Tatlandırıcı Kodlamanın Yeni Yöntemleri
29 Haziran 2017
Tatlandırıcı kodlamayı incelemek için üç yeni yöntem sunuyoruz . Basit bir hayvan olan Manduca güvesi Mandka'yı kullanarak, diseksiyon protokolünü, çoklu tatlılık reseptör nöronlarının aktivitesini kaydetmek için hücre dışı tetrodeslerin kullanımını ve tat vericilerin kesin zamanlı nabızlarını iletmek ve izlemek için bir sistemi tarif ediyoruz.
Bu yöntemlerin genel amacı, çoklu reseptör nöronlarının aktivitesini in vivo olarak kaydederken, hassas bir şekilde zamanlanmış tat darbelerini iletirken ve izlerken, basit bir hayvan mandi-casecsta'da tat kodlamasını incelemektir. Bu yöntemler, tadımcıların tat alma reseptörü nöronlarının popülasyonları tarafından nasıl kodlandığı gibi, tuzla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hassas bir şekilde verilen tat uyaranlarından önce, sırasında ve sonrasında çoklu tat nöronları için in vivo kayıtlara izin vermesidir.
Bu yönteme yeni olan kişiler, diseksiyon prosedürü karmaşık olduğu için bunu zor bulabilir. Bu nedenle, yöntemin görsel gösteriminin yardımcı olacağını umuyoruz. Bu teknikler, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi iken Sam Writer tarafından geliştirildi, Alejandra ile birlikte Kui Sun bu prosedürleri gösterecek.
Eklosiyondan üç gün sonra, genel olarak sağlıklı bir görünüme sahip olan her iki cinsiyetten bir güve seçin. Kanatlar tamamen uzatılmalı ve hortum ve antenler iyi şekillendirilmiş ve sağlam olmalıdır. Bir davlumbazda, seçilen güveyi kafa açıkta kalana kadar bir sınırlama tüpüne yerleştirin.
Ardından, tüpün diğer ucuna kağıt mendil sokarak güveyi hareketsiz hale getirin. Şimdi, bir şırıngadan verilen basınçlı havayı kullanarak, açıkta kalan kafadaki saçları çıkarın. Ardından, tüpü bir Petri kabındaki kil bir platforma yerleştirin.
Başın sırt tarafını yukarı doğru yönlendirin. Ardından, anteni ve hortumu koruyun. İlk olarak, yarım santimetre uzunluklarda kesilmiş 200 mikrolitrelik pipet ucundan her yapı için kapaklar yapın.
Hortumu manipüle etmek için bir tel parçasından bir kanca hazırlayın. Hortumun en proksimal kısmı korunana kadar hortumu kapaklardan birine uzatın. Sert batik balmumu kullanarak tüpü kafa kapsülünün sırt kısmına sabitleyin.
Ardından, anteni dikkatlice kaplayın ve tüpleri batik balmumu ile sabitleyin. Şimdi, toka kompresör kasını keserek beyni stabilize edin. Diseksiyon mikroskobu altında, hortumun hemen altından küçük bir kesi yaparak kafa kapsülünü açmak için mikrodiseksiyon aletlerini kullanın.
Kasın kesildiğini doğrulamak için, hortumun distal üçte ikisine sükroz çözeltisi verin ve beş dakika boyunca hortumun uzamadığından emin olun. Ardından, erimiş bir batik balmumu tabakası kullanarak kafa kapsülünü kapatın. Beyni tuzlu su ile perfüze etmek için, başın ventral tarafının etrafına bir balmumu kabı yapın.
Elektrikli bir ağda makinesi kullanarak, başın ön tarafı boyunca arkaya doğru hareket eden bir balmumu kabı oluşturmaya başlayın. Hortumu ve anten tüplerini bardağın içinde tutun. Bardağı göz hizasına gelene kadar dışa ve yukarı doğru inşa etmeye devam edin.
Forseps kullanarak, labial palpları alın ve erimiş balmumu kullanarak balmumu kabına tutturun. Ardından, ikili epoksi üzerinde bir şey tabakası kullanarak balmumu kabındaki ve tüplerdeki açıklıkları kapatın. Epoksiyi bir kürdan kullanarak karıştırın.
