Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil
5 Kasım 2017
Ada tahlil Drosophila melanogastertemel Lokomotor davranışını değerlendirmek için kullanılan nispeten yeni, düşük maliyetli bir tahlil olduğunu. Bu el yazması için otomatik veri işleme ve ada tahlil veri, bu hassas, yüksek üretilen iş göstergesi büyük genetik veya farmakolojik ekranlar için tahlil yaparken objektif miktar algoritmaları açıklar.
Ada Deneyi'nin genel amacı, otomatik veri işleme ve objektif nicelleştirme yoluyla Drosophila melanogaster'in temel lokomotor davranışını değerlendirmektir. Bu yöntem, hareket bozukluklarıyla ilişkili genler gibi lokomotor davranışın temel düzenleyicilerini belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu tür kusurları tersine çevirebilecek ilaçları test etmek için de kullanılabilir.
Bu tekniğin temel avantajı, Drosophila lokomotor davranışının yüksek kapasiteli kantifikasyonuna olanak sağlamasıdır ve bu durum tekniği geniş ölçekli taramalar için uygun hale getirir. Çok sayıda hastalık modelini analiz edebilmek amacıyla bu metodolojiyi geliştirmeye karar verdik. Bunu mümkün kılmak için otomatikleştirilmiş görüntü verisi analizine ihtiyaç duyuyorduk.
Bu yöntemin görsel gösterimi oldukça faydalıdır. Beta işlemenin birkaç adımı kritik öneme sahiptir ve özellikle kullanılan yazılım paketlerine aşina olmayan yeni kullanıcılar için zor olabilir. İlk olarak, biyolojik tekrarlar olarak her deneysel koşul için en az üç tüp hazırlayın.
Her bir dosya yaklaşık 15 adet aynı cinsiyetten ve benzer yaştaki sinek içermelidir. Önemli olan, sineklerin kanatlarının sağlam olmasıdır. Deneyleri saklamak için klasörleri oluşturun.
Bunları, koşullar ve tekrarlar tarafından tanımlanan bir dizin yapısında oluşturun. Örneğin, deney iki genotipe ve her biri için beş tekrara sahipse, deney tarihini içeren bir ana klasör oluşturun ve bu klasörün içinde her genotip için bir alt klasör oluşturun. Ardından, genotip klasörlerinin içinde her tekrar için alt klasörler oluşturun.
Ardından, test düzeneğini kurun. Banyo tepsisine az miktarda sabun içeren soğuk su ekleyin ve platform henüz sabitlenmemişse, platformu banyonun ortasına yerleştirin. Tepsiyi ve platformu şeffaf bir kutu ile kapatın.
Platformu aydınlatmak için, sıradan 12 volt LED'ler gibi soğuk bir lambayı üzerine yerleştirin. Ayrıca, bir bilgisayara bağlı olan bir web kamerasını doğrudan platformun üzerine konumlandırın. Bilgisayarda, görüntü kayıt yazılımını açın.
Menü sisteminden, yakalama cihazı olarak uygun web kamerasını seçin. Video ayarlarını düzenlemek için adacığa ölü bir sinek yerleştirin. Ölü sineğin beyaz bir arka plan üzerinde siyah görünmesi için yazılımdaki parlaklık, kontrast ve renk ayarlarını optimize edin.
Ardından, time-lapse video kurulumunu videoları AVI dosyaları olarak kaydedecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, verilerin kaydedileceği dizine gidin ve videonun adını belirleyin. Bu değişiklikleri kaydedin.
Görüntü verilerinin sıkıştırılması için Intel IYUV kodunu seçin. Kayıt hızını her 0,1 saniyede bir kare olarak ayarlayın ve buna karşılık gelen oynatma hızını saniyede 10 görüntü olarak düzenleyin. Son olarak, gelişmiş ayarlar kısmına giderek Yakalanan her kare için bir bmp görüntüsü oluştur seçeneğini işaretleyin.
Ardından, AVI dosyalarını barındırmak için seçtiğiniz dizine gidin ve tamam'a tıklayın. Başlamadan önce, adacığın boş ve temiz olduğundan emin olun. Daha sonra, görüntü kayıt yazılımının zaman atlamalı görüntü arayüzünde kaydı başlatın.
Sineklerin bulunduğu bir flakonu alın ve tüm sineklerin dibe çökmesi için iki veya üç kez vurun. Ardından, flakonun tıpasını hızlıca çıkarın ve sinekleri platformun üzerine kuvvetlice vurun. Sineklerin tamamı platforma yaklaşık olarak aynı anda düşmelidir.
Sineklerin platformdan ayrılması için 30 saniyeye kadar süre tanıyın, ardından kaydı durdurun. Gerekiyorsa, platformda kalan sinekleri manuel olarak uzaklaştırın. Bir sonraki deneye geçmeden önce, bir sonraki veri setinin kaydedileceği dizini yeniden tanımladığınızdan emin olun.
