Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil
5 Kasım 2017
Ada tahlil Drosophila melanogastertemel Lokomotor davranışını değerlendirmek için kullanılan nispeten yeni, düşük maliyetli bir tahlil olduğunu. Bu el yazması için otomatik veri işleme ve ada tahlil veri, bu hassas, yüksek üretilen iş göstergesi büyük genetik veya farmakolojik ekranlar için tahlil yaparken objektif miktar algoritmaları açıklar.
Ada Testi'nin genel amacı, otomatik veri işleme ve objektif niceleme yoluyla Drosophila melanogaster'in temel lokomotor davranışını değerlendirmektir. Bu yöntem, hareket bozukluklarında rol oynayan genler gibi lokomotor davranışın temel düzenleyicilerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu tür kusurları tersine çevirebilecek ilaçları test etmek için kullanılabilir.
Bu tekniğin ana avantajı, Drosophila lokomotor davranışının yüksek verim ölçümüne izin vermesi ve bu tekniği büyük ölçekli taramalar için uygun hale getirmesidir. Çok sayıda hastalık modelini analiz edebilmek için bu metodolojiyi geliştirmeye karar verdik. Bunu mümkün kılmak için otomatik görüntü veri analizine ihtiyacımız vardı.
Bu yöntemin görsel gösterimi çok faydalıdır. Beta işlemenin birkaç adımı çok önemlidir ve yeni kullanıcılar, özellikle de kullanımdaki yazılım paketlerine aşina olmayanlar için zor olabilir. İlk olarak, biyolojik kopyalar olarak deney koşulu başına en az üç şişe hazırlayın.
Her dosyada aynı cinsiyette ve benzer yaşta yaklaşık 15 sinek bulunmalıdır. Daha da önemlisi, sineklerin sağlam kanatları olmalıdır. Deneyleri depolamak için klasörler oluşturun.
Bunları, koşullar tarafından tanımlanan bir dizin yapısında oluşturun ve çoğaltın. Örneğin, denemenin her biri beş kopyalı iki genotipi varsa, deney tarihini içeren bir ana klasör oluşturun ve bu klasörün içinde her genotip için bir alt klasör oluşturun. Ardından, genotip klasörleri içinde, her çoğaltma için alt klasörler oluşturun.
Ardından, test cihazını kurun. Banyo tepsisine az miktarda sabunla soğuk su ekleyin ve henüz banyoya sabitlenmemişse, platformu banyonun ortasına yerleştirin. Tepsiyi ve platformu şeffaf bir kutu ile örtün.
Platformu aydınlatmak için, üzerine sıradan 12 voltluk LED'ler gibi soğuk bir lamba yerleştirin. Ayrıca bir bilgisayara bağlı bir web kamerasını doğrudan platformun üzerine yerleştirin. Bilgisayarda görüntü kayıt yazılımını açın.
Menü sisteminden, yakalama cihazı olarak uygun web kamerasını seçin. Video ayarlarını yapmak için adaya ölü bir sinek yerleştirin. Yazılımdaki parlaklığı, kontrastı ve rengi, ölü sinek beyaz bir arka plana karşı siyah görünecek şekilde ayarlayın.
Ardından, filmleri AVI dosyaları olarak kaydetmek için hızlandırılmış film kurulumunu ayarlayın. Ardından, verilerin kaydedileceği dizine göz atın ve filmin adını tanımlayın. Bu değişiklikleri kaydedin.
Görüntü verilerinin sıkıştırılması için Intel IYUV kodunu seçin. Kayıt hızını her 0,1 saniyede bir kareye ayarlayın ve karşılık gelen oynatma hızını saniyede 10 görüntüye ayarlayın. Son olarak, gelişmiş ayara gidin ve Yakalanan her kare için bir bmp görüntüsü oluştur'u seçin.
Ardından, AVI dosyalarını barındırmak için seçtiğiniz dizine göz atın ve Tamam'a basın. Başlamadan önce adanın boş ve temiz olduğundan emin olun. Ardından, görüntü kayıt yazılımının hızlandırılmış görüntü arayüzünde kaydı başlatın.
Sinek içeren bir şişe alın ve tüm sinekleri dibe vurmak için iki veya üç kez vurun. Ardından, fişi şişeden hızlı bir şekilde çıkarın ve sinekleri platforma kuvvetlice vurun. Hepsi kabaca aynı anda platforma çarpmalıdır.
Sineklere platformdan ayrılmaları için 30 saniyeye kadar süre verin, ardından kaydı durdurun. Gerekirse, kalan sinekleri platformdan manuel olarak çıkarın. Bir sonraki denemeye geçmeden önce, bir sonraki veri kümesinin depolanacağı dizini yeniden tanımladığınızdan emin olun.
