Name: PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Keşfedin, PIP-on-a-chip yöntemiyle protein-fosfoinositid etkileşimlerini etiketsiz ve mikroakışkan platformda nicel olarak nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu teknik, biyolojik olarak daha alakalı bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DS ve MSK, kısmen hibe AI053531 (NIAID, NIH) tarafından desteklendi; SS ve PSC hibe N00014-14-1-0792 (ONR) tarafından desteklendi.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Her bir PIP varyantı, düşük konsantrasyonlarda olsalar da, organel membran 1&#39;in eşsiz bir fiziksel bileşimi ve fonksiyonel özgünlüğünün tesis edilmesine katkıda bulundukları belirli organellerin sitosolik yüzeyi üzerinde bulunur. PIPs en önemli kullanım alanlarından biri, belirli bir hücre içi lokalizasyonu ve / veya aktivasyonunu 6, 7 gerektiren protein sayıda için belirli bir yerleştirme platformu gibidir. Hücresel fizyoloji ve hast...

Sayısız etkileşimler ve biyokimyasal işlemler iki boyutlu sıvı zar yüzeylerinde gerçekleşir. Ökaryotik hücrelerdeki zarla kapalı organeller, sadece biyokimyasal süreçlerde ve bunlarla ilişkili proteomda değil aynı zamanda lipit kompozisyonlarında da eşsizdir. Fosfolipidlerin olağan dışı bir sınıfı fosfoinositidlerdir (PIP&#39;ler). Hücresel lipidomun sadece% 1&#39;ini oluşturmalarına rağmen, bunlar 1 , 2 , 3 , 4 diğerleri arasında sinyal iletiminde, otofajiyede ve zar ticaretinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Hücresel PIP kinazlar tarafından inositol baş grubunun dinamik fosforilasyonu yedi PIP mono- ana grupları, bis- veya tris-fosforile 5 yol açar. Ek olarak, PIP&#39;ler membranların subselüler kimliğini tanımlar ve bir veya daha fazla fosfoin içeren protein / enzimler için özel membran yerleştirme siteleri olarak görev yaparlarÖrneğin Pleckstrin Homolojisi (PH), Phox Homoloji (PX) ve epsin N-terminal Homolojisi (ENTH) 6 , 7 . En çok çalışılan PIP bağlayıcı bölgeleri biri, özellikle yüksek nanomolar düşük mikromolar afinite 8 içinde fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) ile etkileşime giren fosfolipaz C (PLC) -δ1 PH olan , 9 , 10 , 11 . Bu etkileşimlerin mekanizması, termodinamiği ve özgüllüğünü incelemek için çeşitli nitel ve nicel in vitro yöntemler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. En sık kullanılan PIP bağlanma deneyleri arasında, yüzey plazmon rezonansı (SPR), izotermal kalorimetre (ITC), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, lipozom flotasyonu / sedimentasyon testi ve lipid lekeleri (Yağ-lekeleri / PIP-şeritleri)12 , 13 . Bunlar yaygın olarak kullanılsa da, hepsinin dezavantajları var. Örneğin, SPR, ITC ve NMR, büyük numuneler, pahalı aletler ve / veya eğitilmiş personel 12 , 13 gerektirir . Antikor bazlı lipid lekeleri gibi bazı tahlil formatları, suda çözünür PIP&#39;leri kullanır ve onları fizyolojik olmayan bir şekilde 12 , 14 , 15 , 16 olarak sunar . Buna ek olarak, lipid blotlar güvenilir miktarı edilemez ve sık sık yanlış pozitif / negatif gözlem 12, 17, 18 ile sonuçlanmıştır. Bu zorlukların üstesinden gelmek ve mevcut takım setini geliştirmek için am bağlamında desteklenen bir lipid katmanına (SLB) dayalı yeni bir etiketsiz yöntem geliştirildi<html> Protein-PIP etkileşimlerinin çalışmasına başarıyla uygulanan bir mikroakışkan platform ( Şekil 1 ) 19 . Protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılan strateji pH modülasyon algılamaya dayanmaktadır. Bu, fosfatidiletanolamin lipid başı grubu 20&#39;ye direkt olarak konjuge edilmiş orto- Sulforhodamin B ( o SRB) içeren pH&#39;ye duyarlı bir boya içerir. O SRB-POPE probu (Şekil 2A), düşük pH değerinde yüksek