Name: N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Keşfedin N-glukan sentezi ve HIV antikor profilleme yöntemini glikan mikrodizileri kullanarak. Bu teknik zayıf bağlanma etkileşimlerini tespit ederek glikobiyoloji ve tanı alanında yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ince Film teknolojisi bölümü, enstrüman Teknoloji Araştırma Merkezi (ITRC) ve ulusal uygulamalı araştırma laboratuvarları, Hsinchu bilim Parkı, Tayvan teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Konseyi tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. ÇOĞU 105-0210-01-13-01) ve Academia Sinica.

<ol><li>Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centralized+modularity+of+N-linked+glycosylation+pathways+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells.</a> PloS one. 4, e7317(2009).</li>
<li>Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Role+of+an+N-Linked+Glycan+on+the+Surface+Antigen+of+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Modulating+Virus+Sensitivity+to+Broadly+Neutralizing+Antibodies+Against+the+Receptor+and+Coreceptor+Binding+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.virol%22%5BJournal%5D)">Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites.</a> J.virol. 90, 829-841 (2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Strategy+for+the+Chemoenzymatic+Synthesis+of+Asymmetrically+Branched+N-Glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans.</a> Science. 341, 379-383 (2013).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Chemoenzymatic+Synthesis+of+an+N-glycan+Isomer+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library.</a> Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).</li>
<li>Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+Protein-Directed+Glycosylation+of+Native+Cleaved+HIV-1+Envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.Virol%22%5BJournal%5D)">Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope.</a> J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).</li>
<li>Behrens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+Antigenic+Effects+of+Individual+Glycan+Sites+of+a+Trimeric+HIV-1+Envelope+Glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein.</a> Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).</li>
<li>Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+development+of+an+HIV-1+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Challenges in the development of an HIV-1 vaccine.</a> Nature. 455, 613-619 (2008).</li>
<li>Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Strategies+Targeting+HIV+Glycans+in+Vaccine+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Bio%22%5BJournal%5D)">Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design.</a> Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).</li>
<li>Wang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+carbohydrate+Antigens+for+HIV+Vaccine+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design.</a> Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).</li>
<li>Tian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Glycosylation+on+an+Immunodominant+Region+in+the+V1V2+Variable+Domain+of+the+HIV-1+Envelope+gp120+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).</li>
<li>Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrates+of+human+Immunodeficiency+Virus.+Structures+of+Oligosaccharides+Linked+to+the+Envelope+Glycoprotein+120%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120.</a> The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).</li>
<li>Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+Structure+of+A+Native%2C+Fully+Glycosylated%2C+Cleaved+HIV-1+Envelope+Trimer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer.</a> Science. 351, 1043-1048 (2016).</li>
<li>Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+GlycanMicroarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Natural GlycanMicroarrays.</a> Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).</li>
<li>Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweet+Spots+in+Functional+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Bio%22%5BJournal%5D)">Sweet Spots in Functional Glycomics.</a> Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).</li>
<li>Dotsey, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Throughput+Protein+Microarray+Approach+to+Classify+HIV+Monoclonal+Antibodies+and+Variant+Antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens.</a> PLoS One. 10, e0125581(2015).</li>
<li>Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Development+of+Glycan+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">New Development of Glycan Arrays.</a> Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).</li>
<li>Scurr, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterization+of+Carbohydrate+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays.</a> Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+Covalent+Glycan+Array+for+Ligand+Profiling+of+Diverse+Glycan+Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).</li>
<li>Chang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+Array+on+Aluminum+Oxide-Coated+Glass+Slides+Through+Phosphonate+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).</li>
<li>Tseng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsomega.6b00143">Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays.</a> ACS Omega. 1, 773-783 (2016).</li>
<li>Shivatare, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Convergent+Synthesis+of+Bi-%2C+Tri-%2C+and+Tetra-Antennary+Complex+Type+N-Glycans+and+Their+HIV-1+Antigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).</li>
<li>Shivatare, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+synthesis+of+N-Glycans+and+Arrays+for+the+Hetero-Ligand+Binding+Analysis+of+HIV+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies.</a> Nat Chem. 8, 338-346 (2016).</li>
<li>McLellan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Hiv-1+gp120+V1%2FV2+Domain+with+Broadly+Neutralizing+Antibody+PG9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9.</a> Nature. 480, 336-343 (2011).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Recognition+of+the+HIV-1+Trimer+by+Broadly+Neutralizing+Antibody+PG9%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).</li>
<li>Willis, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Antibody+HCDR3s+from+HIV-Native+Donors+Presented+on+a+PG9+Neutralizing+Antibody+Background+Mediate+HIV+Neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5499/performing-1d-thin-layer-chromatography">Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>de Castro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+approach+to+the+automation+of+analytical+processes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Automat+Chem%22%5BJournal%5D)">A useful approach to the automation of analytical processes?</a> J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5634/introduction-to-mass-spectrometry">Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Tseng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsomega.6b00143">Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays.</a> ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).</li>
<li>Blixt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printed+covalent+glycan+array+for+ligand+profiling+of+diverse+glycan+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="https://classes.soe.ucsc.edu/bme210/Spring07/GenePix_Pro_6.0_Manual_RevL.pdf">GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial</a>. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).</li>
<li>GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/">http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</a> (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