İlk görev, toplanan görüntü serilerinin yığınlarını ve projeksiyonlarını üretmektir. Fiji'de Drosophila Adası Tahlilini açın. Yeni pencerede, ilk görüntü zaman serisi tanımlayıcısını girin.
Ardından, yalnızca yığın ve projeksiyon alt makrosu oluştur'u seçin. Tamam'ı tıklatın ve bilgisayarı, tek tek Ada Tahlili deneylerinin bulunduğu tüm alt klasörleri içeren klasöre yönlendirin. Verileri işledikten sonra, her bir deneysel alt klasörde iki yeni dosya görünecektir.
Bir sonraki görev, görüntülerde platformun tam konumunu tanımlamaktır. Grafik arayüzü açın ve platformu tanımla onay kutusunu seçin. Ardından, deneysel alt klasörlerin depolandığı dizini seçin.
Projeksiyon görüntüsü ve iki pencere açılacaktır. İlk görüntüde, çokgen seçim aracını kullanarak ada platformunun üzerine bir çokgen çizin. Bu seçimde platformun parametresindeki sınır çizgisini dahil etmeyin.
ROI yöneticisi penceresinde ekle'ye tıklayarak seçimi ROI yöneticisi penceresine ekleyin. Seçimi ROI yöneticisine ekledikten sonra, bir dizi değer olarak görünecektir. Ardından, platformu tanımla penceresinde Tamam'a tıklayın.
Yazılım, klasörde saklanan bir sonraki projeksiyon görüntüsüne ilerleyecektir. ROI yöneticisinde depolanan ROI'yi seçerek ve platformu tanımla penceresinde bu ROI'yi onaylayarak platform için aynı ROI'yi bir sonraki projeksiyon görüntüsüne uygulamaya devam edin. Bir sonraki projeksiyon görüntüsüne geçmeden önce, deney sırasında platformun hareket etmediğinden emin olun.
Platformun konumu hareket ettiyse, seçimin ortasına sol tıklayın ve onu istenen konuma sürükleyin. Seçim kutusu platformla eşleşmiyorsa, seçimin dışına sol tıklayın ve çokgen aracını kullanarak platform için yeni bir seçim belirleyin. Bu yeni seçimi ROI yöneticisine ekleyin.
Ardından, platform tanımla penceresinde Tamam'a tıklayarak yeni seçimi doğrulayın ve tüm görüntüler düzgün tanımlanmış platformlara sahip olana kadar işleme devam edin. Verileri işlemeden önceki son görev, bir sinek için minimum boyutu tanımlamaktır. Bu, metin protokolünde açıklanmıştır.
Platformdan kaçan sinekleri ölçmek için önce minimum sinek boyutunu ayarlayın. Ardından, deney serisindeki bir dosyadaki en fazla sinek sayısını belirtin. Analiz işlevini başlatın ve komut isteminde denemenin ana dizinini seçin.
Makroyu çalıştırdıktan sonra, her klasörde yeni bir sonuç dosyası ve yeni bir görüntü yığını göründüğünü unutmayın. Prosedürün doğru çalıştığından emin olmak için bu dosyaları açın. R veya RStudio yazılım paketini başlatın ve tüm deneyleri aynı anda işlemek için Island Assay analiz komut dosyasını açın.
Analizin başarılı olması için komut dosyasının doğru şekilde düzenlenmesi gerekir. 16. satırdaki komut dosyasına, analiz edilecek denemeleri içeren ana dizinin yolunu ekleyin. Analiz çıktı dosyalarının 19. satıra saklanması gereken klasörün yolunu ekleyin.
İkincisi, analiz edilecek görüntü verilerini içeren dizinden farklı bir konum olmalıdır. Şimdi, komut dosyasını araç çubuğundan çalıştırın ve sonuçları analiz etmeye devam edin. Komut dosyası Ada Tahlili analizi, her deneysel koşul için bir çizgi grafiği dışa aktarır.
Grafik, bu koşulun her bir kopyası için zaman içinde platformda kalan sineklerin yüzdesini gösterir. Dışa aktarılan çizgi grafiği, kaçış yanıtı:tüm koşullar, ana klasörde bulunan ilk 12 deneysel koşul için ortalama uçuş kaçış yanıtının ortalama ve standart hatasını özetler. Her deneysel kopya için eğrinin altındaki alan, deney koşullarının birbirinden önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için hesaplanır.
Her deneysel koşul için eğrinin altındaki alan ve medyan değer bir grafik olarak dışa aktarılır. Ana klasörde bulunan koşulların sayısına bağlı olarak, komut dosyası iki koşul için iki kuyruklu eşleşmemiş bir Welch T-testi veya ikiden fazla koşul için iki tuş düzeltmeli bir anova gerçekleştirir. Script Island Assay analizi tarafından hesaplanan tüm sayısal veriler de dışa aktarılır ve veri çıktı klasörüne csv veya txt dosyaları olarak kaydedilir.
