Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS

Bu yöntemin genel amacı, bileşiklerin HDAC inhibitör potansiyelini belirlemek ve tek bir ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi kütle spektrometresi testi kullanarak hücrelerde HDAC6 veya HDAC1'e karşı seçiciliği belirlemektir. Bu yöntem, bir HDAC inhibitörünün canlı hücrelerde Sınıf I HDAC'lere göre HDAC6 için seçici olup olmadığının belirlenmesi gibi ilaç keşif alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, aynı anda iki HDAC izoformuna karşı gücü belirlemek için hücreler, inhibitörler ve seçici substratlar ile tek bir inkübasyon adımı gerektirmesidir.

Bu tekniğin anlamı, seçici HDAC inhibitörlerinin erken ilaç keşfine kadar uzanır, çünkü endojen protein asetilasyon deneylerinden kaçınarak canlı hücrelerde HDAC6 seçiciliğinin korunup korunmadığını tespit eder. Bu yöntem, HeLa hücrelerinde HDAC inhibitörlerinin seçiciliğini değerlendirse de, klinik örnekler de dahil olmak üzere primer ve diğer tümör hücreleri gibi diğer hücre hatlarına da uygulanabilir. %10 fetal sığır serumu, penisilin G ve streptomisin ile desteklenmiş minimal esansiyel ortamda bir T75 hücre kültürü şişesinde HeLa hücrelerini% 80'e kadar kültürleyin.

Hücreleri beş mililitre Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu ile iki kez yıkayın. Ardından, tamponu aspire edin ve bir mililitre hücre ayrışma reaktifi ekleyin. Hücreleri ayırmak için 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, hücrelere dokuz mililitre MEM kültür ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu iyice yeniden süspanse edin. Hücreleri 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve ardından bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunun yoğunluğunu MEM'de mililitre başına 60.000 hücreye ayarlayın.

Daha sonra, steril, düz tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu plakanın kontrol ve test kuyularına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Ardından, 96 kuyulu plakanın boş kuyularına 100 mikrolitre MEM kültür ortamı ekleyin. 96 oyuklu plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

96 kuyulu plakanın kuyularının ortamını aspire edin. Ortamı aspire ederken, hücreleri kuyudan ayırmaktan ve çıkarmaktan kaçının. Bu, düşük bir aspirasyon hızı kullanılarak ve aspirasyon uçlarını kuyu yüzeyinin alt köşesine dikkatlice yerleştirerek elde edilebilir.

Daha sonra, Trichostatin A, MS275 ve Tubastatin A dahil olmak üzere test kuyularına MEM'deki iki kez test bileşiğinin 25 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra, kontrol ve test kuyularına 25 mikrolitre substrat karışımı ekleyin. Ardından, boş kuyucuklara 25 mikrolitre MEM ekleyin.

96 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe sekiz saat inkübe edin. Hücre lizizini gerçekleştirmek için, önce 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna proteaz inhibitörü ile takviye edilmiş altı kez RIPA tamponunun 10 mikrolitresini ekleyin. Her oyuğa 160 mikrolitre soğuk asetonitril ekleyerek reaksiyonu durdurun ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Plakayı 10 dakika boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun. Plakayı dondurucudan çıkarın ve her bir oyuklu içeriğin 220 mikrolitresini steril olmayan, konik tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı 10 dakika boyunca 5.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, 200 mikrolitre süpernatanı UHPLC sistemi ile uyumlu 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Ardından, bir plaka kapatıcı kullanarak plakayı soyulabilir ısıyla yapıştırma folyosu ile kapatın. Ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi kütle spektrometresi sistemini mobil faz sistemi ile doldurarak hazırlayınız.

96 oyuklu plakayı, bir plaka tutucu içeren bir numune yöneticisine yerleştirin. Örnekleri metinde bulunan UHPLC ESI MS/MS koşullarına göre çalıştırın. Veri analizi yapmak için, her bir alt tabakanın tepe alanını ve deasetillenmiş ürününü uygun UHPLC entegrasyon yazılımı ile entegre edin.

Her bir substrat için, her bir kromatogramda deasetillenmiş ve asetillenmiş tepe alanı oranını hesaplayın. Test ve kontrol örneklerini dahil edin. Son olarak, metin protokolündeki denkleme göre her bir test örneğinin HDAC inhibisyonu yüzdesini hesaplayın.

Bir numunenin UHPLC-MS kromatogramı burada sunulmaktadır. Hücrelere eklenen substratlara karşılık gelen tepe noktaları, yazılı protokolün birinci tablosunda anlatıldığı gibi kütle geçişlerine göre tespit edilir. MOCPAC, deasetillenmiş MOCPAC zirvesini sağlamak için HDAC1 tarafından deasetillenir.

Benzer şekilde, BATCP, deasetillenmiş BATCP zirvesini sağlamak için HDAC6 tarafından deasetillenir. Son olarak, MAL, spesifik olmayan bir şekilde birkaç endojen HDAC'ın deasetilasyonunu yansıtan deasetillenmiş MAL zirvesini sağlar. Burada, HDAC inhibitörü Trichostatin A'nın farklı konsantrasyonları ile elde edilen kromatogramlı şekil, standart HDAC inhibitörlerinin doz yanıt değerlendirmesi yapılmıştır.

MOCPAC ve dMOCPAC'tan elde edilen entegre değerler, standart inhibitörlerin HDAC1'e karşı gücünü hesaplamak için kullanıldı. IC 50 hesaplamalarını takiben, seçici bir Sınıf I HDAC inhibitörü olan MS275, HDAC1 için bilinen bir HDAC6 inhibitörü olan Tubastatin A'dan daha düşük IC 50 değerleri gösterdi. Öte yandan, standartların HDAC6'ya karşı gücünü hesaplamak için BATCP ve dBATCP'den izole edilmiş değerler kullanıldı.

Bu kez, Tubastatin A, MS275'ten daha düşük bir IC 50 değeri sağladı ve izoform seçicilik profilini doğruladı. Trichostatin A, güçlü, seçici olmayan bir inhibitördür. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hücre tedavi süresi ve 96 oyuklu plakanın analizi de dahil olmak üzere uygun şekilde gerçekleştirilirse 72 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, burada belirtilen inkübasyon sürelerinin HeLa hücreleri için olduğunu hatırlamak önemlidir. Başka bir hücre hattı kullanılıyorsa, bunun optimize edilmesi gerekir. Bu prosedürü takiben, diğer izoformların seçici HDAC inhibitör aktivitesi, spesifik substratlar mevcut olduğu sürece ölçülebilir.

Organik çözücüler ve diğer kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmesi gerektiğini unutmayın.