HIV-1 bNAbs PG9, PG16 ve PGTs 128, 141-145 dahil olmak üzere bir sınıf olduğunu bildirdi HIV-1 yalıtır dolaşan % 70-80 nötralize son derece güçlü olmak. Bu bNAbs epitopları tüm HIV-1 Grup M türevleri arasında son derece korunmuş, bu nedenle nötralize antikorlar23,24,25 temin bir HIV aşısı için etkili immunogen Tasarım Kılavuzu . HIV-1 geniş antikorları nötralize glycan epitopları tanımlamak için bizim devam eden çabalarının bir ...

N- glukanlardir glikoproteinlerin üzerinde kovalent asparagine için fikir birliği Asn-Xxx-Ser/Thr sequon kalıntısı (Asn) protein uyum, antigenicity, çözünürlük ve lektin tanıma gibi birçok biyolojik süreçlerin etkileyen bağlıdır 1 , 2. kimyasal sentez n-bağlantılı oligosakkaritler temsil eden önemli bir sentetik sorun onların büyük yapısal mikro heterojenite ve çok dallı mimarisi nedeniyle. Reaktivite yapı taşları, anomerik merkezleri ve organizatörü doğru kullanımı seçicilik ulaşmak ayarlamak için koruma dikkatli seçimi gruplar / activator(s) karmaşık oligosakkaritler sentezi temel unsurlarıdır. Karmaşıklık bu sorunu çözmek için N- glycan sentezi ilerlemek için iş büyük bir miktar bildirildi son zamanlarda3,4. Sağlam bu yaklaşımlardan rağmen büyük bir meydan (~ 20.000) kalıntıları N- glukanlardir geniş bir hazırlanması için etkili bir yöntem bulmak.
Geniş genetik çeşitlilik ve antikor yanıtı, nötralize kaçmak için onun yetenek elde etmek için HIV-1 hızlı mutasyon oranı olduğunu HIV-15,6 karşı güvenli ve profilaktik aşı geliştirmek için en büyük sorunları arasında , 7. konak immün yanıt önlemek için HIV kullanır bir etkili bir taktik olduğunu zarf glikoprotein gp120 farklı Nile post-translational glikozilasyon-bağlı ana bilgisayar glikozilasyon makine8, elde edilen glukanlardir 9. Rekombinant monomeric HIV-1 gp120 glikozilasyon insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücrelerden kesin analizi ile ilgili son bir rapor karakteristik hücre özel desen10 ile yapısal microheterogeneity oluşumunu göstermektedir , 11 , 12. bu nedenle, N- glycan yapıları analiz için yeterli bir miktar HIV-1 bNAbs glycan özelliklerine gerektirir iyi karakterize gp120 anlayış ile ilgili.
Glycan Mikroarray teknoloji keşfi karbonhidrat bağlanıcı proteinler, virüs/bakteriyel adhesins, toksinler, antikorlar ve lectines13,14 çeşitli bir yelpazede özelliklerine yüksek üretilen iş tabanlı keşif sağlanan . Sistematik glukanlardir düzenleme dizilmiş çip tabanlı biçimde sorunlu düşük benzeşme protein-glycan etkileşimleri ile multivalent tanıtımı15,16,17,18belirleyebilir. Bu çip tabanlı glycan düzenleme uygun etkili hücre-hücre arabirimleri taklit etmek için görünür. Teknoloji zenginleştirmek ve geleneksel dizi biçimleri ile ilişkili düzensiz sorunu aşmak için bizim grup son zamanlarda bir glycan dizi phosphonic asit sona erdi glukanlardir sinyal yoğunluğu artırmak için kullanarak bir alüminyum oksit kaplı cam (ACG) slayt üzerinde geliştirilen, homojenliği ve duyarlılık19,20.
Glycan epitopları yeni izole HIV-1 geniş antikorları (bNAbs) nötralize hakkında şimdiki anlayış geliştirmek için biz Ngeniş bir dizi hazırlanması için son derece verimli bir modüler strateji geliştirdik-bağlı glukanlardir21 ,bir ACG yazdırılacak22 (bkz. şekil 1) kaydırın. Özgüllük hetero-glycan bağlama davranışı son derece güçlü bNAb HIV izole PG9 sıradışı tespiti bireyler23,24,25enfekte HIV-1 bNAbs bir ACG dizisinde profil oluşturma çalışmaları sundu.