floresan ve% 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS (Şekil 5B) içinde yaklaşık 6.7 bir pKa&#39;ya sahip yüksek bir pH değerinde söndürülür. PLC δ1 PH nedeniyle PI (4,5) P2 (Şekil 5A) karşı yüksek özgüllük 21, 22 için yaygın olarak protein PIP bağlama yöntemleri doğrulamak için kullanılmıştır&quot;&gt; 23 , 24 , 25. Dolayısıyla, PLC-δ1 PH alanının PIP-on-a-chip analizi yoluyla PI (4,5) P 2&#39;ye yapıştığını test etmek için kullanılabileceğini düşünüyoruz PH etki alanı yapısı Bu çalışmada kullanılan bir net pozitif yüke (pl 8.4) sahiptir ve bu nedenle, OH çeken -. iyonları - PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS bağlanma üzerine iyonları (Şekil 5C), PH, OH getirir bu da ara yüzey potansiyel modüle ve o SRB-Pope (Şekil 5C) 26. PH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, floresan söndürülür (Şekil 6A) protonasyon durumunu değiştirir zar yüzeyi. Son olarak, normalleştirilmiş verileri PH-PI (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 6B, 6C). afinitesini belirlemek için bir bağlanma izoterm uyacak &lt;/ P&gt; Bu çalışmada, mikroakışkan bir platformda PIP içeren SLB&#39;lere proteinin bağlanmasını gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu protokol, okuyucuyu, mikroakışkan cihaz ve vezikül hazırlamadan SLB oluşumuna ve protein bağlamaya monte etmekten alıyor. Buna ek olarak, veri analizi için tarifi PLC δ1 PH-PI (4,5) P2 etkileşimi sağlanır için afinite bilgileri elde etmek.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Lamel < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cam Lameller: Dikdörtgenler</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, No. 1 1/2; Borosilikat Cam</td></tr><tr><td>7X Temizleme</td><td>Solüsyonu MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>Deterjan</td></tr><tr><td>PYREX Kristalleştirici Kap</td><td>Corning</td><td>3140-190</td><td>Düz tabanlı borosilikat cam tabak; Çap x Yükseklik (190 x 100 mm); Distribütör: VWR (89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td>Fırın</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polidimetilsiloksan (PDMS); Distribütör: Ellsworth Yapıştırıcılar</td></tr><tr><td>PYREX Kurutucu</td><td>VWR</td><td>89134-402</td><td>Vakum Anma Biyopsi</td></tr><tr><td>punch</td><td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core; 1.0 mm çap; Miltex Biyopsi Pistonlu Punch (Kat. No. 15110-10) alternatif olarak kullanılabilir</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazma Temizleme Sistemi</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>2 kademeli Doğrudan Tahrikli Yağ Vakum Pompası, O2 hizmeti (Krytox Ücretli)</td></tr><tr><td>Dijital Sıcak Plaka</td><td>Karşılaştırması</td><td>H3760-H</td><td>Denville Scientific aracılığıyla satın alındı (Cat. 1005640)</td></tr><tr><td>Buzlu Mikro Slaytlar</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>Buzlu, Seçilmiş ve Önceden Temizlenmiş; İsviçre camından yapılmış; Kalınlık: 1 mm; Boyutlar: 75 x 25 mm; GR 144</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>AutoCAD Autodesk</td><td>v.2016</td><td>Fotoğraf maskesi tasarımı için çizim yazılımı</td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Sanat Hizmetleri</td><td>N/A</td><td>Siyah arka plana ve net özelliklere sahip tasarım, CAD/Sanat Hizmetleri tarafından şeffaf bir maske (5 x 7 inç) üzerine 20k dpi çözünürlükte basılmıştır</td></tr>. <tr><td>Silikon Gofretler</td><td>Üniversite Gofret</td><td>1575</td><td>Prime Grade, Tek Tarafı Cilalı; 100 mm (4 inç) Çap; 525 um Kalınlık</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Yok</td><td>Negatif Tonlu Fotorezist; Penn State Nanofabrikasyon Tesisi Mülkiyeti</td></tr><tr><td>SU-8 Geliştirici</td><td>: MicroChem Corp.