Ultrahigh çözünürlük fare optik koherens tomografi göz içi enjeksiyon Retina gen terapisi araştırma yardımcı olmak için

Bu subretinal enjeksiyon prosedürünün genel amacı retinaya gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilen minimal invaziv ve tekrarlanabilir bir şekilde bir vektör sunmaktır. Merhaba, bu yöntem vektör iletim etkinliği ve terapötik ajan toksisitesi hakkında gen tedavisi araştırmalarında anahtar soruları cevaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin bazı avantajları retina ve diğer göz yapıları, hassas enjeksiyon yeri haritalama ve katı istatistiksel çıkarım sağlayan titiz kantitatif in vivo ölçümler minimal hasar içerir.

Göz içi transgeni enjeksiyonu için, ilk olarak retinal görüntüleme sistemi mikroskobunun görüntüleme aşamasına anestezili bir fare yerleştirin ve forsepsleri hafifçe proptozi indüklemek için açık ve aşağı iterken göz kapağının yedi ve 10 yönünde steril bir iris forsepsin uçlarını yerleştirin. Göz küresinin altındaki göz kapaklarını ikna etmek ve iğneucunu kornea ekstremitesinin kenarının yaklaşık 1 ila 1,5 milimetre altına yönlendirmek için büşnileri kullanın. Daha sonra, göze bir damla steril PBS çözeltisi uygulayın ve gözü steril bir kapak fişiile kapatın.

Skleral depresyon oluşturulana kadar dikkatle konjonktiva ile göze iğne sürücü. Skleral depresyon odak kadar yukarı göz döndürmek için mikro manipülatör kullanın, sonra iğne ucu ile retinada keskin bir tepe oluşturmak için ileri iğne sürücü. İğne tutucuyu kullanarak, iğnenin ucu sklera ve RPE'den geçene kadar iğneyi döndürün, iğnenin ucundaki flourescein'in subretinal uzayın hemen yakınında retina dokusunun altında ve retinapigment epitel hücre monokatmanının hemen yakınında görünmesini sağlar.

İğnenin ucunu aşağıya doğru sürüklün, böylece küreye teğet geçer, sonra da ayak pedalı anahtarıyla enjeksiyon pompasını etkinleştirin. 0,5 ila bir mikrolitre transgen çözeltisi subretinal uzaya ulaştıktan sonra, iğneyi geri çekin ve kanın stabil olduğunu ve sıvının enjeksiyon bölgesi dışına sızmadığını doğrulayın. Enjeksiyonun başarısını doğrulamak için, dikdörtgen bir hacim OCT kaydedin ve görüntüleri farklı türde potansiyel enjeksiyon sonuçlarının görüntüleriyle karşılaştırın.

Uygun enjeksiyon yerleşiminin teyidinden sonra, bleb'in kapsamını fundus görüntüsüne göre haritalamak için bu dikdörtgen OCT görüntüsünü kullanın. Subretinal bleb'in kapsamını haritalamak için, gözün içinde tanınabilir bir simgesel yapının görüntüye dahil edilebildiği şekilde bleb'in dikdörtgen hacimli OCT görüntüsünü açın. B taramasının sol ve sağ kenarlarının konumunu ve varsa optik sinir başlığı ONH'yi ve retinanın RPE ve koroidden ayrıldığı çekim noktasını belirlemek için gerektiği kadar kaliper ekleyin ve verileri kaydedin.

Daha sonra kaydedilen dosyaları derleyin ve verileri çizin, en face OCT görüntüsüne enjeksiyon lekesinin bir haritasını etkin bir şekilde oluşturarak. Çizilen verileri enjeksiyon alanını içeren fundus görüntüsüne yeraltın ve birleştirilmiş görüntüyü kaydedin. Oct görüntülemesırasında ilgi çekici bölgeleri bulmak için bu görüntüyü kullanın.

Enjeksiyon sonrası retinadejenerasyonu değerlendirmek için, ilk olarak kayıtlı yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı OCT veya HRSD OCT dikdörtgen hacimli görüntü açın ve ölçülecek bir B taraması seçin. Seçili görüntüyü ekranı doldurana kadar büyütün ve resmin üzerine sağ tıklayın. Uygun kaliper sayısını seçmek için kaliperleri tıklatın, ardından kaliperleri açı bloğu sütununda dikey olarak atamak için yapıkaliper özelliğini kullanın ve retina boyunca düzgün kaliper yerleşimini kolaylaştırmak için ekran kaliper konumunu açın.