<table><tbody><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75058</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108247</td><td></td></tr><tr><td>Susuz magnezyum sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7487889</td><td></td></tr><tr><td>Bor triflorür etil eterat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>109637</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048468</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P2 poliakrilamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1504118</td><td></td></tr><tr><td>Bis(siklopentadienil)hafniyum(IV) diklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12116664</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-1, 4 Sığır sütünden galaktosil transferaz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48279</td><td></td></tr><tr><td>Robotik pimli BioDot Kart teknolojisi SMP3 (Gizli Mikro Tespit Pimleri)</td><td>Arrayit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seryum amonyum molibdat</td><td>TCI</td><td>C1794</td><td></td></tr><tr><td>Seryum amonyum nitrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16774213</td><td></td></tr><tr><td>Temiz cam slayt&nbsp;</td><td>Schott&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine-5&prime;-monofosfo-N-asetilnöraminik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3063716</td><td></td></tr><tr><td>Döteryumlu kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>865496</td><td></td></tr><tr><td>Eşek Anti-İnsan IgG (Alexa Fluor647 konjuge</td><td>Jackson Immuno Research, ABD</td><td>709605098</td><td></td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75092</td><td></td></tr><tr><td>Dietilaminosülfür triflorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38078090</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68122</td><td></td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>141786</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol</td><td>Acros Organik</td><td>107211</td><td></td></tr><tr><td>HIZLI çerçeve slayt kuluçka odaları</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanozin 5'- difosfo-b-L-fukoz disodyum tuzu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15839700</td><td></td></tr><tr><td>Lab tracer 2.0 yazılımı&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Protokolün 4. bölümü</td></tr><tr><td>GenePix Pro 4300A okuyucu (mikrodizi görüntü analizi)</td><td>moleküler cihazlar</td><td></td><td>www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software (Görüntü işleme)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td>http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/</td></tr> <tr><td>Lityum hidroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310652</td><td></td></tr><tr><td>Manganez klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7773015</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67561</td><td></td></tr><tr><td>N-bütanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71363</td><td></td></tr><tr><td>Oksalik asit</td><td>Acros Organik</td><td>144627</td><td></td></tr><tr><td>Paladyum hidroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12135227</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Su Termo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Piridin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>110861</td><td></td></tr><tr><td>P-Toluen sülfonik asit monohidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>773476</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş triflat,</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2923286</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr>, <tr><td>Sodyum klorür</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>7647145</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidrojen karbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>144558</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum metoksit&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>124414</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7757826</td><td></td></tr><tr><td>Toluen&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108883</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponu&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>N / A</td><td>Ultra saf sınıf</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Amresco</td><td>9005645</td><td></td></tr><tr><td>Uridin difosfat galaktoz (UDP-galaktoz)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>137868521</td><td></td></tr></tbody></table>

n- glukanlardir dizi geliştirme ve hiv antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

