Tatlandırıcı Kodlamanın Yeni Yöntemleri
29 Haziran 2017
Tatlandırıcı kodlamayı incelemek için üç yeni yöntem sunuyoruz . Basit bir hayvan olan Manduca güvesi Mandka'yı kullanarak, diseksiyon protokolünü, çoklu tatlılık reseptör nöronlarının aktivitesini kaydetmek için hücre dışı tetrodeslerin kullanımını ve tat vericilerin kesin zamanlı nabızlarını iletmek ve izlemek için bir sistemi tarif ediyoruz.
Bu yöntemlerin genel amacı, hassas zamanlamalı tatlandırıcı darbeleri iletirken ve izlerken, in vivo olarak birden fazla reseptör nöronunun aktivitesini kaydederek basit bir hayvan modelinde gustatuar kodlamayı incelemektir. Bu yöntemler, tatlandırıcıların gustatuar reseptör nöron popülasyonları tarafından nasıl kodlandığı gibi gustasyonla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hassas bir şekilde iletilen tatlandırıcı stimülasyonları öncesinde, sırasında ve sonrasında birden fazla gustatuar nöron için in vivo kayıtlar yapılmasına olanak sağlamasıdır.
Diseksiyon prosedürü karmaşık olduğu için, bu yönteme yeni başlayanlar zorluk çekebilirler. Bu nedenle, yöntemin görsel gösteriminin faydalı olacağını umuyoruz. Bu teknikler, laboratuvarımda lisansüstü öğrencisi olduğu dönemde Sam Writer ve Alejandra tarafından geliştirilmiştir; bu prosedürler Kui Sun tarafından gösterilecektir.
Çıkıştan üç gün sonra, genel görünümü sağlıklı olan herhangi bir cinsiyette bir güve seçin. Kanatlar tamamen açılmış olmalı, hortum ve antenler ise düzgün oluşmuş ve sağlam olmalıdır. Çeker ocak içerisinde, seçilen güveyi başı dışarıda kalana kadar bir sabitleme tüpüne yerleştirin.
Ardından, tüpün diğer ucuna doku kağıdı yerleştirerek güveyi sabitleyin. Şimdi, bir şırınga aracılığıyla verilen basınçlı havayı kullanarak, açıkta kalan baş bölgesindeki kılları temizleyin. Daha sonra, tüpü bir Petri kabı içindeki kil platformun üzerine yerleştirin.
Başın dorsal tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Ardından, antenleri ve proboskisi korumaya alın. İlk olarak, yarım santimetre uzunluğunda kesilmiş 200 microliter pipet uçlarını kullanarak her bir yapı için koruyucu kılıflar hazırlayın.
Proboscisi manipüle etmek için bir tel parçasından kanca hazırlayın. Proboscisin en proksimal kısmı korunana kadar onu kapaklardan birinin içine doğru uzatın. Tüpü, sert batik mumu kullanarak baş kapsülünün dorsal kısmına sabitleyin.
Ardından, antenleri dikkatlice düzleştirin ve tüpleri batik mumu ile sabitleyin. Şimdi, toka kompresör kasını keserek beyni stabilize edin. Diseksiyon mikroskobu altında, probosisin hemen altına küçük bir kesik atarak baş kapsülünü açmak için mikrodiseksiyon aletlerini kullanın.
Kasın kesildiğini doğrulamak için, proboskisinin distal üçte ikisine sükroz çözeltisi sunun ve beş dakika boyunca proboskisin uzamadığından emin olun. Ardından, eritilmiş batik mumu tabakası kullanarak baş kapsülünü kapatın. Beyni salinle perfüze etmek için, başın ventral tarafına balmumuyla bir kap oluşturun.
Elektrikli bir balmumu kalemi kullanarak, başın ön kısmından başlayıp arkaya doğru ilerleyerek bir balmumu çukuru oluşturmaya başlayın. Probosis ve anten tüplerini çukurun içinde tutun. Çukuru, gözlerin seviyesine ulaşana kadar dışa ve yukarıya doğru oluşturmaya devam edin.
