PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

Çip üzerinde PIP testinin genel amacı, protein zarı etkileşimlerini kantitatif etiketsiz bir şekilde değerlendirmektir. Protein zarı etkileşimleri, hücrenin ve patojenlerinin pek çok sürecinin kalbidir, ancak bu etkileşimleri incelemek için teknikler azdır. Bu tekniğin avantajları, düşük basit hacim, membran etkileşimlerini fizyolojik olarak ilgili bir şekilde test etme yeteneği ile birlikte ligand veya reseptör etiketleme gereksinimi olmamasıdır.

Virüslerin birçok terapötik hedefi zar proteinleridir, bu hedef proteinlerin çalışmaları genellikle deterjanlar kullanılarak çözelti içinde gerçekleştirilir. Tekniğimiz biyolojik olarak daha uygun bir alternatif sunuyor. Bu testin proteinlerin zarlarla etkileşimlerini izleyebildiğini görecek olsanız da, aslında oldukça çok yönlü bir testtir ve demir zarı, küçük molekül zarı ve hatta peptit zarı etkileşimlerini izlemek için kullanılabilir.

Başlamak için, polidimetilsiloksan veya PDMS prepolimerini ve kürleme maddesini büyük bir plastik tartı teknesinde 10:1 oranında karıştırın. Karışımı, vakum kuvveti 500 tor veya daha az olacak şekilde bir saat boyunca vakumda gazdan arındırın. Aynı SU8 mikro modelinin birden fazla kopyasını içeren silikon master'ı büyük bir plastik tartı teknesine yerleştirin ve gaz giderme PDMS'sini dökün, ardından gece boyunca 60 santigrat derecede kuru bir fırında kürleyin.

Ertesi gün, ellerinizi kullanarak PDMS'yi silikon ustasından nazikçe soyun. Cerrahi bir neşter ve bir cetvel kullanarak her mikro desenin sınırlarını dikdörtgenler halinde işaretleyin. Ardından, PDMS'yi bloklar halinde kesin, 1.0 milimetre çapında delikler açmak için her mikro kanalın her iki ucuna biyopsi zımbası ile 16 delik açın.

Pipet, fosfatidilkolin, Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfat ve pH'a duyarlı floresan probu hacimlerini tek bir 20 mililitrelik cam ventilasyon şişesine pipetledi. Karışımı, kimyasal çeker ocak içindeki bir nitrojen gazı akışında 10 dakika veya çözücü buharlaşana ve şişenin dibinde ince lipit filmi oluşana kadar kurutun. Daha sonra, kalıntı organik çözücüyü çıkarmak için karışımı 10 militorluk bir vakum kuvvetinde en az üç saat vakum altında kurutun.

Kurutulmuş lipit filmi beş mililitre çalışan tampon ile yeniden sulandırın, rehidre edilmiş lipiti oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 35 kilohertz çalışma frekansında ultrasonik bir banyoya yerleştirin. Tek laminer veziküller elde etmek için vezikül süspansiyonunu sıvı nitrojen ve 40 santigrat derece su banyosu ile dondurun, çözün. Donma çözülmesini 10 kez tekrarlayın, küçük unilaminar vezikülleri zenginleştirmek için bir lipit ekstrüder kullanarak vezikül süspansiyonunu 0.1 mikronluk bir iz kenarı polikarbonat membrana ekstrüde edin.

Ekstrüzyonu 10 kez tekrarlayın. Bir su yıkama şişesi kullanarak deliklerden deiyonize su fışkırtarak PDMS bloğunun giriş ve çıkışlarında tıkanıklık olup olmadığını test edin, ardından PDMS bloğunu nitrojen gazı ile kurutun. Ardından, PDMS bloğunu ve önceden temizlenmiş kapak kızağını oksijen plazma sistemi numune odasının içine yerleştirin.

75 watt'ta güç ayarları, dakikada 10 santimetreküp oksijen akış hızı ve 200 militor vakum gücü ile PDMS bloğunu ve kapak kızağını oksijen plazması ile 45 saniye boyunca maruz bırakın. Ardından, PDMS bloğunun desen yüzeyini, oksijen plazma işleminden hemen sonra kapak kızağı ile temas edecek şekilde yerleştirin. Temas bölgelerindeki hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe bastırın.

Yapışmayı güçlendirmek için cihazı üç dakika boyunca 100 santigrat derecede düz bir sıcak plaka üzerine yerleştirin. Cihazın üstündeki ve altındaki toz parçacıklarını temizlemek için %100 etanol içeren ıslak, tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Ardından, cihazı bir cam mikroskop lamının üzerine bantlayın.

Küçük unilaminar veziküller içeren 100 mikrolitre Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfatı 0.65 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6.4 mikrolitre 0.2 normal hidroklorik asit ekleyerek çözeltinin pH'ını yaklaşık 3/2'ye ayarlayın. pH ayarlı küçük unilaminar vezikül solüsyonundan 10 mikrolitre pipetleyin ve solüsyon çıkışa ulaşana kadar pipet boyunca basınç uygulayın.