Ngeniş bir hızlı hazırlanması için son derece verimli bir şekilde tanıtacağız-bağlı yaygın insan glikoproteinlerin üzerinde bulunan (20.000 yapıları aşmayı tahmini) oligosakkaritler. İstenilen yapısal çeşitlilik ulaşmak için strateji oligosaccharyl florür modülleri, onların kademeli α-seçici glycosylations 3-Ey ve 6-Ey ardından üç tür kemoterapi enzimatik sentezi ile başladı. olarak konumlandırır bir çok önemli β-mannoside bağlantı sahip ortak çekirdek trisaccharide mannoz kalıntısı. Biz daha fazla kovalent karışık dizi analizi ile bir HIV antikor hetero-ligand etkileşim için oluşturmak için bir alüminyum oksit kaplı cam (ACG) slayt yüzeyine N- glukanlardir bağlı. Özellikle, N- glycan (SCT bağlama davranışı bir yeni izole HIV-1 geniş nötralize antikor (bNAb), PG9, yakından aralıklı adam5GlcNAc2 karışımı (adam5) ve 2,6-di-sialylated BI antennary kompleks yazın ) ACG dizi etkili immunogen tasarım HIV aşı geliştirme için rehberlik için yeni bir cadde açar. Buna ek olarak, bizim ACG dizi diğer HIV antikor hetero-ligand bağlayıcı davranış için eğitim için güçlü bir araç içerir.

N -glukanlardir geniş bir dizi sentezi için modüler bir kemoterapi enzimatik strateji şekil 1' de sunulmuştur. Çeşitlilik-ebilmek var olmak mahluk başında 3-Ey ve/veya 6-Ey α-özel mannosylation ardından üç önemli modüller kemoterapi enzimatik sentezi tarafından gerçeğine dayanarak stratejidir ortak mannoz kalıntısı konumunu N- glukanlardir trisaccharide çekirdek. İki, üç ve tetra antennary karmaþýk tür N- glycan ya...

N- glukanlardir bağlantı için bir alüminyum oksit kaplı cam sentezi için modüler bir yaklaşım olarak geliştirilen glycan Mikroarray ve geniş antikor nötralize bir HIV profil oluşturma için kullanımı gösterilmiştir (ACG slayt) kaydırın.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