İlk görev, toplanan görüntü serilerinin yığınlarını ve projeksiyonlarını oluşturmaktır. Fiji'de, Drosophila Island Assay'i açın. Yeni pencerede, ilk görüntü zaman serisi tanımlayıcısını girin.
Ardından, yalnızca "create stack and projection" (yığın ve projeksiyon oluşturma) alt makrosunu seçin. Tamam'a tıklayın ve bilgisayarı, bireysel Ada Deneyi (Island Assay) deneylerini içeren tüm alt klasörlerin bulunduğu klasöre yönlendirin. Veriler işlendikten sonra, her bir bireysel deney alt klasöründe iki yeni dosya görünecektir.
Sıradaki görev, platformun görüntülerdeki tam konumunu tanımlamaktır. Grafik arayüzünü açın ve platformu tanımla onay kutusunu seçin. Ardından, deneysel alt klasörlerin saklandığı dizini seçin.
İzdüşüm görüntüsü ve iki pencere açılacaktır. İlk görüntüde, çokgen seçim aracını kullanarak ada peronunun üzerine bir çokgen çizin. Bu seçimde, peron parametresindeki sınır hattına yer vermeyin.
ROI yönetici penceresindeki ekle butonuna tıklayarak seçimi ROI yönetici penceresine ekleyin. Seçim ROI yöneticiye eklendikten sonra bir değerler kümesi olarak görünecektir. Ardından, platformu tanımla penceresindeki tamam butonuna tıklayın.
Yazılım, klasörde kayıtlı olan bir sonraki projeksiyon görüntüsüne geçecektir. ROI yöneticisinde kayıtlı olan ROI'yi seçerek ve platformu tanımla penceresinde bu ROI'yi onaylayarak, platform için aynı ROI'yi bir sonraki projeksiyon görüntüsüne uygulamaya devam edin. Bir sonraki projeksiyon görüntüsüne geçmeden önce, platformun deney sırasında hareket etmediğinden emin olun.
Platformun konumu değiştiyse, seçimin merkezine sol tıklayın ve onu istenen konuma sürükleyin. Eğer seçim kutusu platformla eşleşmiyorsa, seçimin dışına sol tıklayın ve poligon aracını kullanarak platform için yeni bir seçim alanı belirleyin. Bu yeni seçimi ROI yöneticisine ekleyin.
Ardından, platform tanımlama penceresindeki tamam butonuna tıklayarak yeni seçimi doğrulayın ve tüm görüntüler için platformlar uygun şekilde tanımlanana kadar işleme devam edin. Verileri işlemden önce yapılması gereken son görev, bir sinek için minimum boyutu tanımlamaktır. Bu işlem metin protokolünde açıklanmıştır.
Platformdan kaçan sinekleri nicelendirmek için öncelikle minimum sinek boyutunu belirleyin. Ardından, deneysel seri içindeki bir dosyada bulunan en fazla sinek sayısını belirtin. Analiz fonksiyonunu başlatın ve istem geldiğinde deney için ana dizini seçin.
Makroyu çalıştırdıktan sonra, her klasörde yeni bir sonuç dosyasının ve yeni bir görüntü yığınının belirdiğini gözlemleyin. İşlemin doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için bu dosyaları açın. Tüm deneyleri eş zamanlı olarak işlemek için R veya RStudio yazılım paketini başlatın ve Ada Deneyi analiz betiğini açın.
Analizin başarılı olması için betiğin doğru şekilde düzenlenmesi gerekir. Betiğin 16. satırına, analiz edilecek deneyleri içeren ana dizinin yolunu ekleyin. Analiz çıktı dosyalarının saklanacağı klasörün yolunu ise 19. satıra ekleyin.
İkincisi, analiz edilecek görüntü verilerini içeren dizinden farklı bir konum olmalıdır. Şimdi, araç çubuğundan betiği çalıştırın ve sonuçların analizine geçin. Island Assay analizi betiği, her bir deneysel koşul için bir çizgi grafiği dışa aktarır.
Grafik, söz konusu koşulun her bir tekrarı için platformda kalan sineklerin zaman içindeki yüzdesini göstermektedir. Dışa aktarılan çizgi grafiği (escape response:all conditions), ana klasörde yer alan ilk 12 deneysel koşul için ortalama uçuş kaçış yanıtını ve ortalama standart hatasını özetlemektedir. Deneysel koşulların birbirinden anlamlı şekilde farklılaşıp farklılaşmadığını belirlemek için her bir deneysel tekrarın eğri altındaki alanı hesaplanır.