</td><td>N / A</td><td>Penn State Nanofabrikasyon Tesisi Mülkiyet</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4-fosfat</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfat</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850757C</td><td>POPE; oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Lissamine Rhodamine B Sülfonil Klorür (karışık izomerler)</td> sentezi için <td>gereklidirThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>oSRB-POPE</td></tr><tr><td>pH Duyarlı Floresan Lipid Probu (oSRB-POPE)</td> sentezi için gereklidir <td>Kurum</td><td></td> İçi <td>Kurum İçi Sentez (Huang D. et al. 2013)</td></tr><tr><td>Cam Sintilasyon Şişesi</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>20 mL hacim kapasitesi</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>Ultrasonik Su Banyosu</td></tr><tr><td>Çekirdek Parça Kazınmış Membranlar</td><td>Whatman</td><td>110605</td><td>Polikarbonat Membran; Çap: 25 mm; Gözenek Boyutu: 0.1 um; Distribütör: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td>HPLC sınıfı</td></tr><tr><td>LIPEX Ekstruder</td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Termobarrel Ekstruder</td></tr><tr><td>Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>Dinamik Işık Saçılımı; Penn State X-Işını Kristalografi Tesisi Property</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company<</td><td>strong>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Veri Analizi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td>v.6</td><td>Veri analizi için eğri uydurma yazılımı</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Epifloresan Mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi</td><td>N/A</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>AxioCam MRm Kamera</td><td>Carl Zeiss Mikroskobu</td><td>N/A</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>Işık Kaynağı</td></tr><tr><td>Alexa 568 Filtre Seti</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi</td><td>N/A</td><td>Ex/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Yazılım</td><td>Carl Zeiss Mikroskopi</td><td>N/A</td><td>Görüntü İşleme Yazılımı</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Diğer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>VWR</td><td>10034-132</td><td>200 uL pipet ucu; Protein solüsyonunu mikroakışkan kanala uygulamak için ince ve pürüzsüz uç</td></tr><tr><td>Uçlar</td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>10 uL pipet uçları; Vezikül çözeltisini mikroakışkan kanala uygulamak için ince ve pürüzsüz uç</td></tr><tr><td>Orion Star A321 pH metre</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA3210</td><td>pH metre</td></tr><tr><td>Orion mikro pH probu</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td>mikro pH probu</td></tr><tr><td>N- (2-Hidroksietil) -Piperazin-N'- (2-Etansülfonik Asit)</td> <td>VWR</td><td>VWRB30487</td><td>HEPES, Serbest Asit</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>VWR</td><td>BDH8014-2.5KGR</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Boru Müttefik</td><td>Tel ve Kablo</td><td>TFT-200-24 N</td><td>İç Çap: 0,020-0,026 inç (0,051-0,066 cm); Duvar Kalınlığı: 0.010 inç (0.025 cm); Esnek Politetrafloroetilen İnce Duvarlı Boru; Doğal Renk</td></tr><tr><td>Nitrojen Gazı - Endüstriyel</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Yerel Sağlayıcı</td></tr><tr><td>Oksijen Gazı - Endüstriyel</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Yerel Sağlayıcı</td></tr><tr><td>Sıvı Nitrojen</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Yerel Sağlayıcı</td></tr></tbody></table>