İlk olarak, bardağın dış ve iç yüzeylerini kapatın. İkinci olarak, başın daha sıkı tutulması için boynu çevreleyen tutucu tüpün bir kısmını doldurun. 20 dakika sonra kapta sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
Beyin ameliyatına başlamak için önce labial avuç uçlarını kesin. Kafa kapsülünün ventral tarafını açmak için, kütikülü başın arkası ve önü boyunca ve gözlerin çevresinden kesin. Ardından, başın arkası boyunca kesin ve hortumun yakınında başın ön kısmı boyunca daha fazla kesim yapın.
Ardından, beyni açığa çıkarmak için kütikül kanadını forseps ile nazikçe kaldırın. Şimdi, SEZ ve maksiller sinirleri açığa çıkaran en kritik adımı gerçekleştirin. Yağ dokusunu ve trakeayı yavaş ve dikkatli bir şekilde çıkarın.
Beyni sık sık taze tuzlu su ile durulayın. Çok dikkatli olun, çünkü maksiller sinirleri ezmek çok kolaydır. SEZ ve maksiller sinirler nihayet görünür hale geldiğinde, ince bir kılıfla kaplanacaktır.
Bu kılıfı çıkarmak için, fazla tuzlu suyu boşaltın ve ardından %10'luk bir kollajenaz dispas solüsyonu uygulayarak kılıfı zayıflatın. Beş dakika beklettikten sonra, çözeltiyi birkaç kez tuzlu su ile durulayın. Daha sonra, tuzlu su ile birkaç durulamadan sonra, çok ince mikrodiseksiyon forsepsleri kullanarak kılıfı nazikçe çıkarın.
Son olarak, perfüzyon kabına bir tuzlu su damlama hattı sabitleyin. Bu bölümde, bir tarife dağıtım sisteminin nasıl oluşturulacağı ve kullanılacağı açıklanmaktadır. Sistem, birkaç açıklığa sahip bir test tüpünden oluşur.
Açıklıklar, hayvanın hortumu, tastants manifoldu, bir renk sensörü için giriş sağlar ve çiçeğin sudan geçmesine izin verir. Bu sistemi oluşturmak için önce hortum için bir test tüpü hazırlayın. Bir havya kullanarak hortum büyüklüğünde bir delik açın.
Ardından, hortumu yerinde tutmak için tüpün içinde ekranlı bir bölüm oluşturun. Deliğin beş milimetre yukarısını kesin, ağı oraya balmumu ile yerleştirin ve tüpleri balmumu ve epoksi kullanarak yeniden bağlayın. Tastantları vermek için basınçlı bir perfüzyon sistemi kullanın.
Bir manifolda gerektiği kadar çok tastant tüpü birleştirin. Tastant çıkış tüpünü bağlamak için, ağın yaklaşık bir santimetre üzerinde bir delik açın, ardından çıkış tüpünü epoksi ile sabitleyin. Her tastantta, bir renk sensörü tarafından algılanacak yapay bir boya ekleyin.
Aparata, ağ etrafında yarım santimetrelik bir deliğe bir renk sensörü takın ve epoksi kullanarak oraya sabitleyin. Damıtılmış suyu silikon boru aracılığıyla sisteme iletmek için peristaltik bir pompa kullanın. Atık suyu büyük bir kap ile toplayın.
Tastantları hava püskürterek iletmek için pnömatik bir pompa kullanın. Şimdi, borudan temiz su pompalamaya başlayın ve renk sensörünü test etmek için tastant darbeleri verin. Şimdi, damıtılmış güve hortumunun üçte ikisini test tüpüne yükleyin.
Forseps kullanarak hortumu uzatın ve yavaşça deliğe itin. Ardından, hortumu yumuşak diş mumu ve bir epoksi tabakası ile yerine kapatın. Şimdi, salin perfüzyon hattını bağlayın ve perfüzyon akışını ayarlayın.