Pens kullanarak labial palpleri alın ve eritilmiş balmumu yardımıyla balmumu kaba sabitleyin. Ardından, balmumu kaptaki ve tüplerdeki tüm açıklıkları ince bir binary epoksi tabakası kullanarak sızdırmaz hale getirin. Epoksiyi bir kürdan yardımıyla karıştırın.
İlk olarak, kabın dış ve iç yüzeylerini kaplayın. İkinci olarak, başın daha sıkı tutulması için boynu çevreleyen sabitleme tüpünün kısmını doldurun. 20 dakika sonra, kapta sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
Beyin cerrahisine başlamak için öncelikle labial palp'leri kesin. Baş kapsülünün ventral tarafını açmak için, başın arka ve ön kısımları ile gözlerin çevresi boyunca kütikülü kesin. Ardından, başın arka kısmı boyunca kesin ve probosis'e yakın başın ön kısmında daha fazla kesik oluşturun.
Ardından, beyni ortaya çıkarmak için kütikül flebini pensle nazikçe kaldırın. Şimdi, SEZ ve maksiller sinirlerin açığa çıkarıldığı en kritik adımı gerçekleştirin. Yağ dokusunu ve trakeayı yavaşça ve dikkatle temizleyin.
Beyni taze salin ile sık sık durulayın. Maksiller sinirlerin ezilmesi çok kolay olduğu için çok dikkatli olun. SEZ ve maksiller sinirler sonunda görünür hale geldiğinde, ince bir kılıfla kaplı olacaklardır.
Bu kılıfı çıkarmak için, fazla salini boşaltın ve ardından %10 kollagenaz dispaz çözeltisi uygulayarak kılıfı gevşetin. Beş dakika boyunca beklettikten sonra, çözeltiyi salin ile birkaç kez durulayın. Ardından, salin ile yapılan birkaç durulamanın ardından süper ince mikrodiseksiyon pensleri kullanarak kılıfı nazikçe çıkarın.
Son olarak, perfüzyon kabına bir salin damlatma hattı yerleştirin. Bu bölüm, tat maddesi iletim sisteminin nasıl kurulacağını ve kullanılacağını açıklamaktadır. Sistem, üzerinde birkaç açıklık bulunan bir test tüpünden oluşur.
Açıklıklar; hayvanın hortumu, çeşitli tat maddeleri ve bir renk sensörü için giriş sağlar ve suyun akışına izin verir. Bu sistemi kurmak için öncelikle hortum için bir test tüpü hazırlayın. Havya kullanarak hortum boyutunda bir delik açın.
Ardından, proboskisi yerinde tutmak için tüp içerisinde telli bir bölme oluşturun. Deliğin beş milimetre üzerinden kesin, teli burada balmumu ile sabitleyin ve tüpleri balmumu ve epoksi kullanarak tekrar birleştirin. Tadlandırıcıları iletmek için basınçlı bir perfüzyon sistemi kullanın.
İhtiyaç duyulan miktarda tat alma tüpünü bir manifolda bağlayın. Tat alma çıkış tüpünü bağlamak için, ağın yaklaşık bir santimetre üzerine bir delik açın ve ardından çıkış tüpünü epoksi ile buraya sabitleyin. Her tat alma tüpüne, bir renk sensörü tarafından tespit edilecek yapay bir boya ekleyin.
Bir renk sensörünü, aparat üzerindeki mesh'in yaklaşık yarım santimetre üzerindeki bir deliğe yerleştirin ve epoksi kullanarak orada sabitleyin. Distile suyu silikon tüpler aracılığıyla sisteme iletmek için bir peristaltik pompa kullanın. Atık suyu geniş bir kapla toplayın.