pip-on-a-chip: protein-fosfoinositid etkileşimlerinin etiketsiz bir Çalışması

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Çok sayıda hücresel protein, temel hücre proseslerini etkilemek için membran yüzeyleriyle etkileşir. Bu etkileşimler, spesifik subselüler lokalizasyon ve / veya aktivasyonu sağlamak için, fosfoinositidler (PIPs) durumunda olduğu gibi bir zar içerisinde spesifik bir lipid bileşenine yönlendirilebilir. PIP&#39;ler ve hücresel PIP bağlanma alanları, hücresel fizyolojideki rollerini daha iyi anlamak için kapsamlı olarak incelenmiştir. Protein-PIP etkileşimlerini incelemek için bir araç olarak desteklenen lipid bilayerlere (SLB&#39;ler) bir pH modülasyon testi uyguladık. Bu çalışmalarda, pH&#39;ye duyarlı orto- Sülohodamin B konjuge fosfatidiletanolamin, protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılmıştır. Bir proteinin bir PIP içeren membran yüzeyine bağlanmasının ardından ara yüzey potansiyeli, probun proton durumunu değiştirerek modüle edilir ( yani , yerel pH&#39;daki değişim). PH modülasyon tahlilinin başarılı bir şekilde kullanılmasına ilişkin bir vaka çalışması, fosfolipaz C delta1 PleckstrHomoloji (PLC-δ1 PH) etki alanı ve bir örnek olarak fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) etkileşim içinde. Bu etkileşim için görünür çözülme sabiti ( Kd , app ) , diğerleri tarafından elde edilen Kd , app değerlerine benzer olarak 0.39 ± 0.05 μM idi. Daha önce gözlemlendiği gibi, PLC-δ1 PH alanı, PI (4,5) P 2 spesifiktir, fosfatidilinositol 4-fosfata karşı daha zayıf bağlar ve saf fosfatidilkolin SLB&#39;ye bağlanma göstermez. PIP-on-a-chip testi, düşük örnek hacmi ve ligand / reseptör işaretleme gereksinimleri olmaksızın, geleneksel ve düşük PIP bağlanma deneyleri karşısında avantajlıdır, yüksek ve düşük afiniteli membran etkileşimlerini hem küçük hem de Büyük moleküller ve geliştirilmiş sinyal / gürültü oranı. Buna göre, çip üzerinde PIP&#39;in kullanılması, çok çeşitli membran etkileşim mekanizmalarının aydınlatılmasını kolaylaştıracaktır. Dahası, bu yöntem muhtemelenProteinlerin membranlarla etkileşime geçme kapasitesini modüle eden terapötiklerin belirlenmesinde sed.

Bir PIP-on-a-chip mikrocihazda içinde (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 1), PLC-δ1 PH-PI çalışma pH modülasyon deneyi kullanılmıştır. Ayrıntılı bir protokol aracılığıyla, mikroakışkan aygıt bileşenlerini hazırlamak ve bir araya getirmek, küçük tek katmanlı vezikülleri (SUV&#39;ler) yapmak ( Şekil 2 ), bir aygıt içinde SLB&#39;ler oluşturma ( Şekil 3 ) ve PIP içeren SLB&#39;lere protein bağlanmas...