Ucu pipetten ayırın ve cihaza takılı bırakın. Bu adımı her kanal için tekrarladıktan sonra, cihazı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, cihaz montajından hemen sonra veziküllerin mikro kanallara enjeksiyonu yapılmalıdır. Bu arada, cımbız kullanarak giriş ve çıkış boru setlerini kesin, çıkış boru setini cihaza bağlayın ve ardından cihazı bir mikroskop aşamasına bantlayın.

Giriş borusu setinin bir ucunu konik bir tüp içinde bulunan 25 mililitre çalışma tamponuna daldırın ve borunun sabitlendiğinden emin olmak için bantlayın. Bir laboratuvar jakı kullanarak, çözeltiyi yerçekimi akışı yoluyla mikro kanallardan itmek için konik boruyu cihazdan daha yüksek bir zemine yerleştirin. Her giriş tüpü için, borunun serbest ucundan bir mililitre çalışma tamponu çekmek için bir şırınga kullanın.

Pipet ucunu girişten çıkarın ve giriş borusunun serbest ucunu cihaza yerleştirin. Tüm giriş borusu parçalarını cihaza bağlamak için bu işlemi tekrarlayın. Kanallar boyunca akan akan tampon, fazla yırtılmamış veziküllerin çıkarılmasına ve çift tabakanın deneysel koşullara dengelenmesine yardımcı olur.

Ardından, mikroskop kontrol yazılımını açın. Sol panelde, mikroskop sekmesine tıklayın ve 10x objektifi seçin. Canlı yayına ve ardından araç çubuğundaki Alexa 568 görüntü simgelerine tıklayın, ince ve kaba ayar düğmelerini kullanarak mikro kanallara odaklanın.

SLB'lerin ve kanalların kalitesini kontrol etmek için cihazı tarayın. Ardından, araç çubuğundaki FL deklanşör kapalı görüntü simgesine tıklayın, edinme sekmesine tıklayın ve temel ayarlamalar altında pozlama süresini seçin. Pozlama süresini 200 milisaniye olarak ayarlayın.

Sol panelde, çok boyutlu edinime tıklayın. Filtreler menüsünde kırmızı kanalı seçin. Ardından, timelapse menüsüne tıklayın, zaman aralığını beş dakikaya, süreyi 30 dakikaya ve lapse menüsüne ayarlayın.

Hesaplama sekmesinin altındaki daire aracını seçin ve herhangi bir kanalda bir daire çizin. Daire seçiliyken sağ tıklayın ve özellikler'i seçin. Profil sekmesi altında, floresan yoğunluğunu zamanın bir fonksiyonu olarak görüntülemek için tüm T'leri işaretleyin.

Bir sonraki adıma geçmeden önce bu eğrinin dengeyi gösteren bir platoya ulaştığından emin olun, akışı durdurmak için tampon çözeltisini cihazla eşit bir zemine indirin. Her seferinde bir tane, her bir çıkış borusunu ayırın ve bir pipet kullanarak çıkış kanalına her protein seyreltmesinden 200 mikrolitre uygulayın. Herhangi bir baskı uygulamayın, işi yerçekiminin yapmasına izin verin.

Ucu pipetten ayırın ve mikro akışkan cihaza bağlı bırakın. Bu işlemi her kanal için tekrarlayın ve bu işlem sırasında kanallara hava kabarcıklarının girmediğinden emin olun. Ardından, proteini mikro kanallardan akıtmaya başlamak için giriş borusunu mikroakışkan cihazın altındaki bir toprağa indirin.

Borunun serbest ucunu bir atık kabına bantlayın. Pleckstrin homoloji alanının dilüsyonlarını 30 dakika boyunca akıtın. Yazılımın sol panelinde, timelapse sekmesi altında, tekrar görüntülemeye başlamak için başlat'a tıklayın.

Burada gösterilen, mikro kanallar içinde SLB'ler içeren Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfatın temsili bir görünümüdür. Belirtilen konsantrasyonlarda pleckstrin homoloji alanını eklemeden önce ve sonra. Mikro kanallar boyunca taranan çizgiden gelen floresan yoğunlukları, fosfatidilkolin, Fosfatidilinositol 4 fosfat ve Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfat bağlama deneyleri için mesafe ve piksellerin bir fonksiyonu olarak çizilir.

Daha sonra, bireysel deneylerden elde edilen bağlanma verilerini normalleştirmek, fosfolipaz C delta 1 pleckstrin homoloji alanı konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir ve görünür ilişkilendirme sabitlerini çıkarmak için bir bağlanma izoterimine uyar. Görünür ilişki sabitlerinin karşılaştırılması, fosfolipaz C Delta 1 pleckstrin homoloji alanının, beklendiği gibi spesifik olarak Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfat ile etkileşime girdiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, küçük unilaminar veziküllerin nasıl yapılacağını, mikroakışkan cihazların nasıl yapılacağını, bu mikroakışkan cihazların içinde protein zarı bağlanma etkileşimleriniz olarak desteklenen lipid çift katmanlarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, protein zarı bağlanmasının lipitlerin yanal difüzyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için foto ağartma sonrası floresan geri kazanımı gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, hücrelerde bulunan lipitlerin bir araya getirilmesiyle protein zarı etkileşimlerini incelemenin yolunu açar, bu nedenle bu yaklaşım, protein zarı etkileşimlerinin biyokimyasını ve hücre biyolojisini geniş ölçüde etkileyecektir.