Bu metodolojinin genel amacı, HIV antikorlarının heteroglikan bağlanmasını tespit etmek için alüminyum oksit kaplı bir cam slayt üzerinde yeni bir glikan mikro dizisi oluşturarak, N-glikanların sentezine yönelik modüler bir kemo-enzimatik yaklaşım geliştirmektir. Bu yöntemler, gelişmiş çalışmalar için hücre virüs spesifik glikanların tanımlanmasıyla ilgili glikobiyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, zayıf bağlanmayı tespit edebilmesi ve HIV hastasından alınan antikor gibi bir proteine bağlanan şeker karışımlarını tanımlayabilmesidir.Bu tekniğin etkileri, insan hava yolları epitel hücrelerinde siyalik katabolistlerin eksprese olması ve semptomlarla birlikte yaygın görülmesi nedeniyle influenza enfeksiyonlarının teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu nedenle, gliko-dizi wild alt tiplerinin spesifikliğini belirlemek için ideal bir araç olacaktır. Bu yöntem, HIV antikorlarının glikan spesifisitesi hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, yüzeye basılmış insan spesifik serum antigenlerine karşı insan serum antikorlarının bağlanma paternine dayalı olarak çeşitli kanserlerin teşhisi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış 2-5 micromoles glikanı beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir balona ekleyin. Balona manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve kauçuk bir septumla kapatın. Balona 400 microliters taze kurutulmuş DMF ve 10-25 micromoles fosfonik asit bağlayıcı ekleyin.Ardından, reaksiyon karışımını 800 rpm hızda beş saat boyunca karıştırın. Reaksiyon tamamlandığında, çözücüyü bir döner evaporatör kullanarak 5 ila 10 millibar vakum basıncı ve 40 °C sıcaklıkta uçurun. Bunun ardından, kurutulmuş reaksiyon karışımını 0,5 mL su ile çözün ve poliakrilamid jel yatağının üzerine yükleyin.Ürünleri su kullanarak elüye edin ve bir ila iki mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Toplanan fraksiyonları TLC ile kontrol etmek için, her fraksiyonu bir TLC plakasına damlatın ve plakayı 0.25 molar Seryum Amonyum Molibdat içine daldırın. Ürünü görselleştirmek için boyanan plakayı bir ısıtıcı tabla ile ısıtın.Ürünü içeren fraksiyonları birleştirdikten sonra, istenen ürünü beyaz bir toz olarak elde etmek için çözeltiyi biyodondurarak kurutun. Ardından, kurutulmuş ürünü iki mililitre su içerisinde çözün ve Palladyum Hidroksit ekleyin. Balona hidrojen içeren bir balon bağlayın ve reaksiyon karışımını hidrojen atmosferi altında 800 rpm hızında 15 saat boyunca karıştırın.Reaksiyon tamamlandığında, karışımı bir Celite Yatağından süzün ve iki mililitre metanol ve iki mililitre distile deiyonize su ile yıkayın. Ardından, çözücüyü 300 milibar vakum basıncı ve 40 °C sıcaklıkta bir döner evaporatör kullanarak uçurun. Bunun ardından, ham karışımı yaklaşık bir mililitre suda çözün ve bir poliakrilamid jel yatağının üzerine yükleyin.Ürünü su ile elüye edin ve bir ila iki mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Ürünü içeren fraksiyonları birleştirdikten ve çözeltiyi dondurduktan sonra, istenen ürünü beyaz bir toz şeklinde elde etmek için biyofolize edin. Ürün kuruduğunda, çözücü olarak Deuterium Oxide kullanarak enimar ve kütle spektroskopisi ile karakterize edin.Yüzey anodizasyonu için, sıcaklık kontrollü bir inkübatörü 4 °C'ye ayarlayın. Ardından, daha önce hazırlanmış 0.3 molar sulu oksalik asit çözeltisini, içinde manyetik karıştırma çubuğu bulunan 500 ml'lik bir behere aktarın. Katot olarak 10 cm uzunluğunda bir platin çubuğu çözeltinin içine yerleştirin.Anotlama işlemi boyunca oksalik asidi 300 rpm'de karıştırmaya devam edin. Laboratuvar izleyici yazılımında kurulum (setup) düğmesine tıklayın ve ardından Gerilim Tarama (Sweep Voltage) fonksiyon seçeneğine tıklayın. Başlangıç ve bitiş voltajını 25.8 volt olarak ayarlayın.Nokta sayısını 100, uyumluluğu (compliance) bir ve tarama gecikmesini 1200 milisaniye olarak ayarlayın. Ardından, tamam'a tıklayın. Alüminyum kaplı bir cam lamı katoda bakacak şekilde sabitleyin.Testi çalıştır düğmesine tıklayın ve mevcut ölçümü gözlemleyin. Yüzey anodizasyonundan sonra, lamı çift distile su ile iyice yıkayın ve nitrojen gazı ile kurutun. Lamı, daha sonra