Tad maddelerini hava püskürtmeleriyle iletmek için pnömatik bir pompa kullanın. Şimdi, borulardan temiz su pompalamaya başlayın ve renk sensörünü test etmek için tastant darbeleri gönderin. Ardından, güve probosisinin üçte ikisini test tüpüne yerleştirin.
Pens kullanarak probosis'i uzatın ve nazikçe deliğe itin. Ardından, probosis'i yumuşak diş mumu ve bir kat epoksi ile sabitleyin. Şimdi, salin perfüzyon hattını bağlayın ve perfüzyon akışını ayarlayın.
Ardından, bükülmüş tel tetrotun toprak elektrodunu salin banyosuna daldırın. Sonra, bir mikromanipülatör kullanarak tetrotu maksiller sinirin yanına yerleştirin ve yavaşça sinirin içine ilerletin. Spike sinyalleri tespit edildikten sonra, kayıtlar almaya başlamadan önce preparasyonun en az 10 dakika boyunca stabilize olmasına izin verin.
Kayıtlar, tanımlanan protokol kullanılarak tatlandırıcı verilmeden önce, verme sırasında ve sonrasında gustatuar reseptör nöronlarından yapılmıştır. Her bir tatlandırıcının bir saniyelik darbesinin başlangıcı ve bitişi renk sensörü ile izlenmiştir. Tatlandırıcılar, dört kanalın her biri tarafından tespit edilen spike'lar oluşturmuştur.
Sinyal dizileri (spike trains) içerisinde, bireysel aksiyon potansiyelleri gözlemlenebildi. Bu sinyalleri benzersiz nöronlara atamak için sinyal ayıklama (spike sorting) yazılımı kullanıldı. Üç farklı tat reseptör nöronunun, sırayla verilen altı farklı tat maddesine verdiği yanıt, farklı bazal aktivite seviyelerini ve tat maddelerine karşı seçiciliği ortaya koymaktadır.
Ayrıca, yanıtların zamanlamaları farklılık göstermiştir. Bazıları stimulus süresine bağlıyken, diğerleri stimulus süresini aşmaktadır. Geleneksel keskin cam elektrotlar kullanılarak gustatuar reseptör aksonlarından hücre içi kayıtlar da yapılabilmektedir.
Hücre içi kayıtlar, tanımlanan tetrot tekniği kullanılarak gözlemlenen yanıtlarla oldukça benzerdi ancak tetrot kayıtlarını yapmak daha kolaydı, daha uzun sürdü ve daha dayanıklıydı. Bu videoyu izledikten sonra, mandi-casecsta'da maksiller sinirleri ve sub-özofageal bölgeyi açığa çıkarabilmeli ve hassas zamansal kontrole sahip bir tatlandırıcı iletim sistemi kurabilmelisiniz. Bu protokolü uygularken, mandi-casecsta tarafından dökülen ince tozsu pullar alerjen olabileceğinden laboratuvar güvenlik eldivenleri ve yüz maskesi kullanın.
Bu prosedürde uzmanlaşıldığında, işlem üç buçuk saatte tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, tat reseptör nöronlarının tatlandırıcılara verdiği yanıtların, postsinaptik hedef nöronlara iletildiklerinde nasıl dönüştüğü gibi ek soruları yanıtlamak için birden fazla beyin bölgesinden eş zamanlı kayıtlar da gerçekleştirilebilir.
Genel Bakış
Bu makale, Manduca sexta güvesinde tat kodlamasını incelemek için kullanılan üç yeni yöntemi sunmaktadır. Teknikler; bir diseksiyon protokolü, gustatuar reseptör nöronlarının hücre dışı tetrot kayıtlarını ve tat uyaranlarının iletilmesi ve izlenmesi için geliştirilmiş bir sistemi içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Davranışsal Biyoloji
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Tat kodlamasını anlamak, duyusal işlemleme süreçlerine dair içgörüler elde etmek için kritik öneme sahiptir.