Ardından, bükülmüş tel tetrodun toprak elektrodunu tuzlu su banyosuna daldırın. Daha sonra, bir mikromanipülatör kullanarak, tetrodu maksiller sinirin yanına yerleştirin ve yavaşça sinire doğru ilerletin. Ani yükselme sinyallerini tespit ettikten sonra, kayıt almadan önce hazırlığın en az 10 dakika stabilize olmasına izin verin.
Kayıtlar, tarif edilen protokol kullanılarak tat verme öncesinde, sırasında ve sonrasında tat reseptörü nöronlarından yapıldı. Her bir testin bir saniyelik darbesinin başlangıcı ve ofseti, renk sensörü tarafından izlendi. Tastantlar, dört kanalın her biri tarafından tespit edilen sivri uçları ortaya çıkardı.
Sivri uçlu trenler içinde, bireysel aksiyon potansiyelleri gözlemlenebilir. Bu sivri uçları benzersiz nöronlara atamak için spike sıralama yazılımı kullanıldı. Üç farklı tat reseptörü nöronunun sırayla verilen altı tastant'a verdiği yanıt, tatlara farklı seviyelerde temel aktivite ve seçicilik ortaya koymaktadır.
Ayrıca, yanıtların zamanlaması farklıydı. Bazıları uyaranın süresine kilitlenirken, diğerleri uyarandan daha uzun süre dayanır. Hücre içi kayıtlar, geleneksel keskin cam elektrotlar kullanılarak tat reseptörü aksonlarından da yapılabilir.
Hücre içi kayıtlar, tarif edilen tetrode tekniği kullanılarak gözlemlenen tepkilere çok benziyordu, ancak tetrode kayıtlarının yapılması daha kolay, daha uzun ömürlü ve daha sağlamdı. Bu videoyu izledikten sonra, mandi-casecsta'da maksiller sinirleri ve alt özofagus bölgesini açığa çıkarabilmeli ve hassas zamansal kontrol ile bir tastant dağıtım sistemi oluşturabilmelisiniz. Bu protokolü uygularken, laboratuvar güvenlik eldivenleri ve bir yüz maskesi takın çünkü mandi-casecsta tarafından dökülen ince toz ölçekli alerjenik olabilir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür üç buçuk saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü takiben, tat alma reseptörü nöronlarının tatlara tepkilerinin, postsinaptik hedef nöronlara iletildiklerinde nasıl dönüştürüldüğü gibi ek soruları yanıtlamak için birden fazla beyin alanından eşzamanlı kayıtlar da gerçekleştirilebilir.
Genel Bakış
Bu makale, Manduca sexta güvesindeki tat bilişimi çalışmaları için üç yeni yöntem sunmaktadır. Teknikler, bir diseksiyon protokolü, tat alıcı reseptör nöronlarının hücre dışı tetrot kaydı ve tat verici uyaranların teslim edilmesi ve izlenmesi için bir sistem içermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal Biyoloji
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Tat bilişimi anlayışı, duyusal işleme konusundaki anlayışlar için çok önemlidir.
- Manduca sexta güvesi bu çalışmalar için basit bir model organizma olarak hizmet vermektedir.
- Birden fazla tat alıcı reseptör nöronundan kayıt yapmak, tat bilgisinin nasıl kodlandığını açıklığa kavuşturabilir.
- Tat vericilerin doğru sonuçlar için hassas bir şekilde teslim edilmesi esastır.
Çalışmanın Amacı
- Güveler içinde tat nöronlarının canlı kayıtları için yöntemler geliştirmek.
- Tat vericilerin tat alıcı reseptör nöron popülasyonları tarafından nasıl kodlandığını araştırmak.
- Diseksiyon ve kayıt tekniklerinin görsel bir gösterimini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Sinirsel kayıtlar için güveyi hazırlama diseksiyon protokolü.
- Nöronal aktiviteyi kaydetmek için hücre dışı tetrot kullanımı.
- Tat vericilerin zamanlanmış darbelerin teslim edilmesi ve izlenmesi için sistem.
- Yeni araştırmacılara karmaşık diseksiyon sürecinde yardımcı olmak için görsel yardımlar.