kullanılana kadar %30 bağıl nem odasında saklayın.Fabrikasyon için, tüm monovalent glikanların etanol glikol içerisinde 10 millimolar konsantrasyondaki 100 mikrolitre çözeltilerini hazırlayın. Glikan çözeltilerini, 100 mikromolar çözeltiler elde etmek için baskı tamponu ile seyreltin. Heteroligand Çalışması için, her bir glikan çözeltisinin beş mikrolitresine beş mikrolitre MAN-5 Glikanı ekleyin.Hazırlanan glikanları, mikroarray baskı aşaması için 384 kuyucuklu mikroplakaya aktarın. Mikroplakayı yazıcı dizin sistemine yerleştirdikten sonra, her bir alüminyum kaplı cam lam üzerine 0,6 nanolitre glikan çözeltisi çöktürerek robotik pinlerle mikroarray baskısını gerçekleştirin. Ardından, 3%BSA içeren PTSB tamponu içinde 70 mikrolitre primer antikor PG-9 hazırlayın.Ardından, karanlık ortamda 120 µL sekonder floresan işaretli antikor Donkey ve Anti-human Immunoglobulin G ile %3 BSA içeren PBST tamponu hazırlayın. PG9 ile sekonder floresan işaretli antikoru 1:1 oranında karıştırın. Daha sonra, önceden karıştırılmış antikorları dört derece Celsius'da 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, 16 kuyucuğa bölünmüş olan lam inkübasyon odasına alüminyum kaplı bir cam lam yerleştirin. Önceden karıştırılmış antikorların 100 µL'sini glikan dizisine aktarın. 4 °C'de 16 saat inkübe ettikten sonra, önceden karıştırılmış antikorları bir pipet yardımıyla glikan dizisinden uzaklaştırın ve ardından lam inkübasyon odasını çıkarın.Cam lamı PBST tamponu ve deiyonize su ile yıkayın. Ardından cam lamı 2000 ×g hızda santrifüj ederek kurutun. Sonrasında, mikroarray görüntü analiz yazılımını açın.Cam kurutulmuş lamı, dizili özellikler aşağı bakacak şekilde dizi tarayıcısına yerleştirin. Ayarlar menüsüne tıklayın. Görüntü çözünürlüğünü piksel başına beş mikrometre olarak ayarlayın.Dalga boyunu 635 nanometreye, PMT'yi 450'ye ve gücü %100'e ayarlayın. Lamın görüntülemesine başlamak için tarama düğmesine tıklayın. Son olarak, tarama görüntüsünü görüntü analizi için TIF formatında kaydetmek üzere dosya simgesine tıklayın. Bu çalışmada, modüler kemo-enzimatik bir strateji kullanılarak geniş bir N-Glikan yelpazesi sentezlenmiştir.Stratejinin etkinliğini göstermek amacıyla, kemoenzimatik yöntemlerle biantenli izometrik bir yapı sentezlenmiştir. Disakkarit 1'in enzimatik galaktozilasyonu ve ardından trisakkarit 2'nin fukozilasyonu, hedeflenen tetrasakkarit 3'ü sağlamıştır. Yapı taşı iki ve üçün perasetilasyonu ve indirgen uç modifikasyonları, hedeflenen molekül dört ve beşi sağlamıştır.Trisakkarit altının dördüncü modülünün stereoselektif üçlü O-glikozilasyonu heksasakkarit yediyi sağlamıştır. Koruyucu grupların uzaklaştırılması ve beşinci modül ile reaksiyon dekasakkarit dokuzu oluşturmuştur. Global koruyucu grup uzaklaştırılması, NMR ve kütle spektroskopi ile karakterize edilen glikan 10'u vermiştir.Reducing ucunda Pentilamin kuyruğu içeren glikanlar, fosfonik asit bağlayıcılarla modifiye edildi ve fosfinid kimyası aracılığıyla alüminyum cam kaplı yüzeye tutturuldu. Geniş etkili nötralize edici HIV-1 antikoru PG9, HIV1 PG120 yüzeyinin V1/V2 döngüsündeki komşu heteroglikanlarla etkileşimini ilk kez göstermek amacıyla homo ve heteroglikan dizileri kullanılarak glikan özgüllüğü açısından tarandı. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülmesi durumunda glikan immobilizasyonundan beta analizine kadar tüm süreç 24 saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, Glycan 10 için taze anodize alüminyum kaplı cam lam kullanılması gerektiği unutulmamalıdır. Bu prosedürün uygulanması için med teknisyeni lamları kullanılır. İlgilenilen karbonhidrat ve protein arasındaki bağlanma etkileşimlerini nicelleştirmek amacıyla gövde sabitinin belirlenmesi işlemi gerçekleştirilebilir.Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların Kenya'daki bulaşıcı hastalıklarda karbonhidratın rolünü daha iyi anlamalarının yolunu açmış ve hastalıklara karşı yeni tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmuştur. Toksik ajanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve deneyler gerçekleştirilirken koruyucu kıyafet, gözlük ve maske kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

