Protein Film kızılötesi elektrokimya H2 oksidasyon çalışma için [NiFe] Hydrogenase tarafından gösterdi

Bu protokolün genel amacı, protein filmi, kızılötesi elektrokimya veya PFIRE kullanarak hem devirsiz hem de kararlı durum elektrokatalitik devir koşulları altında bir nikel-demir hidrojenaz redoks enziminin aktif yan kimyasını araştırmaktır. PFIRE tekniğinin ana avantajı, bir karbon elektrot üzerinde hareketsiz hale getirilmiş redoks proteinlerinin aynı anda hassas elektrokimyasal kontrolünü ve kızılötesi spektroskopik örneklemesini mümkün kılmasıdır. Bu yöntem, biyofizik ve biyoelektrokimya alanlarında, kararlı durum katalitik devir sırasında redoks proteininin hangi durumlarının mevcut olduğu hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Prosedüre başlamak için, ıslak bir anaerobik eldiven kutusunda, bir mililitre ultra saf suda 20 miligram yüksek yüzey alanlı karbon siyahı parçacıklarını askıya alın. Süspansiyonu en az 15 dakika boyunca veya parçacıklar düzgün bir şekilde dağılana ve dinlenme durumunda bir saat içinde tortu oluşmayana kadar daha düşük güçte sonikasyon yapın. Daha sonra, mililitre başına yaklaşık yedi miligram E.Coli hidrojenaz çözeltisinin 15 mikrolitresini 50 kilodaltonluk bir santrifüj filtre ünitesine yükleyin.

Çözeltiyi, hidrojenazın izoelektrik noktasına yakın bir pH ile 450 mikrolitre düşük iyonik kuvvete sahip bir değişim tamponu ile seyreltin. Karışımı 27.000 kez g'de santrifüjleme ile 50 mikrolitreye konsantre edin. Tampon değişimini tamamlamak için karışımı dört kez daha konsantre edin.

Daha sonra, mililitre başına 20 miligram karbon siyahı dispersiyonunun beş mikrolitresini tampon değişimli hidrojenaz ile birleştirin. Hidrojenazın karbon siyahı parçacıklarını emmesini sağlamak için karışımı gece boyunca sıfır santigrat derecede saklayın. Partikül dağılımını korumak için karışımı periyodik olarak kontrol edin.

Modifiye edilmiş parçacıkları 27.000 kez g'da santrifüjleyin ve süpernatantın neredeyse renksiz olduğunu doğrulayın, bu da hidrojenazın parçacıklara iyi bir şekilde emildiğini gösterir. Yüksek düzeyde emilim elde etmek, deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir. Başlangıç noktası olarak proteinin izoelektrik noktasına yakın pH'daki düşük iyonik kuvvet tamponunu kullanarak absorpsiyon tamponunu optimize ediyoruz.

Parçacıkları üç ila beş döngü santrifüjleme ve taze değişim tamponunda yeniden süspansiyon ile yıkayın. Mililitre başına 20 miligram partikül yüklemesi elde etmek için partikül karışımını yaklaşık beş mikrolitreye konsantre edin. PFIRE ölçümlerini almaya hazırlanmaya başlamak için, bir silikon iç yansıma elemanını 15 dakika boyunca sülfürik asitte düşük güçlü sonikasyonla temizleyin.

Ardından bir saat boyunca nitrik asit gelir. Daha sonra elemanı ultra saf suda durulayın ve kuru nitrojen gazı akışı altında kurutun. IRE'yi beş yansımalı ATR aksesuarının taban plakasına sabitlemek için elektrik sınıfı silikon dolgu macunu kullanın ve sızdırmazlık maddesini IRE'nin kenarlarında tutmaya özen gösterin.

Sızdırmazlık maddesinin tamamen kurumasını bekleyin. Ardından taban plakasını, bir FTIR spektrofotometresinin yanında IR şeffaf pencereli kuru bir anaerobik torpido gözüne koyun. Taban plakasını ATR aksesuarına monte edin.

Hızlı tarama modunda bir arka plan spektrumu edinin. Ardından ATR aksesuar taban plakasını çıkarın ve ıslak anaerobik torpido gözüne aktarın. Enzimle modifiye edilmiş karbon siyahı parçacıklarının bir mikrolitresini, parçacıkların tamamen kurumasına izin vermeden IRE yüzeyine eşit şekilde damlatın.