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Çip üzerinde PIP testinin genel amacı, protein zarı etkileşimlerini kantitatif etiketsiz bir şekilde değerlendirmektir. Protein zarı etkileşimleri, hücrenin ve patojenlerinin pek çok sürecinin kalbidir, ancak bu etkileşimleri incelemek için teknikler azdır. Bu tekniğin avantajları, düşük basit hacim, membran etkileşimlerini fizyolojik olarak ilgili bir şekilde test etme yeteneği ile birlikte ligand veya reseptör etiketleme gereksinimi olmamasıdır.Virüslerin birçok terapötik hedefi zar proteinleridir, bu hedef proteinlerin çalışmaları genellikle deterjanlar kullanılarak çözelti içinde gerçekleştirilir. Tekniğimiz biyolojik olarak daha uygun bir alternatif sunuyor. Bu testin proteinlerin zarlarla etkileşimlerini izleyebildiğini görecek olsanız da, aslında oldukça çok yönlü bir testtir ve demir zarı, küçük molekül zarı ve hatta peptit zarı etkileşimlerini izlemek için kullanılabilir.Başlamak için, polidimetilsiloksan veya PDMS prepolimerini ve kürleme maddesini büyük bir plastik tartı teknesinde 10:1 oranında karıştırın. Karışımı, vakum kuvveti 500 tor veya daha az olacak şekilde bir saat boyunca vakumda gazdan arındırın. Aynı SU8 mikro modelinin birden fazla kopyasını içeren silikon master'ı büyük bir plastik tartı teknesine yerleştirin ve gaz giderme PDMS'sini dökün, ardından gece boyunca 60 santigrat derecede kuru bir fırında kürleyin.Ertesi gün, ellerinizi kullanarak PDMS'yi silikon ustasından nazikçe soyun. Cerrahi bir neşter ve bir cetvel kullanarak her mikro desenin sınırlarını dikdörtgenler halinde işaretleyin. Ardından, PDMS'yi bloklar halinde kesin, 1.0 milimetre çapında delikler açmak için her mikro kanalın her iki ucuna biyopsi zımbası ile 16 delik açın.Pipet, fosfatidilkolin, Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfat ve pH'a duyarlı floresan probu hacimlerini tek bir 20 mililitrelik cam ventilasyon şişesine pipetledi. Karışımı, kimyasal çeker ocak içindeki bir nitrojen gazı akışında 10 dakika veya çözücü buharlaşana ve şişenin dibinde ince lipit filmi oluşana kadar kurutun. Daha sonra, kalıntı organik çözücüyü çıkarmak için karışımı 10 militorluk bir vakum kuvvetinde en az üç saat vakum altında kurutun.Kurutulmuş lipit filmi beş mililitre çalışan tampon ile yeniden sulandırın, rehidre edilmiş lipiti oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 35 kilohertz çalışma frekansında ultrasonik bir banyoya yerleştirin. Tek laminer veziküller elde etmek için vezikül süspansiyonunu sıvı nitrojen ve 40 santigrat derece su banyosu ile dondurun, çözün. Donma çözülmesini 10 kez tekrarlayın, küçük unilaminar vezikülleri zenginleştirmek için bir lipit ekstrüder kullanarak vezikül süspansiyonunu 0.1 mikronluk bir iz kenarı polikarbonat membrana ekstrüde edin.Ekstrüzyonu 10 kez tekrarlayın. Bir su yıkama şişesi kullanarak deliklerden deiyonize su fışkırtarak PDMS bloğunun giriş ve çıkışlarında tıkanıklık olup olmadığını test edin, ardından PDMS bloğunu nitrojen gazı ile kurutun. Ardından, PDMS bloğunu ve önceden temizlenmiş kapak kızağını oksijen plazma sistemi numune odasının içine yerleştirin.75 watt'ta güç ayarları, dakikada 10 santimetreküp oksijen akış hızı ve 200 militor vakum gücü ile PDMS bloğunu ve kapak kızağını oksijen plazması ile 45 saniye boyunca maruz bırakın. Ardından, PDMS bloğunun desen yüzeyini, oksijen plazma işleminden hemen sonra kapak kızağı ile temas edecek şekilde yerleştirin. Temas bölgelerindeki hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe bastırın.Yapışmayı güçlendirmek için cihazı üç dakika boyunca 100 santigrat derecede düz bir sıcak plaka üzerine yerleştirin. Cihazın üstündeki ve altındaki toz parçacıklarını temizlemek için %100 etanol içeren ıslak, tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Ardından, cihazı bir cam mikroskop lamının üzerine bantlayın.Küçük unilaminar veziküller içeren 100 mikrolitre Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfatı 0.65 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6.4 mikrolitre 0.2 normal hidroklorik asit ekleyerek çözeltinin pH'ını yaklaşık 3/2'ye ayarlayın. pH ayarlı küçük unilaminar vezikül solüsyonundan 10 mikrolitre pipetleyin ve solüsyon çıkışa ulaşana kadar pipet boyunca basınç uygulayın.Ucu pipetten ayırın ve cihaza takılı bırakın. Bu adımı her kanal için tekrarladıktan sonra, cihazı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, cihaz montajından hemen sonra