chemo-enzymatic-synthesis-n-glycans-for-array-development-hiv

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Nanomole afinite ile HIV 1BA-L gp120 karşı çeşitli 2'-Fluoro RNA aptamers bir RNA kütüphanesi ile izole edilmiştir.

Hücre tipi siRNA teslimat için özel anti-HIV gp120 aptamers Geliştirme

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bu video, fare serumunda dolaşımdaki anti-glikan antikorlarını analiz etmek için basılı glikan dizisi teknolojisini göstermektedir. Serumdaki antikorlar, çip üzerindeki spesifik glikanlarla etkileşime girer ve bu, immün boyama ve ardından floresan taraması ile doğrulanır.

Basılı Glikan Dizisi ile Dolaşımdaki Anti-Glikan Antikorlarının Saptanması

Viral yüzey antijenleri konformasyonlarını anlamak, antikor nötralizasyonunu değerlendirmek ve etkili aşı immünojenlerinin tasarımına rehberlik etmek için gereklidir. Burada, spesifik anti-Env antikorları tarafından transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen trimerik HIV-1 Env'nin tanınmasının çalışmasına izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

Basılı bir glikan mikrodizi stratejisi kullanılarak, influenza A virüsü hemaglutinin aviditesi ve sialik asit içeren reseptörler için özgüllüğünün analizi için geleneksel bir 96 oyuklu plaka testi minyatürleştirildi.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

İnsan serasındaki anti-Neu5Gc antikorlarını değerlendirmek için bir siyaloglikan mikroarray testi kullanılabilir, böylece kanser ve diğer kronik enflamasyon aracılı insan hastalıkları için yüksek verimli bir tanı testi haline getirilir.

Anti-Neu5Gc IgG&#39;yi İnsan Sera&#39;sında Sialoglikan Mikroarray Testi ile Görüntüleme

Bu eser basılı glycan dizi (PGA) teknoloji küçük hayvanlarda Anti-karbonhidrat antikorlar dolaşan analiz için potansiyelini gösterir.

Basılı Glycan dizi: Anti-karbonhidrat antikorlar küçük hayvanlarda dolaşan repertuar analizi için hassas tekniği

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Bir antikorun glikozilasyon paterni klinik performansını belirler, bu nedenle glikozilasyonu kontrol etmek için endüstriyel ve akademik çabalar devam eder. Tipik glikomühendislik kampanyaları zaman ve emek yoğun olduğundan, geçici susturma kullanarak glikozilasyon genlerinin etkisini karakterize etmek için hızlı bir protokolün oluşturulması yararlı olacaktır.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Mikroarray polimer profilleme (MAPP), biyolojik numunelerdeki glikanların bileşimsel analizi için yüksek verimli bir tekniktir.

Yüksek Verimli Glikan Analizi için Mikroarray Polimer Profilleme (MAPP)

Keşfedin N-glukan sentezi ve HIV antikor profilleme yöntemini glikan mikrodizileri kullanarak. Bu teknik zayıf bağlanma etkileşimlerini tespit ederek glikobiyoloji ve tanı alanında yeni olanaklar sunar.

N- glukanlardir dizi geliştirme ve HIV antikor için kemoterapi enzimatik sentezi profil oluşturma

Daha fazla video keşfet