Ataksi telenjiektazi, ATM genindeki mutasyonların neden olduğu otozomal resesif bir hareket bozukluğudur. Hastalık, serebellar ataksinin erken başlangıcı ile karakterizedir. ATM'nin sinek ortologunu her yerde devirmenin etkisi Ada Testi'nde incelendi ve kontrollerle karşılaştırıldı.
Genel olarak, sinek ATM ortoloğu Tefu'nun her yerde yere serilmesi, genetik arka plan kontrollerine kıyasla Ada Testindeki lokomotor performansı önemli ölçüde azalttı. Kaydedilen Ada Tahlili verilerinin manuel analizi, otomatik analizle aynı sonucu verdi. Bu videoyu izledikten sonra, Ada Testi'nin nasıl gerçekleştirileceği, Drosophila Ada Testi makrosunun nasıl çalıştırılacağı ve Ada Testi analiz komut dosyasının nasıl çalıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Bu protokolü denerken, görüntü segmentasyonunun kalitesinin filmlerin kalitesiyle ilişkili olduğunu unutmamak önemlidir. Kontrast ne kadar iyi olursa, analiz o kadar düzgün olur. Geliştirildikten sonra, bu teknik, araştırmacıların Drosophila'daki lokomotor yeteneği yüksek verimle keşfetmelerinin yolunu açıyor.
Bu testi kullandıktan sonra, negatif jeotaksileri test edenler gibi diğer tahliller, lokomotor kusurları daha fazla araştırmak için kullanılabilir.
Genel Bakış
Ada Analizi, Drosophila melanogaster'ın lokomotor davranışlarını otomatik veri işleme yoluyla değerlendirmek için geliştirilmiş yeni bir yöntemdir. Bu teknik, genetik ve farmakolojik çalışmalar için yüksek kapasiteli tarama imkanı sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal Analiz
- Genetik Tarama
Arka Plan
- Ada Deneyi, meyve sineklerindeki temel lokomotor davranışı değerlendirir.
- Hareket bozukluklarının temel düzenleyicilerini belirler.
- Bu yöntem, hastalık modellerinin geniş ölçekli taramalarını destekler.
- Otomatik görüntü analizi, veri işleme verimliliğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Lokomotor davranış analizi için yüksek kapasiteli bir assay geliştirmek.
- Hareketi etkileyen genetik faktörlerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
- Lokomotor kusurları düzeltebilecek farmakolojik ajanları test etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Biyolojik tekrarlar içeren deneysel koşulların hazırlanması.
- Uygun aydınlatma ve kamera ile kayıt düzeneğinin kurulması.
- Özel yazılım kullanılarak otomatik görüntü yakalama ve işleme.
- Sinek davranışının tanımlanmış parametrelere göre nicelleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Lokomotor analiz için Ada Deneyi'nin (Island Assay) başarılı bir şekilde uygulanması.
- Geniş ölçekli genetik taramalar için nicelleştirilebilir verilerin üretilmesi.
- Hareket bozuklukları için potansiyel ilaç adaylarının belirlenmesi.
- Gelecekteki çalışmalar için tekrarlanabilir bir metodolojinin oluşturulması.
Sonuçlar
- Ada Deneyi (Island Assay), lokomotor davranışı incelemek için güvenilir bir çerçeve sunar.
- Otomatik işleme, veri toplama verimliliğini artırır.
- Bu yöntem, yüksek kapasiteli genetik ve farmakolojik taramalar için uygundur.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Island Deneyi, Drosophila lokomotor davranışının yüksek verimli ve otomatik olarak nicelendirilmesini sağlayarak, hareket bozuklukları hedef doğrulamasındaki kritik bir darboğazı gidermektedir. Manuel video analizini objektif ve tekrarlanabilir veri çıktılarına dönüştürerek, lokomotor fonksiyonun genetik ve farmakolojik modülatörlerinin ölçeklenebilir şekilde taranmasını destekler. Bu durum, deneyi nöroloji alanındaki erken aşama keşif programlarının risklerini azaltmak için mekanistik olarak bilgilendirici ve maliyet etkin bir araç konumuna getirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gen susturma veya ilaç tedavisi etkileri için fonksiyonel bir çıktı olarak lokomotor kaçış tepkisini nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Genetik koşullar genelinde sinek davranışının otomatik ve objektif ölçümü yoluyla biyolojik risk azaltmayı destekler ve fenotipik taramadaki gözlemci yanlılığını azaltır.