Her bir deneysel durum için eğri altındaki alan ve medyan değer bir grafik olarak dışa aktarılır. Ana klasördeki durum sayısına bağlı olarak, betik iki durum için iki kuyruklu eşleşmemiş Welch T-testi veya ikiden fazla durum için Tukey düzeltmeli ANOVA gerçekleştirir. Island Assay analizi betiği tarafından hesaplanan tüm sayısal veriler ayrıca dışa aktarılır ve veri çıktı klasörüne csv veya txt dosyaları olarak kaydedilir.
Ataksi telangiektazi, ATM genindeki mutasyonlar nedeniyle ortaya çıkan otozomal resesif bir hareket bozukluğudur. Hastalık, serebellar ataksiyi erken başlangıçlı olmasıyla karakterize edilir. ATM'nin sinek ortologunun her yerde susturulmasının etkisi Ada Deneyi (Island Assay) ile incelenmiş ve kontrollerle karşılaştırılmıştır.
Genel olarak, sinek ATM ortaloğu olan Tefu'nun yaygın olarak susturulması, genetik arka plan kontrollerine kıyasla Ada Deneyi'ndeki lokomotor performansı önemli ölçüde azaltmıştır. Kaydedilen Ada Deneyi verilerinin manuel analizi, otomatik analizle aynı sonucu vermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, Ada Deneyi'nin nasıl gerçekleştirileceği, Drosophila Ada Deneyi makrosunun nasıl çalıştırılacağı ve Ada Deneyi analiz betiğinin nasıl işletileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Bu protokol uygulanırken, görüntü segmentasyonunun kalitesinin videoların kalitesiyle ilişkili olduğunu hatırlamak önemlidir. Kontrast ne kadar iyiyse, analiz o kadar sorunsuz olur. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, araştırmacıların Drosophila'daki lokomotor yeteneği yüksek verimlilikle keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.
Bu analizden sonra, lokomotor kusurları daha ayrıntılı incelemek için negatif geotaksisi test edenler gibi diğer analizler kullanılabilir.
Genel Bakış
Ada Analizi, Drosophila melanogaster'ın lokomotor davranışlarını otomatik veri işleme yoluyla değerlendirmek için geliştirilmiş yeni bir yöntemdir. Bu teknik, genetik ve farmakolojik çalışmalar için yüksek kapasiteli tarama imkanı sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal Analiz
- Genetik Tarama
Arka Plan
- Ada Deneyi, meyve sineklerindeki temel lokomotor davranışı değerlendirir.
- Hareket bozukluklarının temel düzenleyicilerini belirler.
- Bu yöntem, hastalık modellerinin geniş ölçekli taramalarını destekler.
- Otomatik görüntü analizi, veri işleme verimliliğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Lokomotor davranış analizi için yüksek kapasiteli bir assay geliştirmek.
- Hareketi etkileyen genetik faktörlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
- Lokomotor kusurları düzeltebilecek farmakolojik ajanları test etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Biyolojik tekrarlar içeren deneysel koşulların hazırlanması.
- Uygun aydınlatma ve kamera ile kayıt düzeneğinin kurulması.
- Özel yazılım kullanılarak otomatik görüntü yakalama ve işleme.
- Sinek davranışının tanımlanmış parametrelere göre nicelleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Lokomotor analiz için Ada Deneyi'nin (Island Assay) başarılı bir şekilde uygulanması.
- Geniş ölçekli genetik taramalar için nicelleştirilebilir verilerin üretilmesi.
- Hareket bozuklukları için potansiyel ilaç adaylarının belirlenmesi.
- Gelecekteki çalışmalar için tekrarlanabilir bir metodolojinin oluşturulması.
Sonuçlar
- Ada Deneyi (Island Assay), lokomotor davranışı incelemek için güvenilir bir çerçeve sunar.
- Otomatik işleme, veri toplama verimliliğini artırır.
- Bu yöntem, yüksek kapasiteli genetik ve farmakolojik taramalar için uygundur.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Island Deneyi, Drosophila lokomotor davranışının yüksek verimli ve otomatik olarak nicelendirilmesini sağlayarak, hareket bozuklukları hedef doğrulamasındaki kritik bir darboğazı gidermektedir. Manuel video analizini objektif ve tekrarlanabilir veri çıktılarına dönüştürerek, lokomotor fonksiyonun genetik ve farmakolojik modülatörlerinin ölçeklenebilir şekilde taranmasını destekler. Bu durum, deneyi nöroloji alanındaki erken aşama keşif programlarının risklerini azaltmak için mekanistik olarak bilgilendirici ve maliyet etkin bir araç konumuna getirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gen susturma veya ilaç tedavisi etkileri için fonksiyonel bir çıktı olarak lokomotor kaçış tepkisini nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Genetik koşullar genelinde sinek davranışının otomatik ve objektif ölçümü yoluyla biyolojik risk azaltmayı destekler ve fenotipik taramadaki gözlemci yanlılığını azaltır.
