Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı Utero'da Elektroporasyon

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Bu prosedürün genel amacı, elektroporasyonlu embriyonik beyinden hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile hazırlanan organotipik dilim kültüründe radyal olarak göç eden nöronları doğrudan gözlemlemektir. Bu yöntem, neokorteks gelişiminin temel yönlerini incelemeye yardımcı olabilir. Nöron polarizasyonunda yer alan moleküler mekanizmaların araştırılmasına ve nöronların beyindeki son konumlarına radyal göçüne izin verir.

Bu tekniğin temel avantajı, göç eden nöronların dinamik özelliklerinin, hız profilleri, ortalama göç hızı ve göç yönündeki değişiklikler dahil olmak üzere analiz edilebilmesidir. Uygun şekilde anestezi uygulanmış bir hamile fareyi sırtüstü pozisyonda bir ısıtma plakasına yerleştirerek başlayın. Pedal refleksinin olup olmadığını kontrol edin.

Ardından, kurumasını önlemek için gözleri dikkatlice vazelin ile örtün. Daha sonra, uzuvları nazikçe açın ve cerrahi bantla ısıtma plakasına sabitleyin. % 70 etanol ve ardından iyot çözeltisi ile bezlenerek karnı sterilize edin, ardından karın kesisi için bir kesi yapılan steril gazlı bezi karın üzerine yerleştirin.

Gazlı bezi bakteriyostatik sodyum klorür çözeltisi ile nemlendirin. Cerrahi anestezinin gelişimini yeniden değerlendirdikten sonra, pedal refleksini kaybederek, cildi karın orta hattı boyunca yaklaşık 1,5 santimetre kesmek için tırtıklı mikro Adson forseps ve açılı ince makas kullanın. Ardından, alttaki kası linea alba boyunca kesin.

Rahim boynuzunu halka forseps ile embriyolar arasında kavrayın ve plasentaları veya besleme damarlarını rahatsız etmeden nemlendirilmiş gazlı bezin üzerine nazikçe yerleştirin. Ardından, sagital sinüse paralel hilal şeklinde bir gölge olarak görünen lateral ventrikülün net bir görüntüsünü vermek için bir embriyoyu dikkatlice yerleştirin. Enjeksiyon bölgesi, pigmentli göz ile sagital sinüsün iki transfer sinüsüne dallandığı sinüslerin birleştiği yer arasındaki bir çizginin ortasında yer alır.

Tanımlandıktan sonra, mikroenjeksiyon iğnesini rahim duvarından ve lateral ventriküle itin. Daha sonra, beş ila 10 darbeli bir ila iki mikrolitre DNA çözeltisi enjekte etmek için ayak pedalıyla çalıştırılan bir mikroenjektör kullanın. Başarılı enjeksiyon, ventriküler sistemi doldurması gereken renkli DNA çözeltisi ile izlenebilir.

Daha sonra, cımbız tipi elektrotları, pozitif terminal enjekte edilen ventrikül ile aynı tarafta olacak ve negatif terminal, enjekte edilen ventrikülün karşı tarafında, embriyonun başının kulağının altında olacak şekilde yerleştirin. Elektroporasyon bölgesini birkaç damla bakteriyostatik sodyum klorür çözeltisi ile nemlendirin ve 950 milisaniye aralıklarla 50 milisaniye süreli beş elektrik akımı darbesi uygulayın. Negatif elektrottaki kabarcıklar elektrik akımını gösterir.

Başarılı bir elektroporasyon için genellikle 60 ila 90 miliamper yeterlidir. Daha düşük akımlar nöronları verimli bir şekilde transfekte edemezken, daha yüksek akımlar embriyonik ölüme yol açabilir. İlk uterus boynuzunun her embriyosu için prosedürü tekrarladıktan sonra, yavaşça karın boşluğuna geri yerleştirin.