- Öngörücü Değer: Karşılaştırmalı analizi ve anlamlı lokomotor fenotiplere sahip hedeflerin önceliklendirilmesini kolaylaştıran eğri altındaki alan ve medyan kaçış tepkisi metrikleri üretir.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hareket bozukluğu modifikatörlerine yönelik geniş ölçekli taramalarda, bileşiklerin güvenilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyan standartlaştırılmış, zamana bağlı lokomotor veriler üretir.
- Operasyonel Değer: Tekrarlar ve deneysel gruplar arasındaki teknik değişkenliği en aza indiren otomatik görüntü işleme hatları (Fiji ve R) aracılığıyla analiz tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Düşük maliyetli kurulumu (web kamerası, LED aydınlatma) ve açık kaynaklı yazılımlarla uyumluluğu sayesinde yüksek verimli iş akışlarıyla uyumludur ve laboratuvarlar tarafından yaygın olarak benimsenmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Korunmuş lokomotor fenotipler aracılığıyla Drosophila genetik modellerini (örneğin, ATM ortolog knockdown) insan hareket bozukluğu mekanizmalarıyla ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Genel motor eksikliklerini, spesifik koordinasyon veya dayanıklılık kusurlarından ayırt etmeye yardımcı olan kantitatif davranışsal okumalar sağlayarak hedef güvenilirliğini artırır.
- Preklinik Uyum: Farmakolojik ajanların doz-yanıt ve zaman seyri analizlerini destekleyerek, hastalıkla ilgili sistemlerde etkinliğin erken değerlendirilmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Ada Deneyi, hedef hipotez testinden öncü bileşik belirlemeye kadar olan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, nöroloji programlarında genetik tarama ile mekanistik takip arasında davranışsal bir fenotipleme köprüsü sunar.
- Keşif Biyolojisi: Genetik pertürbasyonları (örneğin ATM knockdown) ölçülebilir lokomotor defisitlerle ilişkilendirerek yolak aydınlatılmasını ve hedef doğrulamayı destekler, böylece hipotez odaklı hedef sorgulamaya olanak tanır.
- Tarama: Sinek platformundan kaçışın zamanla otomatik olarak nicelleştirilmesi yoluyla assay hazırlığı sağlar; bileşik kütüphanesi taramasına uygun, doza ve zamana bağlı fenotipik sonuçlar üretir.
- Analitik: İstatistiksel çıktılarla (Welch t-testi veya ANOVA) birlikte eğri altındaki alan ve medyan değerlerini dışa aktararak, tarama kampanyalarında koşullar arası karşılaştırmaya ve hit seçimine imkan verir.
- Translasyonel Araştırma: İnsan ataksisinin Drosophila modellerinde korunan lokomotor defektleri göstererek hastalık modellerindeki fenotipik tarama ile uyum sağlar ve mekanistik sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef, genotip ve bileşik taramasında yeniden doğrulamaya gerek kalmadan uygulanabilen, lokomotor değerlendirme için yeniden kullanılabilir, standartlaştırılmış bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Objektif, yüksek çözünürlüklü davranışsal nicelleştirme yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Otomatik veri işleme aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir, geniş ölçekli taramalarda manuel çabayı ve kullanıcılar arası değişkenliği en aza indirir.
- Stratejik Değer: Nöroterapötik geliştirmede geç evre başarısızlık riskini azaltan erken, kantitatif fenotipik veriler sağlayarak go/no-go karar verme verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: İstatistiksel olarak sağlam lokomotor yanıt verilerine dayanarak hedeflerin ve bileşiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır ve keşif portföylerindeki sermaye verimliliğini artırır.
Uygulama Hususları
- Makro yürütme ve betik tabanlı analiz için Fiji ve R/RStudio kullanımına aşinalık gerektirir, bu da temel biyoinformatik veya görüntü analizi eğitimi almayı zorunlu kılar.
- Deneyler boyunca doğru sinek segmentasyonu ve güvenilir nicelleştirme sağlamak için tutarlı görüntüleme koşullarına (aydınlatma, kontrast, platform stabilitesi) bağlıdır.
- Biyolojik değişkenliği en aza indirmek ve assay tekrarlanabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış sinek hazırlığı (bozulmamış kanatlar, yaş, cinsiyet, yoğunluk) gerektirir.
- Gruplar arası veri bütünlüğünü korumak için titizlikle uygulanması gereken manuel kurulum adımları (platform ROI tanımı, minimum sinek boyutu eşiği) içerir.
- 2D düzlemsel davranış analizi ile sınırlıdır; dikey uçuşu veya karmaşık motor sekanslarını yakalamaz, bu nedenle tam davranışsal profilleme için tamamlayıcı assay'ler gerektirir.
