Name: Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Öğrenin, yenidoğan farelerden spinal kord nöronlarını mekanik ve enzimatik yöntemlerle izole etme tekniğini. Bu yöntem, nöron biyolojisi ve stres yanıtları üzerine çeşitli deneyler için sağlıklı hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların onayları yok.

Bu prosedürdeki hayvanlara bakım ve tedavi, Colorado Üniversitesi&#39;ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi&#39;nin kurallarına uygun olarak yürütülmüştür. 1. Çözüm Hazırlama <ol><li> Tüm çözeltileri, Tablo 1&#39;de gösterildiği gibi uygun sıcaklıklarda hazırlayın ve saklayın. </li></ol> 2. Kaplama Kuyuları ve Slaytlar NOT: Nöronlar plastik veya cam yüzeylere iyi yapışmamaktadır. <ol><li> Nöronların izolasyonundan bir gün önce steril 24-çukurlu bir kültür plakasının kuyularını 0.5 mL Poly-D-Lysine (PDL, Tablo 2 ) ile kaplayın ve O / N&#39;lik bir laminer akış kapağında bırakın. NOT: Tercih edilen yöntem, 24 delikli plakalar kullanmak ve yalnızca çevre kuyularını kaplamaktır, zira periferik kuyulardan buharlaşma daha hızlanmaya ve tutarsız sonuçlara neden olma eğilimindedir. Ek olarak, cam slaytlar kuyulardan önce yerleştirilebilirO kaplama. Nöronlar kaplanmış cam slaytlara tutturulacak ve daha ileri mikroskobik görüntüleme için daha sonra çıkarılabilecektir . </li><li> İzolasyon gününde PDL&#39;yi kuyulardan çıkarın. Kalan suyu çıkarmadan ve 1 saat boyunca kurumaya bırakmadan önce steril suyla birkaç dakika yıkayın (aşağıya bakınız). </li><li> Kurumadan sonra, slaytları laminin ile kaplayın ( Tablo 2 ). NOT: Yaklaşık olarak 10 μL laminin (10 μg / μL) steril 24 gözlü plakanın her bir kuyusunun kaplanması için yeterlidir. Bu, 340 ul&#39;lik ortamla (toplam hacim: 350 | iL) karıştırılır ve böylece tüm kuyu kaplanır. Bir kültür kaputunda oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve daha sonra hücreleri kaplamadan önce aspire edin. </li></ol> 3. Omurga Kordonlarının Hasat Edilmesi NOT: Bütün cihazlar sterilizasyon için otoklavda (135 ° C ve 30 psi 4 x 7 dakika çevrim) yapılmalıdır. <ol><li> 1-3 yaşındaki C57BL / 6 fare yavrularını isofluran içeren bir odasında euthanize edin. BekleyinHareketsizlikten 30 saniye sonra ve yanıt eksikliğini teyit etmek için bacağınızı sıkıştırın. </li><li> Başı makas kullanarak vücudundan ayırın, yavru eğilimli konumdadır. </li><li> Arka bacakları veya kuyruk ve kolları dorsal yüzü kullanıcıya bakacak şekilde prosedür masasında sabitleyin. </li><li> Kıvrımlı iris makası kullanarak cildi kesin. </li><li> Omurganın kalçanın hemen üstündeki omurilik bölgesinden kesin ve vücudunuzdan ayırmak için göğüs kafesinin her iki tarafını kesmeye devam edin. NOT: Bu, organların istem dışı hasar görmesini önlemek için omuriliğin visseral organlardan dikkatli bir şekilde parçalanmasını gerektirir ( Şekil 1a ). </li><li> Fazla doku kaldırmak için 5 mL 0.2 μm filtre sterilize Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içeren 3 x 10 cm Petri kaplarında 10 s boyunca sırayla yıkayın. </li><li> Spinal kolonun kaudal ucuna 5 mL&#39;lik filtre ile sterilize edilmiş PBS ile dolu 22 G&#39;lik bir iğne ve şırınga yerleştirin ve kranial olarak yıkayın, böylece kordonunO dördüncü bir Petri kabına çıkın ( Şekil 1b ). </li><li> Buz üzerinde 5 mL HABG ( Tablo 1 ) ile 15 mL tüp içinde omurilik toplamak. Omurganın ezilmesini önlemek için dikkatli olun. </li><li> Çöp kutusundaki her yavru için 3.1-3.8 arasındaki adımları tekrarlayın. NOT: İdeal olarak, sağlıklı nöron izolasyonu sağlamak için bu işlem omurilikte 30 dakikadan az sürmelidir. </li></ol> 4. İzole Edici Nöronlar NOT: Aşağıdaki adım laminer bir akış davlumbazında yapılmalıdır. Temel steril teknik hakkında bilgi sahibi olması beklenir. <ol><li> Doku Mincing <ol><li> Omurilik kordonlarını içeren tüpü alın ve dokuyu askıya almak için hafifçe sallayın. </li><li> Tüpteki dokuları 60 mm&#39;lik bir cam Petri kabına dökün ve ~ 0.5 mm boyutlarında ince parçalar oluşturmak için tıraş bıçağı ile zar atın. </li><li> 5 mL HABG içeren 15 mL&#39;lik bir tüp içine geniş çaplı bir pipetle dokuyu aktarın. </li><li> Koyun birHücrelerin bu sıcaklıkta dengelenmesine izin vermek için 30 ° C su banyosu. Hücreleri, sıvı içinde asılı kalmalarını sağlayacak kadar çalkalayıcıda tutun. NOT: Bu adım, buzun sindirim ortamına aktarılması üzerine hücrelerin şok edilmesini önlemek için yapılır. Hücreleri 