- Manduca sexta güvesi, bu çalışmalar için basit bir model organizma görevi görür.
- Birden fazla tat reseptör nöronundan kayıt almak, tat bilgisinin nasıl kodlandığını aydınlatabilir.
- Tat maddelerinin hassas bir şekilde iletilmesi, doğru deneysel sonuçlar için esastır.
Çalışmanın Amacı
- Gustatuar nöronların in vivo kayıtları için yöntemler geliştirmek.
- Tat maddelerinin, gustatuar reseptör nöron popülasyonları tarafından nasıl kodlandığını araştırmak.
- Diseksiyon ve kayıt tekniklerinin görsel bir gösterimini sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Nöral kayıtlar için güve hazırlama diseksiyon protokolü.
- Nöronal aktiviteyi kaydetmek için hücre dışı tetrotların kullanımı.
- Zamanlanmış tat maddesi darbelerini iletmek ve izlemek için sistem.
- Karmaşık diseksiyon sürecinde yeni araştırmacılara yardımcı olacak görsel destekler.
Temel Sonuçlar
- Birden fazla tat reseptör nöronundan başarılı in vivo kayıtlar yapıldı.
- Tat maddesi iletim sisteminin etkinliği kanıtlandı.
- Tat bilgisinin kodlanmasına ilişkin içgörüler sağlandı.
- Diseksiyon sürecindeki zorluklar ve çözüm yolları vurgulandı.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntemler, gustatuar kodlamanın incelenmesi açısından değerlidir.
- In vivo kayıtlar, tat işleme mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirebilir.
- Gelecekteki araştırmalar, gustasyonu daha detaylı keşfetmek için bu tekniklerden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Tat kodlama mekanizmalarının anlaşılması, özellikle beslenme davranışını veya metabolik yolları modüle eden bileşikler için, nörobilim ilaç keşiflerinde hedef doğrulamasına yönelik temel bilgiler sağlar. İn vivo ortamda popülasyon düzeyindeki nöronal yanıtları kaydetme yeteneği, moleküler müdahaleleri fonksiyonel nöral çıktılarla ilişkilendirerek mekanistik risk azaltmayı destekler. Bu yöntemler, tat maddelerinin alt akış sinyal işlemeden önce tat reseptör nöron popülasyonları genelinde nasıl kodlandığını nicelleştirerek, erken keşif aşamasında öngörüsel güven sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tatlandırıcı kimliğini ve konsantrasyonunu, gustatuar reseptör nöron popülasyonları boyunca spesifik elektriksel aktivite paternleriyle ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Uyaran verilmeden önce, verilme sırasında ve verildikten sonra nöronal yanıtların doğrudan in vivo ölçümü aracılığıyla biyolojik risk azaltmayı destekler ve duyusal yollardaki hedef etkileşimini netleştirir.
- Bilimsel Değer: Bireysel nöronların popülasyon düzeyindeki kodlamaya nasıl katkıda bulunduğunu ortaya çıkararak yol karakterizasyonunu kolaylaştırır ve beslenme ile ilgili davranışların modülasyonu için hedef seçimine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tetrot dizileri kullanarak birden fazla tat reseptör nöronunun tutarlı bir şekilde hücre dışı kaydına olanak tanıyarak, onaylanmış biyolojik sistemleri analiz standartlaştırmasına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Tatlandırıcı iletiminin hassas zamansal kontrolü ve renk sensörü geri bildirimi aracılığıyla gerçek zamanlı izleme sağlayarak analiz tekrarlanabilirliğini artırır ve stimülasyon sunumundaki değişkenliği azaltır.