Kas tabakasını ve cildi diktikten sonra, iyot çözeltisi ile dikkatlice dezenfekte edin ve selüloz bezleri kullanarak vazelini gözlerden nazikçe çıkarın. Fareyi uyanana kadar kızılötesi lambanın altına yerleştirin. Hamile kadını onaylanmış bir yöntemle ötenazi yaptıktan sonra, embriyoları içeren rahmi çıkarın ve buz gibi tam HBSS ile 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Bu noktadan itibaren tüm solüsyonları, embriyoları ve beyinleri buz üzerinde tutun. Stereomikroskop altında çalışırken, her embriyoyu rahimden ayırmak için ince uçlu forseps ve bir çift Vannas Tübingen yaylı makas kullanın. Embriyoları buz gibi tam HBSS içeren başka bir Petri kabına aktarın.

Beyin sapı seviyesinde bir kesi yapın ve sagital orta hat boyunca kesin. Beyni kaplayan cildi ve kıkırdağı soyun. Daha sonra yarım kürelerin hemen arkasındaki beyin sapını kesin ve beyni kafatasından çıkarın.

Beyni bir mikro kaşık spatula ile buz gibi tam HBSS içeren 12 oyuklu bir plakaya aktarın. Tüm beyinleri 12 oyuklu plakadaki çöpten toplayın. Daha sonra, floresan parlaklığının yanı sıra elektroporasyonlu bölgenin boyutu için 12 oyuklu plakadaki beyinleri taramak için bir floresan stereomikroskop kullanın.

Daha fazla işlem için parlak floresan sinyalleri ve varsayımsal somatosensoriyel korteksi olan iki ila dört beyin seçin. Ardından, erimiş %3 düşük erime noktalı agaroz solüsyonunu soyulabilir tek kullanımlık bir gömme kalıbına dökün. Beyni 12 oyuklu plakadan çıkarmak için bir mikro kaşık spatula kullanın ve ince kağıt mendil kullanarak beynin etrafındaki fazla HBSS'yi dikkatlice boşaltın.

Beyni nazikçe agaroz çözeltisine yerleştirin. Ardından, kalıbın altına itmek için 20 gauge bir iğne kullanın ve konumunu dikkatlice ayarlayın. Koronal bölümler için, beyni koku ampulleri yukarı bakacak şekilde yönlendirin.

Agaroz çözeltisi katılaşana kadar kalıbı buz üzerinde tutun, ardından beyni bölümlere ayırmaya devam edin. Beynin etrafındaki fazla agarozu kesmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanın ve iki ila üç milimetre agarozun bırakılması gereken koku soğancıkları dışında her tarafta yaklaşık bir milimetre agaroz bırakın. Bir numuneye az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcısı uyguladıktan sonra, kesilmiş agaroz bloğunu koku ampulleri aşağı bakacak şekilde sabitleyin.

Numune aşamasını, buz gibi tam HBSS içeren titreşimli bir bıçak mikrotomunun dilimleme odasına aktarın ve beyni sırt tarafı bıçağa doğru olacak şekilde konumlandırın. Düşük ila orta genlikli ve çok yavaş bir kesit hızı ile elektroporasyonlu bölgeyi içeren 250 mikron kalınlığında beyin dilimleri kesin. Genellikle, başarılı bir şekilde elektropore edilmiş beyinden parlak floresan sinyalli dört ila altı dilim elde edilir.

Bir bölümün agaroz kenarını ince uçlu forseps ile kavrayın ve dilimi bükülmüş bir mikro kaşık spatula üzerine çekin. Bu şekilde, beyin dilimlerini buz gibi soğuk tam HBSS içeren altı oyuklu bir plakaya dikkatlice aktarın. Laminin kaplı membran eklerini 100 mikrolitre tam HBSS ile nemlendirin.

Ardından, bükülmüş mikro kaşık spatula ve forseps kullanarak dilimleri dikkatlice zarların üzerine aktarın. Dilimi spatuladan yavaşça zarın üzerine itin, ardından forseps kullanarak yerleştirin. Kalan dilimleri aktarmaya devam edin.

Bir membran ekine en fazla beş dilim yerleştirilebilir. Fazla tam HBSS'yi bir pipetle çıkarın. Daha sonra, forseps yardımıyla, zar eklerini dilimlerle birlikte 1.8 mililitre dilimlenmiş kültür ortamı içeren altı oyuklu bir plakaya dikkatlice yerleştirin.