30 ° C&#39;de tutmak, 37 ° C&#39;de aksi halde artmış bir metabolizma ile ilişkili hücre ölümünü azaltmaya yardımcı olur. </li></ol></li><li> Sindirim ortamını hazırlayın ( Tablo 1 ). </li><li> Yoğunluk gradyanını hazırlayın (Tablo 1). <ol><li> Tablo 1&#39;de özetlendiği gibi, 4 tabakanın her birini 4 ayrı 15 mL&#39;lik tüp içinde hazırlayın. </li><li> Her katmandan yeni bir 15 mL tüp içine 1 mL ekleyin. Alt katman 1 ile başlayın ve üst katman 4&#39;e ulaşana kadar ard arda ekleyin. Eklerken katmanları rahatsız etmeyin. </li></ol></li><li> Adım 2.2 PDL kaplı plakaları yıkayın. Kalan suyunu çıkarmadan önce steril su ile birkaç dakika yıkayın ve1 saat kurumalarını bekleyin. </li><li> Sindirim ortamına doku aktarın. <ol><li> 30 ° C&#39;de çalkalayıcı su banyosundan doku içeren tüpü çıkartın ve birkaç dakika yerleşmesine izin verin. </li><li> Sindirim ortamı tüpünü 37 ° C su banyosundan çıkarıp bir leur-lock şırınga içine aspire edin. </li><li> Fazla HABG&#39;yi doku içeren tüpün içinden aspire edin. </li><li> Doku içeren tüp içine sindirim ortamı eklemek için şırınga üzerine 0.2 um&#39;lik bir filtre kullanın. </li><li> Tüp, 30 ° C&#39;lik bir su banyosuna 30 dakika boyunca yerleştirilir. Hücreleri, sıvı içinde asılı kalmalarını sağlamak için yeterince çalkalamayın. NOT: Sindirim ortamındaki hücreleri çok uzun süre tutmamak veya sıcaklığın aşırı yükselmesine izin vermek, aşırı sindirime neden olabilmek ve dokunun jelatinimsi bir karışımda süspanse edilmesine neden olmak önemlidir. </li></ol></li><li> Bu süre zarfında, adım 2.3&#39;deki gibi lamininini kaplayın. </li> &lt;Li&gt; Öğütme yapın ( örn . Hücreleri dokudan ayırma). <ol><li> Tüpü çalkalayan 30 ° C su banyosundan çıkarıp birkaç dakika yerleşmesine izin verin. </li><li> Aşırı sindirim ortamını aspire. </li><li> 2 mL HABG&#39;de dokuyu askıya alınız. </li><li> Dar gözlü bir pipet kullanarak, 45 s boyunca 10x öğüt. NOT: Bu muhtemelen en önemli tek adımdır ve düzgün yapılmazsa verimi önemli ölçüde düşürebilir. <ol><li> Doku pipet içine aspire ve içeriğini hemen boşaltın. </li><li> Havayı sunmaktan kaçının; çünkü canlı verimi önemli ölçüde düşürecektir. NOT: İdeal pipet 9 inçlik bir cam pipettir Pipetin ucu pürüzlü yüzeyleri düzeltmek için ateşle cilalanmalıdır Daha sonra 1: 20 kloroformda diklorodimetilsilan (DMDCS) solüsyonu içine yerleştirilerek silikon hale getirilmeli ve kloroformda / N Sonra pipet çıkarılmalı ve hava kurumasına bırakılmalıdır.Sterilizasyon için otoklav yapılmalıdır. Dikkat: DMDCS ve kloroform oldukça yanıcıdır ve silikonlama bir duman davlumbazında yapılmalıdır. </li></ol></li><li> Süpernatanın üst 2 mL&#39;sini aspire edin ve &quot;koleksiyon&quot; etiketli yeni bir 15 mL tüp içine yerleştirin. </li><li> 4.7.3-4.7.5 adımlarını iki kez tekrarlayın (hücre toplama tüpünün sonunda 6 mL olmalıdır). </li><li> Gradyan bozulmasından kaçınarak, toplama tüpünün içeriğini adım 4.2&#39;de hazırlanan gradyan tüpüne yavaşça aktarın. </li></ol></li><li> Bu noktada, buzdolabından önceden hazırlanmış nörobazal ortamı ( Tablo 1 ) çıkarın ve 37 ° C&#39;lik bir banyoda ısıtmasına izin verin. </li><li> Nöronları arındırın. <ol><li> Degrade tüpü, 800 xg ve 22 ° C&#39;de 15 dakika santrifüjleyin. </li><li> İstenen tabakayı bir pipetle toplayın ( Şekil 2 ) ve yeni bir 15 mL&#39;lik tüp içine yerleştirin. En saflıklı nöro içinN izolasyonu ( yani &gt;% 90), katman 3 toplamak. Daha az saflık ( yani &gt;% 70-80) olan daha fazla verim için katmanları 2 ve 3 toplamak. </li><li> Yeni toplanan tabakalara 5 mL HABG ekleyerek yoğunluk gradyanını inceltin. </li><li> 22 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 200 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın, 5 mL HABG&#39;de tekrar süspanse edin ve hücreleri askıya almak için pelletini oynatın. </li><li> 22 ° C&#39;de 2 dakika 200 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı atın, 3 mL nörobazal ortamda tekrar süspansiyon haline getirin ve hücreleri tekrar süspansiyon haline getirmek için pelletini oynatın. </li></ol></li><li> Hücreleri sayın. <ol><li> Şimdi nörobazal ortamda hücrelerle 10 mcL solüsyon alın ve 10 mcL Tripan mavisi ile karıştırın. </li><li> Bu karışımın 10 mcL&#39;sini cam sayım odacığına yerleştirin. </li><li> Standart bir cam sayım odası kullanarak, dört dörtlü kadranın her birindeki hücre sayısını hesaplayın. Sayılan tüm hücreleri ekleyin (n), çoklu(Seyreltme faktörü) çarpın, 4&#39;e bölün (sayılan kadrandaki sayı), 3 ile çarpın (hücre hacmi / mL cinsinden hücre konsantrasyonu elde etmek için 104 ile çarpın. <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55856/55856eq0.jpg" /></li></ol></li><li> Kültür plakalarının üzerindeki hücreleri tohumluyor <ol><li> Hücre süspansiyonunu 1 mL nörobazal ortamda 300.000 hücreye seyreltin. NOT: Yukarıdaki adımlarda elde edilen hücrelerin konsantrasyonuna dayanarak, nihai konsantrasyon 3 x 105 hücre / mL elde etmek için ilave nörobazal ortam ilave edilir. Denklem C 1 V 1 = C 2 V 2 , burada C 1 hasattan elde edilen hücrelerin başlangıç ​​konsantrasyonudur; V 1 , 3 mL; Ve C2 yukarıda tarif edildiği gibi 3 x 105 hücre / mL&#39;dir. Denklem V2 için çözülmüştür. Çözeltideki toplam hücre hacminin eşit olması için gerekli nevrobazal hacim birimini ekleyinV 2 . </li><li> Hücrelerin çözeltiye dağıtılması için hafifçe çalkalayın ve kaplanmış 24 delikli tabakların her kuyucuğuna 1 mL ekleyin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Qayumi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+investigation+of+spinal+cord+injury+caused+by+aortic+cross-clamping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping.</a> J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).</li>
<li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li>
<li>Taira, Y., Marsala, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+proximal+arterial+perfusion+pressure+on+function%2C+spinal+cord+blood+flow%2C+and+histopathologic+changes+after+increasing+intervals+of+aortic+occlusion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat.</a> Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+the+simultaneous+preparation+of+primary+neuronal+cultures+of+the+neocortex%2C+hippocampus+and+cerebellum+from+individual+newborn+%28P0.+5%29+C57Bl%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice.</a> J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).</li>
<li>Graber, D. J., Harris, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+culture+of+spinal+motor+neurons+from+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).</li>
<li>Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+motor+neurons+from+the+newborn+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Prot%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord.</a> Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).</li>
<li>Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocols+for+isolation+of+primary+motor+neurons%2C+astrocytes+and+microglia+from+embryonic+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
<li>Fang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+preconditioning+protects+against+spinal+cord+ischemia-reperfusion+injury+in+rabbits+by+attenuating+blood+spinal+cord+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption.</a> Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).</li>
<li>Su, M., Zhong, W., Ren, S. <a target="_blank" href="https://www.ajol.info/index.php/tjpr/article/view/139098">Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats.</a> Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).</li>
<li>Haapanen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+ischemic+preconditioning+protects+the+spinal+cord+against+ischemic+insult%3A+An+experimental+study+in+a+porcine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).</li>
<li>Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+complications+after+thoracic+aortic+surgery%3A+long-term+survival+and+functional+status+varies+with+deficit+severity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity.</a> J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Wong, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+spinal+cord+deficits+after+thoracoabdominal+aortic+aneurysm+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair.</a> Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).</li>
<li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-2+agonist+attenuates+ischemic+injury+in+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons.</a> J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).</li>
<li>Freeman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+protection+via+alpha-2+agonist-mediated+increase+in+glial+cell-line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklamaları yok.