Ana Sonuçlar
- Birden fazla tat alıcı reseptör nöronundan başarılı canlı kayıtlar.
- Tat verici teslim sisteminin etkinliğini gösterdi.
- Tat bilgisinin kodlanması hakkında anlayış sağladı.
- Diseksiyon sürecindeki zorlukları ve çözümleri vurguladı.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş yöntemler, tat bilişimi çalışmaları için değerlidir.
- Canlı kayıtlar, tat işleme konusundaki anlamayı geliştirebilir.
- Gelecek araştırmalar bu teknikler üzerine inşa ederek tat bilişimi konusunda daha fazla keşif yapabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding gustatory coding mechanisms provides foundational insights for target validation in neuroscience drug discovery, particularly for compounds modulating feeding behavior or metabolic pathways. The ability to record population-level neuronal responses in vivo supports mechanistic de-risking by linking molecular interventions to functional neural outputs. These methods enable predictive confidence in early discovery by quantifying how tastants are encoded across gustatory receptor neuron populations before downstream signal processing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking tastant identity and concentration to specific patterns of electrical activity across gustatory receptor neuron populations.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct in vivo measurement of neuronal responses before, during, and after stimulus delivery, clarifying target engagement in sensory pathways.
- Scientific Value: Facilitates pathway characterization by revealing how individual neurons contribute to population-level coding, aiding in target selection for modulating feeding-related behaviors.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by enabling consistent extracellular recording of multiple gustatory receptor neurons using tetrode arrays.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility through precise temporal control of tastant delivery and real-time monitoring via color sensor feedback, reducing variability in stimulus presentation.
- Scientific Value: Enables screening readiness by generating quantifiable spike train outputs that can be sorted to identify individual neuron responses, supporting reliable compound evaluation in taste-modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking in vivo gustatory receptor neuron activity to downstream brain processing, allowing assessment of how sensory signals are transformed at postsynaptic targets.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing baseline neuronal response profiles that can be used to detect compound-induced alterations in coding fidelity.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking by distinguishing between stimulus-locked and sustained neuronal responses, helping to differentiate direct sensory effects from secondary network adaptations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, particularly for targets involved in chemosensory signaling and feeding behavior regulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling researchers to determine how specific tastants are encoded by defined populations of gustatory receptor neurons, clarifying molecular receptive ranges.
- Screening: Describes assay readiness through stable tetrode recordings that yield consistent spike detection across channels, allowing comparison of neuronal responses under different conditions.
- Analytics: Highlights spike sorting as a key analytical output that assigns action potentials to unique neurons, enabling resolution of individual contributions to population coding.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how gustatory receptor neuron responses propagate to follower neurons in the brain, informing postsynaptic target validation.
- Enterprise Reuse: Positions the tetrode-based recording system as a reusable platform for longitudinal studies, as recordings are longer lasting and more robust than intracellular sharp electrode methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how tastant identity and concentration are represented in neural activity patterns.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through a perfusable preparation that supports repeated recordings and simultaneous multi-area monitoring.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing objective, quantifiable neural readouts that correlate tastant delivery with electrophysiological outcomes, reducing reliance on behavioral proxies alone.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds that alter gustatory coding fidelity, enabling early detection of off-target sensory effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, microsurgery, and electrophysiology to successfully expose maxillary nerves and subesophageal zone without damaging delicate structures.
- Dependent on specialized instrumentation including micromanipulators, tetrodes, perfusion systems, and color sensors for tastant delivery and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of dissection and wax-sealing protocols to ensure consistent preparation quality across users and laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending the approach to other model systems, as the maxillary nerve accessibility and sheath removal techniques are species-specific.
- Includes practical limitations such as the intricate dissection process and allergenic scaling from the moth, which require safety precautions and may limit throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Preparing M. sexta for Brain Surgery
10:03
Conclusion
8:45
Results: Tetrode Recordings of Stimulated Gustatory Receptor Neurons
4:22
Revealing the Subesophageal Zone (SEZ) and Maxillary Nerves
6:00
Tastant Delivery System and Extracellular Tetrode Recording
