3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

Bu prosedürün genel amacı, canlı kardiyomiyositlerde mikro RNA'nın boşluk bağlantısına bağlı transferini araştırmaktır. Bu yöntem, hücreler arası sinyal işlem sistemi için mikro RNA'nın rolünü ele almaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mikro RNA'nın boşluk bağlantı değişiminin, yüksek uzamsal zamansal çözünürlüğe sahip yaşam hücrelerinde görselleştirilebilmesidir.

Kardiyomiyositleri metin protokolüne göre izole ettikten sonra, hücreleri santimetre kare başına üç kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda altı oyuklu plaka üzerine yerleştirin. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, hücrelere 0.5 tripzin ekleyin ve hücreleri ayırmak için kültürleri beş dakika inkübe edin.

Hücre kültürü ortamı ekleyerek tripzini inaktive edin. Hücreleri saydıktan sonra, 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, hücreleri 100 mikrolitre başına 10 ila beşinci hücreye dört kez yeniden askıya almak için elektroporasyon tamponu kullanın.

Daha sonra, 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir tüpte floresan mikro RNA ile karıştırın ve karışımı bir elektroporasyon küvetine yükleyin. Ardından, elektroporatör üzerindeki G009 programını kullanarak elektroporasyon gerçekleştirin. 500 mikrolitre önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı ekleyin ve tüm hücre süspansiyonu hacmini dört kuyulu bir cam alt hazne slaytının bir kuyusuna aktarın.

Hücreleri bir gün boyunca 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksit atmosferinde kültürleyin. Mikroskop inkübatörünü önceden ısıttıktan ve konfüçyüs sistemini açtıktan sonra, hazne kızağını sahne numune tutucusuna yerleştirin. Transvekte kardiyomiyosit kümesini bulmak için 570 ila 680 nanometre algılama aralığına sahip, düşük lazer gücünde 1.4 na yağ objektifi ve 561 nanometre lazer uyarma ışığı kullanın.

Ardından, kurulum yöneticisinde z-yığını, zaman serisi, ağartma ve bölgeler düğmelerini etkinleştirin. Ardından, frap parametrelerini tanımlamak için, çekim modu menüsünde çerçeve boyutunu 512 x 512, satır adımını bire ve tarama süresini bir saniyeden daha kısa bir süreye ayarlayın. Kanallar menüsünde, yoğunluk doygunluğunu önlemek için minimum lazer uyarımından maksimum floresan elde etmek için lazer gücü, ofset ve kazanç ayarlarını yapın.

Ardından, iğne deliği boyutunu iki mikrometre olarak ayarlayın. Ardından, bölgeler menüsünde roy çizim aracını seçin ve hedef hücreyi, referans hücresini ve arka plan alanını işaretlemek için imleci kullanın. Gerekirse, foto ağartma için birkaç hedef hücre seçin.

Ağartma menüsünde, fotoğraf ağartma ayarlarını yapın. Ardından, z yığını menüsünde, hücrelerin kalınlığına bağlı olarak z yığını alma sınırlarını tanımlayın. Z katmanlarının sayısını 12 tp 15'e ayarlayın, ardından frap deneyini başlatın ve floresan geri kazanımını kaydedin.

Verileri analiz etmek için, mikroskoba özel yazılım kullanarak elde edilen z-yığınlarının maksimum projeksiyonunu oluşturun, işleme tıklayın, maksimum yoğunluk projeksiyonu, dosya seçin, uygulayın. Son olarak, hedeften, arka plandan ve referans hücresinden gelen tüm zaman noktalarındaki floresan yoğunluğu verilerini bir elektronik tabloya kopyalayın ve metin protokolüne göre veri analizi yapın. Burada gösterilenler, hücreden hücreye sınırlar boyunca tipik çizgili alfa aktinin paterni ve büyük konneksin43 plakları ile izole kardiyomiyositlerdir.

Kültürde bazı kardiyomiyosit olmayanlar mevcuttu. Burada görüldüğü gibi akım sitometrisi ile %45'lik bir transveksiyon verimine ulaşılmıştır. Ek olarak, canlı ölü bir makale, hücrelerin çoğunun, boşluk kavşak iletişimini analiz ederken önemli olan yüksek canlılık gösterdiğini ortaya koydu.

Frap analizi için, hedef hücreler bir hücre kümesi içinde seçilir ve %100 lazer gücüyle foto ağartılır, bu da seçilen hücrelerde mikro RNA floresansının azalmasına yol açar. Elde edilen verilerin kantitatif analizi ve normalleştirilmesi, ortalama %20'lik bir iyileşme gösterdiBu deneyde, siRNA'nın aracılık ettiği connexin43'ün yıkılması, protein ekspresyonunun azalmasına ve boşluk bağlantı iletişiminin inhibisyonuna yol açtı. Floresan geri kazanımı %50'den fazla azaltıldıBu, miro RNA transferinin verimliliğinin, hücreler arasındaki boşluk, bağlantı, eşleşme ile güçlü bir şekilde bağlı olduğunu gösterir.

Bu şekil, bir frap deneyinin 3B yüzey görüntüsünü göstermektedir. Maksimum projeksiyonlarla karşılaştırıldığında, z-yığınlarının elde edilmesi, hücreler içindeki mikro RNA'nın lokalizasyonunu ve hareketliliğini araştırmak için 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak için kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde yapılırsa frap ölçümleri iki ila üç saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, benzer sayıda komşu hücreye sahip hedef hücreleri seçmek önemlidir. Ayrıca, beyazlatma parametrelerim ve görüntü elde etme koşullarım fototoksik etkilerden kaçınmak için seçilmelidir. Bu videoyu izledikten sonra, mikro RNA'nın hücresel kümeler içindeki hareketini ölçmek ve görselleştirmek için frap mikroskobunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.