veziküllerin mikro kanallara enjeksiyonu yapılmalıdır. Bu arada, cımbız kullanarak giriş ve çıkış boru setlerini kesin, çıkış boru setini cihaza bağlayın ve ardından cihazı bir mikroskop aşamasına bantlayın.Giriş borusu setinin bir ucunu konik bir tüp içinde bulunan 25 mililitre çalışma tamponuna daldırın ve borunun sabitlendiğinden emin olmak için bantlayın. Bir laboratuvar jakı kullanarak, çözeltiyi yerçekimi akışı yoluyla mikro kanallardan itmek için konik boruyu cihazdan daha yüksek bir zemine yerleştirin. Her giriş tüpü için, borunun serbest ucundan bir mililitre çalışma tamponu çekmek için bir şırınga kullanın.Pipet ucunu girişten çıkarın ve giriş borusunun serbest ucunu cihaza yerleştirin. Tüm giriş borusu parçalarını cihaza bağlamak için bu işlemi tekrarlayın. Kanallar boyunca akan akan tampon, fazla yırtılmamış veziküllerin çıkarılmasına ve çift tabakanın deneysel koşullara dengelenmesine yardımcı olur.Ardından, mikroskop kontrol yazılımını açın. Sol panelde, mikroskop sekmesine tıklayın ve 10x objektifi seçin. Canlı yayına ve ardından araç çubuğundaki Alexa 568 görüntü simgelerine tıklayın, ince ve kaba ayar düğmelerini kullanarak mikro kanallara odaklanın.SLB'lerin ve kanalların kalitesini kontrol etmek için cihazı tarayın. Ardından, araç çubuğundaki FL deklanşör kapalı görüntü simgesine tıklayın, edinme sekmesine tıklayın ve temel ayarlamalar altında pozlama süresini seçin. Pozlama süresini 200 milisaniye olarak ayarlayın.Sol panelde, çok boyutlu edinime tıklayın. Filtreler menüsünde kırmızı kanalı seçin. Ardından, timelapse menüsüne tıklayın, zaman aralığını beş dakikaya, süreyi 30 dakikaya ve lapse menüsüne ayarlayın.Hesaplama sekmesinin altındaki daire aracını seçin ve herhangi bir kanalda bir daire çizin. Daire seçiliyken sağ tıklayın ve özellikler'i seçin. Profil sekmesi altında, floresan yoğunluğunu zamanın bir fonksiyonu olarak görüntülemek için tüm T'leri işaretleyin.Bir sonraki adıma geçmeden önce bu eğrinin dengeyi gösteren bir platoya ulaştığından emin olun, akışı durdurmak için tampon çözeltisini cihazla eşit bir zemine indirin. Her seferinde bir tane, her bir çıkış borusunu ayırın ve bir pipet kullanarak çıkış kanalına her protein seyreltmesinden 200 mikrolitre uygulayın. Herhangi bir baskı uygulamayın, işi yerçekiminin yapmasına izin verin.Ucu pipetten ayırın ve mikro akışkan cihaza bağlı bırakın. Bu işlemi her kanal için tekrarlayın ve bu işlem sırasında kanallara hava kabarcıklarının girmediğinden emin olun. Ardından, proteini mikro kanallardan akıtmaya başlamak için giriş borusunu mikroakışkan cihazın altındaki bir toprağa indirin.Borunun serbest ucunu bir atık kabına bantlayın. Pleckstrin homoloji alanının dilüsyonlarını 30 dakika boyunca akıtın. Yazılımın sol panelinde, timelapse sekmesi altında, tekrar görüntülemeye başlamak için başlat'a tıklayın.Burada gösterilen, mikro kanallar içinde SLB'ler içeren Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfatın temsili bir görünümüdür. Belirtilen konsantrasyonlarda pleckstrin homoloji alanını eklemeden önce ve sonra. Mikro kanallar boyunca taranan çizgiden gelen floresan yoğunlukları, fosfatidilkolin, Fosfatidilinositol 4 fosfat ve Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfat bağlama deneyleri için mesafe ve piksellerin bir fonksiyonu olarak çizilir.Daha sonra, bireysel deneylerden elde edilen bağlanma verilerini normalleştirmek, fosfolipaz C delta 1 pleckstrin homoloji alanı konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir ve görünür ilişkilendirme sabitlerini çıkarmak için bir bağlanma izoterimine uyar. Görünür ilişki sabitlerinin karşılaştırılması, fosfolipaz C Delta 1 pleckstrin homoloji alanının, beklendiği gibi spesifik olarak Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfat ile etkileşime girdiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, küçük unilaminar veziküllerin nasıl yapılacağını, mikroakışkan cihazların nasıl yapılacağını, bu mikroakışkan cihazların içinde protein zarı bağlanma etkileşimleriniz olarak desteklenen lipid çift katmanlarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, protein zarı bağlanmasının lipitlerin yanal difüzyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, hücrelerde bulunan lipitlerin bir araya getirilmesiyle protein zarı etkileşimlerini incelemenin yolunu açar, bu nedenle bu yaklaşım, protein zarı etkileşimlerinin biyokimyasını ve hücre biyolojisini geniş ölçüde etkileyecektir.