Dilimleri ters çevrilmiş bir mikroskopla görüntüleyerek görüntüleme için bir beyin dilimi seçin. Üst SVZ'de, dilimin yığın yüzeyine radyal olarak göç eden parlak tek nöronlara sahip bir dilim seçin. Tüm eşlenik plakayı kaplayan radyal glial hücrelerin ince floresan işlemlerinin varlığı, göç eden eşlenik nöronlar tarafından kullanılan sağlam bir radyal glial iskeleyi gösterir.

Membran ekini seçilen bir dilim ile iki mililitre dilim kültürü ortamı içeren 50 milimetre çapında cam tabanlı bir tabağa aktarın. Çanağı konfokal mikroskobun iklim odasına yerleştirin. Çözünürlüğü 512 x 512 piksel olarak ayarlayın.

Kare hızını saniyede yaklaşık 1,4 kareden yaklaşık 2,5 kareye çıkarmak için tarama hızını 400 hertz'den 700 hertz'e yükseltin. Ortalama olarak en fazla iki kez kullanın. 1,5 mikronluk adım boyutuna sahip elektroporasyonlu bölge boyunca bir Z-yığını tanımlayın.

Her 30 dakikada bir Z-yığını alarak hızlandırılmış seriye başlayın. Açıklanan ayarlar, çekim sırasında fotoğraf hasarını düşük tutarken görüntünün yeterli çözünürlüğünü ve parlaklığını sağlar. Bu film, ventriküler subventrikal bölgelerden kortikal plakaya göç eden E16.5 kortikal nöronları göstermektedir.

Bcl11a'da, embriyonik gün 14.5'te IRES-GFP kontrol plazmidinin elektroporasyonundan sonra floklanmış koşullu transgenik. Film, saniyede beş kare hızında 108 kareden oluşuyor. Ölçek çubuğu 100 mikronu temsil eder.

Cre-IRES-GFP içeren bir DNA plazmit vektörünün elektroporasyonu, koşullu Bcl11a floxlu beyinlerde kortikal nöron göçünü etkiledi. Burada görüldüğü gibi, çok az sayıda nöron, kortikal plakaya ulaşmak için ara bölgeyi geçer. Bu film, soldaki GFP etiketli bir kontrolden gelen kortikal nöronların, sağdaki bir Bcl11a mutantından gelen nöronlara kıyasla polarizasyonunu göstermektedir.

Bcl11a mutant nöronlarındaki bu animasyonlu temsili kontrol izleri, bir saatlik aralıklı çözünürlüğe sahip hızlandırılmış E16.5 dilim kültür serilerinden elde edildi. Yine kontrol beyninden gelen veriler solda, Cre-IRES-GFP elektroporasyonlu beyinden gelen veriler ise sağda gösterilmektedir. Kontrol ve Bcl11a mutant dilim kültürlerinden elde edilen bu temsili izler koleksiyonundan görüldüğü gibi, Bcl11a mutant nöronları sıklıkla, kırmızı ok uçlarıyla işaretlendiği gibi, düşük göç hızı ve rastgele değişen yönelimin tekrarlayan aşamalarına uğrar.

Hız profilleri, göç eden nöronların izlerinden hesaplanabilir. Burada görüldüğü gibi, Bcl11a mutant nöronlarının daha büyük bir kısmı, kontrollere kıyasla daha yavaş göç hızlarına sahiptir. Sapma açısı, izleme verilerinden hesaplanabilir.

Bu histogramdan görüldüğü gibi, siyah çubuklarla temsil edilen Bcl11a mutant nöronları, kontrollere kıyasla daha büyük sapma açıları sergiler. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, utero elektroporasyon ve organotipik beyin dilimi kültürünün hazırlanması için her biri iki saatten daha kısa sürede yapılabilir. Bu prosedür, vasküler deneylerin yanı sıra fonksiyon kazanımı ve kaybı ile radyal olarak göç eden kortikal nöronlarda ilgilenilen genlerin fraksiyonel analizini yapmak için kolayca uyarlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, elektroporasyonlu embriyonik beyinlerden hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile hazırlanan organotipik dilim kültüründe radyal olarak göç eden nöronları doğrudan nasıl gözlemleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.