- Bilimsel Değer: Bireysel nöron yanıtlarını tanımlamak için ayrıştırılabilecek nicelendirilebilir spike treni çıktıları üreterek tarama hazırlığına olanak tanır ve tat modülasyonu çalışmalarında güvenilir bileşik değerlendirmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: In vivo gustatuar reseptör nöron aktivitesini aşağı akış beyin işlemleriyle ilişkilendirerek translasyonel sürekliliği destekler ve duyusal sinyallerin postsinaptik hedeflerde nasıl dönüştürüldüğünün değerlendirilmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kodlama sadakatindeki bileşik kaynaklı değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilecek bazal nöronal yanıt profilleri sağlayarak, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarına temel oluşturur.
- Bilimsel Değer: Stimulus-kilitli (uyarana bağımlı) ve sürdürülebilir nöronal yanıtlar arasında ayrım yaparak öngörülü risk azaltmaya odaklanır ve doğrudan duyusal etkilerin ikincil ağ adaptasyonlarından ayırt edilmesine yardımcı olur.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, erken dönem keşifteki hipotez testlerinden öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre edilmektedir; özellikle kemoduyusal sinyalizasyon ve beslenme davranışı düzenlemesiyle ilişkili hedefler için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Araştırmacıların, belirli tat maddelerinin tanımlanmış gustatuvar reseptör nöron popülasyonları tarafından nasıl kodlandığını belirlemelerini sağlayarak hipotez testlerini destekler ve moleküler reseptif aralıkları netleştirir.
- Tarama: Kanallar arasında tutarlı spike tespiti sağlayan stabil tetrod kayıtları aracılığıyla analiz hazırlığını tanımlayarak, farklı koşullar altındaki nöronal yanıtların karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Analitik: Aksiyon potansiyellerini benzersiz nöronlara atayan spike sıralamasını temel bir analitik çıktı olarak vurgular ve böylece popülasyon kodlamasına olan bireysel katkıların çözümlenmesini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Gustatuvar reseptör nöron yanıtlarının beyindeki takipçi nöronlara nasıl iletildiğini göstererek yöntemi preklinik süreklilikle ilişkilendirir ve postsinaptik hedef doğrulama sürecine bilgi sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kayıtlar, hücre içi keskin elektrot yöntemlerine göre daha uzun ömürlü ve daha dayanıklı olduğu için, tetrod tabanlı kayıt sistemini boylamsal çalışmalar için yeniden kullanılabilir bir platform olarak konumlandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tad maddesi kimliğinin ve konsantrasyonunun nöral aktivite paternlerinde nasıl temsil edildiğine dair mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanan kayıtları ve eş zamanlı çok bölgeli izlemeyi destekleyen perfüzyona uygun bir preparat aracılığıyla standardizasyonu ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Tad maddesi iletimini elektrofizyolojik sonuçlarla ilişkilendiren objektif, ölçülebilir nöral veriler sağlayarak, yalnızca davranışsal vekilelere olan bağımlılığı azaltır ve go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Gustatuar kodlama sadakatini değiştiren bileşiklerin belirlenmesi yoluyla riskle uyumlu önceliklendirmeye temel oluşturur ve hedef dışı duyusal etkilerin erken tespitine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Hassas yapılara zarar vermeden maksiller sinirleri ve subözofageal bölgeyi başarıyla ortaya çıkarmak için böcek diseksiyonu, mikrocerrahi ve elektrofizyoloji konularında uzmanlık gerektirir.
- Tad maddesinin iletimi ve izlenmesi için mikromanipülatörler, tetrotlar, perfüzyon sistemleri ve renk sensörleri dahil olmak üzere özel enstrümantasyona bağımlıdır.
- Kullanıcılar ve laboratuvarlar arasında tutarlı hazırlık kalitesini sağlamak için diseksiyon ve balmumuyla mühürleme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Maksiller sinir erişilebilirliği ve kılıf çıkarma teknikleri türe özgü olduğundan, yaklaşımın diğer model sistemlere genişletilmesinde adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Karmaşık diseksiyon süreci ve güve kaynaklı alerjenik pullanma gibi, güvenlik önlemleri gerektiren ve işlem hacmini sınırlayabilecek pratik kısıtlamaları içerir.
