikincil floresan etiket antikorunu 1:1 oranında karıştırın. Daha sonra önceden karıştırılmış antikorları dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, 16 oyuğa bölünmüş olan slayt inkübasyon odasına alüminyum kaplı bir cam slayt yükleyin. Önceden karıştırılmış antikorların 100 mikrolitresini glikan dizisine aktarın. Dört santigrat derecede 16 saat inkübe ettikten sonra, önceden karıştırılmış antikorları bir pipetle glikan dizisinden çıkarın ve ardından slayt inkübasyon odasını çıkarın.

Cam sürgüyü PBST tamponunda ve deiyonize suda yıkayın. Daha sonra cam sürgüyü 2000 kez yerçekiminde kurutun. Ardından, mikrodizi görüntü analiz yazılımını açın.

Camla kurutulmuş slaytı, dizili özellikler aşağı bakacak şekilde dizi tarayıcıya yerleştirin. Ayarlar menüsüne tıklayın. Görüntü çözünürlüğünü piksel başına beş mikrometre olarak ayarlayın.

Ve PMT 450 ile dalga boyunu 635 nanometreye ayarlayın ve gücü %100'e getirin Slaytı görüntülemeye başlamak için tarama düğmesine tıklayın. Son olarak, tarama görüntüsünü görüntü analizi için TIF formatında kaydetmek için dosya simgesine tıklayın. Bu çalışmada, modüler bir kemoterapi enzimatik stratejisi kullanılarak çok çeşitli N-Glikanlar sentezlendi.

Stratejinin etkinliğini göstermek için, kemoenzimatik yöntemlerle iki antenli bir izometrik yapı sentezlendi. Disakkarit 1 için enzimatik galaktosilasyon ve ardından trisakkarit 2'nin fukosilasyonu, istenen tetrasakkarit 3'ü sağladı. Doyurma başına ve yapı bloğu iki ve üçüncülüğün son modifikasyonları, dördüncü ve beşinci molekülü arzulamak için sağlandı.

Trisakkarit altı'nın dördüncü modülünün stereoselektif üç O-glikosalizasyonu, hekzasakkarit yedi sağladı. Beşinci modülden önce korumanın kaldırılması ve reaksiyon, dokuzuncu dedekakkarit verdi. Küresel tespit, enimar ve kütle spektroskopisi ile karakterize edilen glikan 10'u sağladı.

İndirgeyici uçta bir Pentilamin kuyruğu içeren glikanlar, fosfonik asit bağlayıcıları ile modifiye edildi ve fosinit kimyası yoluyla alüminyum cam kaplı yüzeye tutturuldu. HIV-1 geniş ölçüde nötralize edici antikor PG9, HIV1 PG120 yüzeyinin V1 / V2 döngüsündeki bitişik heteroglikanlarla eterleşmesini ilk kez göstermek için homo ve heteroglikan dizileri kullanılarak glikan özgüllüğü açısından tarandı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilmişse, glikan immobilizasyonundan beta analizine kadar 24 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, Glycan 10 için yeni eloksallanmış alüminyum kaplı cam slayt kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü döşemek için tıp teknisyenleri slaytlarıdır. Vücut sabitinin belirlenmesi, ilgilenilen karbonhidrat ve protein arasındaki bağlanma etkileşimlerini ölçmek için yapılabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesinden sonra, araştırmacıların Kenya'daki bulaşıcı hastalıklarda karbonhidratın rolünü daha iyi anlamalarının ve hastalıklara karşı yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmalarının yolunu açtı. Toksik ajanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve deneyler yapılırken her zaman giysi, gözlük ve maske takma gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.