Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli deneylerde kullanılabilecek omurilik nöronlarını tekrar tekrar ve tutarlı bir şekilde izole edebilmektir. Bu yöntem, omurilik nöronlarının biyolojisi hakkında daha iyi bilgi edinmemizi ve çeşitli stres faktörlerine tepkilerini anlamamızı sağlayabilir. Bu tekniğin temel avantajı, önemli sayıda nöronun izolasyonuna izin vermesi ve bu nöronların çok çeşitli deneylerde kullanılmasına izin vermesidir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü nöronların dokudan mekanik olarak izole edildiği tritürasyon aşaması, onları öldürmeden sağlıklı nöron izolasyonunu sağlamak için ustalaşmak için biraz zaman gerektirir. Bu işleme başlamak için, makas kullanarak ötenazi uygulanmış fare yavrularının kafasını vücudundan ayırın. Daha sonra, kuyruğu ve kolları, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde prosedür masasında sabitleyin.

Ardından, kavisli iris makasını kullanarak cildi kesin. Bundan sonra, omuriliği bel bölgesinden, kalçaların hemen üstünden kesin ve ardından göğüs kafesinin her iki tarafını da vücuttan ayırmak için kesin. Fazla dokuyu çıkarmak için numuneleri, her biri 10 saniye boyunca beş mililitre sterilize edilmiş PBS içeren üç adet 10 santimetre petri kabında sırayla yıkayın.

Daha sonra, omurganın kaudal ucuna beş mililitre sterilize edilmiş PBS ile doldurulmuş 22 gauge bir iğne ve şırınga yerleştirin ve kranial olarak yıkayın, böylece kordonun dördüncü bir petri kabına çıkmasına izin verin. Omuriliği 15 mililitrelik bir tüpe beş mililitre HABG ile buz üzerine aktarın. Omuriliği ezmekten kaçının ve diğer yavrular için prosedürleri tekrarlayın.

İdeal olarak, nöron izolasyonunu sağlamak için bu işlem bir grup yavru için 30 dakikadan fazla sürmemelidir. Yoğunluk gradyanını hazırlamak için, dört katmanın her birini dört adet 15 mililitrelik tüpte hazırlayın. Ardından, her katmandan bir mililitreyi 15 mililitrelik yeni bir tüpe ekleyin.

En alttaki birinci katmanla başlayın ve en üstteki dördüncü katmana ulaşana kadar sırayla ekleyin. Eklerken katmanları rahatsız etmekten ve karıştırmaya neden olabilecek kuvvetli hareketlerden kaçının. Daha sonra, sindirim ortamını kıyılmış dokuya ekleyin.

Numuneyi 30 santigrat derecede su banyosunda bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra, dokuyu su banyosundan çıkarın ve birkaç dakika oturmasına izin verin. Öğütme işlemini gerçekleştirmek için fazla sindirim ortamını aspire edin.

Dokuyu dar delikli bir pipet kullanarak iki mililitre HABG içinde askıya alın, 45 saniyede 10 kez ezin ve canlı verimi önemli ölçüde azaltacağı için hava vermekten kaçının. Öğütme, prosedürün en kritik adımlarından biridir, doku, ateşle parlatılmış pipetin içine dikkatlice çekilmeli ve boşaltılmalıdır, bu da nöronal ölüme yol açabilecek aşırı canlılıktan veya çok yumuşak olmaktan kaçınmalıdır, bu da düşük bir verimle sonuçlanır. Bunu takiben, süpernatantın üst iki mililitresini aspire edin ve koleksiyon etiketli yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Altı mililitre süpernatan elde etmek için toplama prosedürlerini iki kez daha tekrarlayın. Ardından, toplama tüpü içeriğini daha önce hazırlanmış olan gradyan tüpüne yavaşça aktarın. Gradyanın bozulmasını önlemek.

Nöronları saflaştırmak için, gradyan tüpünü 22 santigrat derecede 800 kez G'de 15 dakika santrifüjleyin. İstenilen katmanları toplayın ve bunları 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. En yüksek saflıkta nöron izolasyonu için üçüncü katmanı toplayın.

Daha az saflıkta daha fazla verim için, iki ila üç katmanları toplayın. Daha sonra, yeni toplanan katmanlara beş mililitre HABG ekleyerek yoğunluk gradyanını seyreltin. 22 santigrat derecede iki dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin.

İki dakika sonra, süpernatanı atın ve damağı hafifçe vurarak hücreleri beş mililitre HABG'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, numuneyi tekrar 22 santigrat derecede iki dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı atın ve damağı hafifçe vurarak hücreleri üç mililitre nörobazal ortamda yeniden askıya alın.

Bundan sonra, bir hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin ve ardından süspansiyonu bir mililitre nörobazal ortam başına 300.000 hücreye seyreltin. Hücreleri ve çözeltiyi dağıtmak için hafifçe çalkalayın ve kodlanmış 24 oyuklu plakalardaki her bir oyuğa bir mililitre numune ekleyin. Burada gösterilen, nöronların kuyulara tohumlandıktan sonra kültürdeki zaman seyridir.

Hücreler tipik olarak ilk birkaç saat içinde yüzeye yapışmaya başlar. Aksonlar ilk 24 ila 48 saat içinde filizlenmeye başlar, çeşitli nöronlar ve kültür arasındaki bağlantılar tipik olarak yedi günde olgunluğa ulaşır, bu noktada tipik olarak nöronlar üzerinde deneyler yapılır. Bu şekilde, nükleer boyama mavi renkte, sitoplazmik boyama yeşil renkte gösterilmiştir ve burada, nöron siktoskeletal protein mikrotübüler ilişkili protein iki boyanmıştır, bu da kültürde bir hafta sonra nöronların ana hatlarını ve aksonal projeksiyonlarını göstermektedir.

Birleştirme görüntüleri, nöronların göreceli bolluğunu gösterecek şekilde birleştirilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa üç ila dört saat içinde yapılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, omurilik fizyolojisi ve patolojisini inceleyen araştırmacıların, normal koşullar altında ve oksijen ve glikoz yoksunluğu gibi farmakolojik ajanlar veya stres faktörlerine yanıt olarak omurilik nöronlarının davranışlarını keşfetmelerinin yolunu açıyor.

Bu prosedürü uygularken, sağlıksız nöronların izolasyonunu önlemek için adımlardan herhangi birini geciktirmekten veya uzatmaktan kaçınmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, serumsuz ortamda kültürlenebilen yenidoğan farelerin omuriliklerinden sağlıklı ve canlı nöronların nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.