Her kaliperi uygulayın ve b tonu boyunca 0,1 ila 0,2 milimetre arayla uygun konuma taşıyın ve uygun olduğunda optik sinir kafasının ortasına bir kaliper yerleştirmeye özen gösteriyor. Tüm kaliperler yerleştirildiğinde, her kaliperi ilgi alanının uzunluk aralığına tıklayıp sürükleyin ve b talanının ölçülebilir bölgelerini maksimum uzunluğa kadar rasgele ayarlayın. Dış nükleer tabaka kalınlığını ölçmek için, her kaliperin üst kısmını dış sınırlayıcı membrana, her kaliperin altını da dış pleksi form tabakasının alt kısmında, retina boyunca 0,1 ila 0,2 milimetrelik artışlarla yerleştirin.

Tüm kaliperler yerleştirildikten ve boyuta göre ayarlandıktan sonra, resme sağ tıklayın ve kaliper verilerini kaydet"i tıklayın, ardından her onuncu B tararmasını gösterdiği gibi ölçümleri tekrarlayın, kaliperleri açık ve x ekseninde aynı konumda tutarak ve kaliperlerin uzunluklarını x yönünde hareket ettirmeden gerektiği gibi ayarlayın. Tüm taramalar ölçüldüğünde, kaydedilen veri dosyalarını açın ve kaydedilen zamana göre dosyaları düzenlemek için tarih değiştirilsin" seçeneğini tıklatın. Ölçülen her B tarar için tüm dosyaları açın ve her B tarar'ın ham verilerini en düşükten en yüksek kare numarasına tek bir dosyaya derleyin ve kaliper adı, uzunluk ve x sütunları merkezi de dahil olmak üzere veri sütunlarını seçin.

X merkezinin, işlenen her dikdörtgen hacimli OCT görüntü için ölçülen B taramalarının tümü için aynı olduğundan emin olun ve ölçümleri kaydetmek için kullanılmayan kaliperlerden gelen verileri silin. Optik sinir kafasının merkezinde bulunan kaliper'i sıfıra ayarlayın ve dış nükleer tabakanın veya ölçülen başka bir retina tabakasının kalınlığı için 3B çizim işlevi almak için X'e karşı birden fazla Y veri seti için veri çizin. Daha sonra kontrol ve deneysel hayvanlar arasındaki dış nükleer tabaka ölçümlerini, olası retina dejenerasyonunun oranını ve tekdüzeliğini belirlemek için ilgili yaşlarla karşılaştırın.

Retina ölçümleri 3D haritalama için, enjeksiyon sonrası OCT görüntüleri gözden geçirin ve herhangi bir tanımlanabilir yerler not, sonra aynı bölgeden bir takip SDO CT görüntü elde etmek için hayvan konumlandırmak, aynı tanımlanabilir yerler eklemek için özen, ve sadece gösterildiği gibi kaydedilen görüntüleri işlemek. Daha önce enjekte edilen retina bölgelerinin yeniden görüntülenmesini kolaylaştırmak için tanımlanabilir yerler içeren yüksek kaliteli OCT görüntüleri elde etmek çok önemlidir. Os uzunluğundaki değişiklikleri ölçmek için, kaliperler dış sınırlayıcı membrandan Brooks membranına yerleştirildi ve bu tabakalar OCT görüntülerinde kolayca tanımlanadığından güvenilir ölçümler için izin verildi.

Farklı fare çizgilerinden bu katmanlar arasındaki ölçümlerdeki farklılıklar daha kısa dış segment uzunluklarına atfedilmiştir. Subretinal enjeksiyon başarılı bir şekilde yapılırsa, subretinal alanın açılması, hem HRSD OCT görüntüleyicinin en yüz görünümünde hem de B taraması görüntülerinde açıkça görüntülenebilen bir bleb üretimini tetikler. Enjeksiyon bölgesinin sınır haritasının üst üste bindirilmesi, retina doku ölçümlerinin ve kaliper pozisyonu veri setlerinin segmentasyonuna izin vererek spesifik terapötik ajanların retina dejenerasyonu üzerindeki etkilerinin daha sonra istatistiksel olarak test edilmesine olanak tanır.

Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa on dakika içinde tamamlanabilir. Bu işlemi denerken cerrahi ortamı temiz ve steril tutmayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, geliştirildikten sonra gen terapisi alanında araştırmacıların tüm subretinal cerrahi enjeksiyon sürecini gerçek zamanlı olarak izlemelerinin önünü açmış ve in vivo'daki cerrahi başarıyı hemen belirlemenin bir yolunu oluşturmuştur.

Bu enjeksiyon prosedüründen sonra, transjen fonksiyonel kurtarma ve/veya toksisite ile ilgili ek soruları yanıtlamak için OKT ve elektro retinografi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra transsklerel ve transkonoidal subretinal enjeksiyonların nasıl yapılacağını, enjeksiyon lekesinin kapsamını bu görüntüden OKT'ye nasıl görebilirsiniz ve dış retina tabakalarının sıkı ölçümlerini elde edebilirsiniz. Gen terapisi vektörleri ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman takma gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.