Enzimle modifiye edilmiş partikül karışımının mümkün olduğunca mililitre başına 20 miligrama yakın bir yüklemeye konsantre edilmesi önemlidir. Aksi takdirde, bu adımda parçacıkları düşürürken iyi bağlanmış bir parçacık filmi elde etmek zor olabilir. Ultra saf suya batırılmış bir karbon kağıdı parçasını IRE yüzeyine nazikçe yerleştirin ve kağıdın silikon dolgu macunu ile temas etmesine izin vermeden parçacık filminin kaplandığından emin olun.

IRE'nin üzerine özel bir spektroelektrokimyasal hücre monte edin. Sistem hazırlığı sırasında enzimi nemli tutmak için çözelti girişinden 200 mikrolitre deney tamponu ekleyin. Çözelti girişini ve çıkışını peristaltik pompa hortumu aracılığıyla bir deney tamponu şişesine bağlayın.

Ardından monte edilmiş hücreyi kuru torpido gözüne aktarın. Hücre aksamını ATR aksesuarına monte edin ve hortumu peristaltik pompaya bağlayın. Daha önce edinilen spektrumu arka plan olarak kullanarak emici bir spektrum elde edin.

MI2 bantlarının 1.540 karşılıklı santimetrede güçlü bir şekilde görülebildiğini ve hidrojenaz aktif bölge tepe noktalarının 1.850 ila 2.150 bölgesinde tespit edilebilir olduğunu doğrulayın. Deneye hazırlanmak için, parçacık filmine doymuş bir kalomel referans elektroduna karşı negatif 0.8 voltluk bir azaltma potansiyeli uygulayın. Deney tamponunu anaerobik hidrojen gazı ile doyurun.

Daha sonra tamponu dakikada yaklaşık 12 mililitre hızla spektroelektrokimyasal hücreden akıtmaya başlayın. Hidrojenazı aktive etmek için numuneyi gece boyunca hidrojene doymuş deney tamponunun akışı altında bırakın. Aktive edilmiş numunenin emici bir spektrumunu elde edin ve aktif bölgenin CO ve CN bantlarının birden fazla indirgenmiş durum gösterdiğini doğrulayın.

Daha sonra deney tamponunu anaerobik nitrojen gazı ile doyurun ve tamponu hücreden geçirin. 30 dakika boyunca doymuş bir kalomel referans elektroduna karşı sıfır voltluk bir oksitleme potansiyeli uygulayın ve emici bir spektrum elde edin. Daha sonra 30 dakika boyunca bir azaltma potansiyeli uygulayın ve başka bir spektrum elde edin.

Enzimin tamamen oksitlendiğini ve daha sonra indirgendiğini doğrulayın. Değilse, hücrenin elektrik bağlantılarını kontrol edin. Anaerobik hidrojen doymuş tampon kullanarak, deney için en uygun akış hızını belirlemek için artan akış hızlarında bir dizi döngüsel voltammogram elde edin.

Bu akış hızını kullanarak, bir dizi potansiyel ve çözelti koşulunda spektrumlar elde edin. E.coli hidrojenaz bir'in PFIRE ölçümleri, inert bir atmosferde ve hidrojen gazı varlığında çeşitli potansiyellerde elde edildi. Bir hidrojen atmosferi altında elde edilen spektrumlar, katalitik hidrojen oksidasyonu sırasında mevcut olan aktif bölge durumlarının kararlı durum dağılımlarını temsil etti.

Nikel-Si'den nikel-B durumunun oluşumu yoluyla hidrojenazın anaerobik oksidatif ve aktivasyonu, daha sonra potansiyel uygulama sırasında çeşitli zaman noktalarında spektrumlar elde edilerek ve birinci spektruma göre farklı spektrumlar hazırlanarak araştırıldı. Nikel-Si'nin nikel-B'ye gözlenen kademeli dönüşümü, akımdaki monotonik azalma ile tutarlıydı. Spektrumlar ayrıca, hidrojenaz katalitik döngüsünün proton transfer adımlarını araştırmak için bir dizi çözelti pH'ı üzerinden elde edildi.

Düşük pH'da, nikel-C durumu daha yaygınken, nikel-L durumu yüksek pH'ta daha yaygındı. Nikel-C ve nikel-L'nin nispi konsantrasyonlarının pH bağımlılığı, deneyde değerlendirilen her pH'ta ilgili tepe noktalarındaki maksimum emici değerlerinden belirlendi. Bu teknik, biyoelektrokimya alanındaki araştırmacıların hidrojenez yoluyla hidrojen aktivasyonunun kararlı durum kinetiğini keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, tipik bir PFIRE deneyini iyi anlamış olmalısınız. Teknik, protein film elektrokimyası ile incelenebilen herhangi bir redoks proteini için uygundur ve elektrokimyasal ölçüme doğrudan kimyasal içgörü ekler.