pip-on-chip-label-free-study-protein-phosphoinositide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, mikroakışkan platform adı verilen, desteklenen bir lipid çift tabakasının fosfatidiletanolamin lipidine etiketlenmiş pH'a duyarlı floresan boya kullanarak, pH modülasyon testini kullanarak mikroakışkan bir modelde protein-fosfoinositid etkileşimlerini gösteriyoruz. Proteinin fosfolipide bağlanmasından sonra pH'daki modülasyonlar floresan söndürmeye neden olur.

Protein-Fosfoinositid Etkileşimlerini Tespit Etmek için Desteklenen Lipid Çift Katmanları Üzerinde pH Modülasyon Testi

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

İletişim kuralı küçük molekül lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) ile arıtılmış hEAG1 iyon kanal protein etkileşimleri açıklar. Ölçüm BLI roman küçük molekül iyon kanal ligand tarama için potansiyel bir yöntem olabilir gösterir.

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

Bu protokol, inositol fosfatlar veya fosfoinositidler bağlayan proteinlerin tanımlanması üzerinde duruluyor. Bu etanol veya manyetik boncuklar için streptavidin üzerinden immobilize olan biyotinlenmiş inositol fosfatlar veya fosfoinositidler ile benzeşme Kromatografi kullanır. Inositol fosfat veya fosfoinositide bağlayıcı proteinler Batı lekesi veya kütle spektrometresi ile tanımlanır.

Inositol fosfat veya Phosphoinositide etkileşim proteinleri yakınlık Kromatografi Batı Blot veya kütle spektrometresi ile bağlantılı olarak tanımlanması

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Burada, endojen fosfoprotein fosfatazların ve bunların hücre ve dokulardan etkileşen proteinlerinin zenginleştirilmesi ve kütle spektrometrisine dayalı proteomiklerle tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz.

Fosfoprotein fosfatazları ve bunların interaktörlerini tanımlamak için kütle spektrometrisine dayalı bir yaklaşım

Eksojen hyaluronik asit (HA) ile yüksek çözünürlüklü kanser hücre etkileşimleri analiz olanak sağlayan yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Desenli yüzeyleri carbodiimide kimya ve microcontact baskı birleştirerek imal edilir.

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Keşfedin, PIP-on-a-chip yöntemiyle protein-fosfoinositid etkileşimlerini etiketsiz ve mikroakışkan platformda nicel olarak nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu teknik, biyolojik olarak daha alakalı bir alternatif sunar.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Daha fazla video keşfet