Bu teknik, omurilik nöronlarının güvenilir bir şekilde kültürlenmesine izin verir. Teknik yeterlilik elde edildiğinde, tamamlanması yaklaşık 3,5 saat sürer. Nöronların izolasyonunu, yaklaşık 4 saat içinde 2 ayrı çöpten (toplam 16 fare) gerçekleştirebildik. Fizibilitedeki ana adım, omurilik kablolarını farelerden ayıklamaktır. Verim, çeşitli kuyucukların kaplanmasına ve çeşitli koşullar altında nöronların test edilmesine imkan verir. Olgunlaşma sonrasındaki nöronları tedavi edebildik ve Western leke analizi ile protein e...

<html> Spinal kord patolojisini anlamak, makroskopik ve mikroskobik seviyelerde çeşitli modellerin kullanılmasını gerektirir. Büyük ve küçük hayvan modelleri 1 , 2 , 3 spinal kord hastalığının ve yaralanmasının in vivo araştırmalarında kullanılır. Bu sorunların in vivo incelenmesi esastır ancak omurilik analizi, tüm omurilik homojenatı veya doku kesitleri 4 ile sınırlıdır. Bu, var olan nöronlar ve çevresindeki glialar arasında omurilikteki spesifik tepkileri ve hedefleri ayırmaya çalışırken bazı belirsizlik yaratır. Genetik olarak manipüle edilmiş farelerin artan miktarda bulunması, biyolojinin hücresel ve moleküler seviyelerde daha ayrıntılı araştırılmasına olanak tanır. Böylece, in vitro omurilik nöronlarının benzersiz özelliklerini ve biyolojisini incelemek için, burada neonatal bir fare modeli kullanılır. In vitro olarak nöronların izolasyonu ve bakımı özellikle net değildir Yetişkin kemirgenlerin korteks dokusundan nöron tecrit teknikleriyle nispeten bol miktarda izole nöron ( yani milyonlarca) elde edilmesi beklenir , 6 , 7. Bunun aksine, omurilik dokusundan alınan nöronların verimi, daha az doku kütlesi nedeniyle kısmen 8 , 9 , 10&#39;dur . Ayrıca, farelerde, yenidoğanın izolasyonu için teknikler göreceli olarak az sayıdadır Omurilik nöronları ve mevcut yöntemler, daha düşük nöron verimleri (yüzlerce) veya embriyonik farelerin izolasyonunu gerektiren zahmetli ve ağır kaynaklı tekniklerle sınırlıdır 10 . Bu protokolde,Yenidoğan farelerinin spinal kordlarından önemli miktarda nöronun maliyet ve kaynak etkili bir şekilde izole edilmesini sağlayan bir teknik kullanın. Daha önce yayınlanan tekniklerde yaygın olarak görüldüğü gibi papain enzimatik bir proteaz olarak kullanılmaktadır ve 5 , 6 omurilik dokusundan nöronların salınmasına izin vermektedir. Ek olarak, rafine edilmiş hücre ayrıştırması için daha önce etkili olduğu 6,10 olduğu gösterilen yoğunluk derecesini kullanıyoruz. Hücrelerin inkübe edildiği ortam tecrübemiz ve daha önce yayınlanan 11&#39;de farklılık gösterse de, taze B27 kültürü takviyesi takviyesi, nöron ömrü için kritik olduğu kanıtlanmıştır. Nöronlar, tipik olarak, tedavinin yapılmasına olanak tanıyan 10 gün boyunca uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Hazırda Bekletme A Orta - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A1247501</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501</td></tr><tr><td>Hazırda Bekletme A Eksi Kalsiyum - 500 mL</td><td>Beyin Bitleri</td><td>HA-Ca</td><td>http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/</td></tr> <tr><td>Glutamax 100X - 100 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>35050061</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079</td></tr><tr><td>B27 Takviyesi 50X - 10 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>17504044</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044</td></tr><tr><td>Papain, Liyofilize - 100 mg</td><td>Worthington</td><td>LS003119</td><td>http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html</td></tr><tr><td>Neurobazal A Orta - 500 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10888022</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin (PDL) hidrobromür - 5 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Fare Laminin - 1 mg</td><td>Thermo-Fisher</td><td>23017015</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi - 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı - 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Diklorodimetilsilan ( DMDCS, Sigma Silikoat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440272-100ML</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306-1L</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Cam Pippette - 9"</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-678-20C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Pipet ampulü - 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z186678-3EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&region=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1</td></tr><tr><td>MARKA&reg; &nbsp; Petri kabı, cam - 60 x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455717-10EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Steril 24 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8812-100EA</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Hausser Hemacytometer (cam sayma odası)</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-671-6</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716</td></tr><tr><td>Cam Slaytlar - 12 mm steril kapaklı cam - kaplamasız</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-1.5-Pre</td><td>http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm</td></tr><tr><td>NeuN Tavşan Monoklonal Antikoru - 100 & mikro; L</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>Paraformaldehit (PFA) içinde fiksasyon ve %5 BSA ile bloke edildikten sonra, 12 mm'lik bir lamel üzerindeki hücreler, 4 ° C'de 18 saat boyunca 1:200 oranında seyreltilmiş antikor içinde inkübe edildi; C</td></tr><tr><td>MAP-2 Fare Monoklonal Antikoru - 50 & mikro; L</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td>Paraformaldehit içinde fiksasyon ve %5 BSA ile bloke edildikten sonra, 12 mm'lik bir lamel üzerindeki hücreler, 4 ° C'de 18 saat boyunca 1:500 oranında seyreltilmiş antikor içinde inkübe edildi; Ç</td></tr></tbody></table>