- Öngörücü Değer: Karşılaştırmalı analizi ve anlamlı lokomotor fenotiplere sahip hedeflerin önceliklendirilmesini kolaylaştıran eğri altındaki alan ve medyan kaçış tepkisi metrikleri üretir.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hareket bozukluğu modifikatörlerine yönelik geniş ölçekli taramalarda, bileşiklerin güvenilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyan standartlaştırılmış, zamana bağlı lokomotor veriler üretir.
- Operasyonel Değer: Tekrarlar ve deneysel gruplar arasındaki teknik değişkenliği en aza indiren otomatik görüntü işleme hatları (Fiji ve R) aracılığıyla analiz tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Düşük maliyetli kurulumu (web kamerası, LED aydınlatma) ve açık kaynaklı yazılımlarla uyumluluğu sayesinde yüksek verimli iş akışlarıyla uyumludur ve laboratuvarlar tarafından yaygın olarak benimsenmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Korunmuş lokomotor fenotipler aracılığıyla Drosophila genetik modellerini (örneğin, ATM ortolog knockdown) insan hareket bozukluğu mekanizmalarıyla ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Genel motor eksikliklerini, spesifik koordinasyon veya dayanıklılık kusurlarından ayırt etmeye yardımcı olan kantitatif davranışsal okumalar sağlayarak hedef güvenilirliğini artırır.
- Preklinik Uyum: Farmakolojik ajanların doz-yanıt ve zaman seyri analizlerini destekleyerek, hastalıkla ilgili sistemlerde etkinliğin erken değerlendirilmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Ada Deneyi, hedef hipotez testinden öncü bileşik belirlemeye kadar olan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, nöroloji programlarında genetik tarama ile mekanistik takip arasında davranışsal bir fenotipleme köprüsü sunar.
- Keşif Biyolojisi: Genetik pertürbasyonları (örneğin ATM knockdown) ölçülebilir lokomotor defisitlerle ilişkilendirerek yolak aydınlatılmasını ve hedef doğrulamayı destekler, böylece hipotez odaklı hedef sorgulamaya olanak tanır.
- Tarama: Sinek platformundan kaçışın zamanla otomatik olarak nicelleştirilmesi yoluyla assay hazırlığı sağlar; bileşik kütüphanesi taramasına uygun, doza ve zamana bağlı fenotipik sonuçlar üretir.
- Analitik: İstatistiksel çıktılarla (Welch t-testi veya ANOVA) birlikte eğri altındaki alan ve medyan değerlerini dışa aktararak, tarama kampanyalarında koşullar arası karşılaştırmaya ve hit seçimine imkan verir.
- Translasyonel Araştırma: İnsan ataksisinin Drosophila modellerinde korunan lokomotor defektleri göstererek hastalık modellerindeki fenotipik tarama ile uyum sağlar ve mekanistik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef, genotip ve bileşik taramasında yeniden doğrulamaya gerek kalmadan uygulanabilen, lokomotor değerlendirme için yeniden kullanılabilir, standartlaştırılmış bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Objektif, yüksek çözünürlüklü davranışsal nicelleştirme yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Otomatik veri işleme aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir, geniş ölçekli taramalarda manuel çabayı ve kullanıcılar arası değişkenliği en aza indirir.
- Stratejik Değer: Nöroterapötik geliştirmede geç evre başarısızlık riskini azaltan erken, kantitatif fenotipik veriler sağlayarak go/no-go karar verme verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: İstatistiksel olarak sağlam lokomotor yanıt verilerine dayanarak hedeflerin ve bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır ve keşif portföylerindeki sermaye verimliliğini artırır.
Uygulama Hususları
- Makro yürütme ve betik tabanlı analiz için Fiji ve R/RStudio kullanımına aşinalık gerektirir, bu da temel biyoinformatik veya görüntü analizi eğitimi almayı zorunlu kılar.
- Deneyler boyunca doğru sinek segmentasyonu ve güvenilir nicelleştirme sağlamak için tutarlı görüntüleme koşullarına (aydınlatma, kontrast, platform stabilitesi) bağlıdır.
- Biyolojik değişkenliği en aza indirmek ve assay tekrarlanabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış sinek hazırlığı (bozulmamış kanatlar, yaş, cinsiyet, yoğunluk) gerektirir.
- Gruplar arası veri bütünlüğünü korumak için titizlikle uygulanması gereken manuel kurulum adımları (platform ROI tanımı, minimum sinek boyutu eşiği) içerir.
- 2D düzlemsel davranış analizi ile sınırlıdır; dikey uçuşu veya karmaşık motor sekanslarını yakalamaz, bu nedenle tam davranışsal profilleme için tamamlayıcı assay'ler gerektirir.