yenidoğan faresinden İzole edilen spinal kord nöronları İzolasyonu ve kültürü

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal kord nöronlarının izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunmaktayız. Nöronlar yenidoğan C57BL / 6 farelerinden elde edilir ve 1-3 doğum sonrası izole edilir. Bir fare çöpü, genellikle bir üreme çiftinden doğan 4-10 yavru, bir deney için toplanır ve izofluran ile ötenazi yapıldıktan sonra omurilik kordları her fareden ayrı ayrı toplanır. Spinal kol disseke edilir ve omurilik o kolondan salınır. Omurga kordonları nöronların ve diğer hücrelerin dokudan salınmasına izin veren bir enzimatik proteaz için teslimat yüzey alanını arttırmak üzere kıyılır. Tritürasyon daha sonra hücreleri çözeltiye boşaltmak için kullanılır. Bu çözelti, daha sonra, nöronların izole edilmesine olanak tanıyan, çözeltideki çeşitli hücreleri ayırmak için bir yoğunluk derecesinde fraksiyon haline getirilir. Bir çöp grubundan yaklaşık 1-2.5 x 106 nöron izole edilebilir. Nöronlar daha sonra yapışkanlı fiillerle kaplanmış oyukların üzerine serilirUygun gelişme ve olgunlaşma için izin verilen rs. Nöronlar büyüme ve kültür ortamında olgunluğa erişmek için yaklaşık 7 gün alır ve bundan sonra tedavi ve analiz için kullanılabilir.

Bu tekniği kullanarak, tek bir çöp (4-10 yavru), kültür plakalarına eklenmeye uygun 1-2.5-106 nöronların izolasyonuna olanak tanır. Tipik olarak, 4-8 oyuk yukarıda belirtilen konsantrasyonda tohumlanır ( yani 300.000 hücre / mL). Şekil 3 , düşük ( a ) ve yüksek ( b ) büyütme ışık mikroskopisinde kültürde bir hafta sonra nöronların bu konsantrasyonda görünüşünü göstermektedir. Bununla birlikte, aynı zamanda 500,000 h...

Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Bu prosedürün genel amacı, çeşitli deneylerde kullanılabilecek spinal kord nöronlarının tekrarlanabilir ve tutarlı bir şekilde izole edilebilmesini sağlamaktır. Bu yöntem, spinal kord nöronlarının biyolojisine dair daha iyi içgörüler elde etmemize ve umuyoruz ki çeşitli stresörlere verdikleri yanıtları anlamamıza olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, önemli sayıda nöronun izole edilmesini sağlayarak bu nöronların çok çeşitli deneylerde kullanılmasına imkan vermesidir.Nöronların ölmeden, sağlıklı bir şekilde izole edilmesini sağlamak için nöronların dokudan mekanik olarak ayrıldığı tritürasyon aşığının ustalık gerektirmesi nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Bu prosedüre başlamak için, ötanazi uygulanmış fare yavrularının başını makas kullanarak gövdesinden ayırın. Ardından, kuyruğu ve kolları, sırt kısmı yukarı bakacak şekilde prosedür masasına sabitleyin.Ardından, kavisli iris makası kullanarak deriyi kesin. Bundan sonra, kalçaların hemen üzerindeki lomber bölgeden omuriliği kesin ve ardından göğüs kafesinin her iki yanını keserek gövdeden ayırın. Fazla dokuları uzaklaştırmak için örnekleri, her biri beş mililitre sterilize PBS içeren üç

spinal-cord-neurons-isolation-and-culture-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Elektrofizyolojik çalışmalar için yenidoğan fare omurilik izolasyonu bir gösteri.

Omurilik Elektrofizyoloji

Omurilik fare embriyonik motor nöronlar izole alternatif bir yol tarif edilir. Bu yöntem, lektin düşük afinite sinir büyüme faktörü reseptör p75NTR bağlamak için aslında dikkate alır. Bu lektin tabanlı preplating p75NTR karşı spesifik antikor ile benzer bir arınma sağlar.

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Bu videoda, in vitro çalışmalar için yenidoğan bir fareden omurilik nöronlarını izole etmek için adım adım bir protokolü açıklıyoruz.

Omurilik Nöron İzolasyonu: İn Vitro Çalışmalar için Yenidoğan Omurilik Nöronlarını İzole Etmek İçin Bir Yoğunluk Gradyan Prosedürü

Video, transgenik bir fare embriyosundan okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların izolasyonunu göstermektedir. Embriyo, kolay görselleştirme ve tanımlama için yeşil bir floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş motor nöronları eksprese eder. Motor nöronlar bir floresan mikroskobu altında cerrahi olarak izole edilir ve bir kültür ortamında tutulur.

Bir Fare Embriyosundan Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü

Video, yenidoğan bir fare beyninden hücreleri izole etme ve kültürleme yöntemini gösterdi. Beynin enzimatik ve mekanik ayrışmasını ve ardından karışık bir glial popülasyon elde etmek için nöronal büyüme faktörü olmayan büyüme ortamında kültürlemeyi içeriyordu.

Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Bu videoda, yetişkin fare omurilik dokusundan birincil karışık glial hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Protokol, dokunun enzimatik sindirimini ve ardından tek hücreli bir popülasyon elde etmek için kırık hücre zarlarının ve miyelin kalıntılarının çıkarılmasını içerir. Hücreler daha sonra karışık glial hücre büyümesi için optimize edilmiş ortamda kültürlenir.

Bir Fare Omuriliğinden Primer Karışık Glial Hücre Kültürlerinin Oluşturulması

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Bu çalışma, primer okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların homojen hücre kültürlerini ortaya çıkarmak için bir protokol sunmaktadır. Bu kültürler, oküler ve spinal motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerinin karşılaştırmalı analizleri için kullanılabilir.

Prenatal Islmn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Öğrenin, yenidoğan farelerden spinal kord nöronlarını mekanik ve enzimatik yöntemlerle izole etme tekniğini. Bu yöntem, nöron biyolojisi ve stres yanıtları üzerine çeşitli deneyler için sağlıklı hücre elde edilmesini sağlar.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

Daha fazla video keşfet