Name: Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, fare iskelet kaslarından FACS ile Tip I ve Tip II perisitleri aynı anda izole etme yöntemini. Bu protokol, perisit biyolojisi ve rejeneratif tıp alanındaki araştırmaları kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, kısmen Myotonic Distrofi Vakfı (MDF-FF-2014-0013) ve Amerikan Kalp Derneği&#39;nden (16SDG29320001) Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi&#39;nden bir Fon A Üyesi Ödülüyle desteklendi.

Wildtype ve Nestin-GFP transgenik fareler, Minnesota Üniversitesi&#39;ndeki hayvan tesislerinde barındırıldı. Tüm deneysel prosedürler, Minnesota Üniversitesi&#39;ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu&#39;na uygun olarak hazırlandı. 1. Kas Diseksiyonu ve Tek Hücreli İzolasyon <ol><li> Tribromoetanol (250 mg / kg, ip) ile erişkin fareler (6-10 hafta, hem erkek hem de kadın) euthanize edin ve karın cildini% 70 etanol ile sterilize edin. NOT: Anestezi / ötenazi için ketaminin yerine ketamin yerine tribromoetanol kullanıldı, çünkü ketamin NMDA reseptörleri ile etkileşime girdi ve bu da potansiyel olarak çalışma üzerinde etkili olabilir. </li><li> Fareleri sırt üstü pozisyona getirin ve karın cildi üzerinde yatay bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Arka ayak bacak kaslarını ortaya çıkarmak için cildi elle ters yönde çekerek soyun. </li><li> CollecForseps ve makas kullanarak her iki arka bacaktaki kaslar. Buz üzerinde% 1 penisilin-streptomisin (P / S) takviyeli steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde saklayın. </li><li> Buzla soğutulmuş PBS&#39;de iki kez% 1&#39;lik P / S ile takviye edilmiş arka bacak kaslarını yıkayın ve steril 10 cm&#39;lik bir tablaya aktarın. </li><li> Sinirleri, kan damarlarını ve 2X büyütmede bir diseksiyon mikroskopu altında makas kullanarak bağ dokusunu dikkatle inceleyin. </li><li> Steril makas ve bıçaklar kullanarak kasları ince parçalara kesin (1-2 mm3). Gerekirse, kasların kurumamış olmasını sağlamak için az miktarda Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ekleyin. </li><li> Mekanik olarak, 10 mL&#39;lik bir serolojik pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dokuyu parçalayın. </li><li> Karışıma yeni yapılmış sindirim çözeltisi (% 0.2 Tip 2 kollajenaz ile takviye edilmiş DMEM) ilave edin. 37 ° C&#39;de 2 saat gentl ile inkübe edinDakikada 35 devirde çalkalama. </li><li> Karışımı homojenize etmek için 18 G&#39;lik bir iğne kullanarak toz haline getirin. Daha sonra 500 xg&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve sonra pelleti% 0.25 tripsin / EDTA içinde tekrar süspanse edin. 37 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edin. Santrifüj adımını iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Solüsyona% 20 sığır fetüsü serumu (FBS) takviye edilmiş 10 mL DMEM ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelleti kırmızı kan hücresi liziz tamponunda (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 ve 0.1 mM EDTA) tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelet ayırma tamponunda (20 mM HEPES, pH 7.0; 1 mM EDTA; Ca / Mg 2+ ücretsiz PBS, pH 7.0&#39;da% 1 BSA) tekrar süspansiyon haline getirin. Karışımı, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 40 mikron hücre süzgeçten geçirin. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelet 1 mL sıralama tamponunda yeniden süspanse edin. </li><li> SaymakHücre sayısının bir hemasitometre ile alınması ve tekli hücre süspansiyonunun sıralama tamponunda 5 x 106 / mL&#39;ye kadar seyreltilmesi. </li></ol> 2. Hücre boyama ve sıralama <ol><li> Kontrolleri ve numuneyi Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi hazırlayın. Tek hücreli süspansiyonu, ilgili antikorlarla, buz üzerinde, Tablo 1&#39;de açıklandığı üzere 30 dakika boyunca boyayın. </li><li> 5 dakika süreyle 500 xg&#39;de santrifüjleyin ve topakları ayırma tamponuyla iki kez yıkayın. </li><li> Tablo 1&#39;de belirtildiği gibi DAPI tek hücreli solüsyonlara ekleyin. PDGFRβ-PE-FMO kontrolü ve numune için DAPI tek renkli kontrol için 5 μg / mL DAPI (nihai konsantrasyon) ve 1 μg / mL DAPI kullanın. Deney boyunca tüm tüpleri buzda tutun. </li><li> Sıralayıcıyı ve yazılımı açın. İstendiğinde 100 μm&#39;lik bir ayırma yongasını tarayın ve takın. </li><li> Otomatik kurulumu gerçekleştirin ( örneğin, talaş hizalaması, damlacık kalibrasyonu, yan akım kalibrasyonu ve sıralama gecikmesi kalibrasyonuOn) otomatik kurulum boncukları yükleyerek sorulduğunda. </li><li> Otomatik kurulum tamamlandığında, &quot;Deneme&quot; sekmesine gidin, &quot;Yeni&quot; yi tıklayın ve &quot;Genel Şablonlar&quot; dan &quot;Boş Şablon&quot; u seçin. </li><li> &quot;Ölçüm Ayarları&quot; altında, &quot;FL1&quot; için &quot;DAPI&quot;, &quot;FL2&quot; için &quot;Nestin-GFP&quot; ve &quot;FL3&quot; için &quot;PDGFRβ&quot; girin. &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot; kutularının işaretini kaldırın. </li><li> 405, 488 ve 561 lazerleri etkinleştirmek için kutuları işaretleyin ve &quot;Yeni Deneme Oluştur&quot; u tıklayın. </li><li> &quot;Kompanzasyon Sihirbazını Başlat&quot; seçeneğini seçin ve kompanzasyonu ayarlamak için &quot;Kompanzasyon Sihirbazı&quot; yazılım talimatlarını takip edin. <ol><li> Renksiz kontrolü yükleyin ve &quot;Başlat&quot; ı tıklayın. &quot;Dedektör ve Eşik Ayarları&quot; nı tıklayın ve nüfusu ölçeğe yerleştirmek için FSC ve BSC dedektörlerinin sensör kazancını ayarlayın. </li><li> ilanSadece negatif popülasyonları histogramların sol tarafına yerleştirmek için FL1-FL3 floresans kanallarının kazanç seviyeleri. Verileri kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> İstendiğinde tek renkli kontrolleri teker teker yükleyin. Verileri kaydetmek için &quot;Başla ve Kaydet&quot; düğmesine tıklayın. Histogramlarda pozitif popülasyonlar için kapıları ayarlayın. &quot;İleri&quot; yi tıklayın. </li><li> &quot;Telafi&quot; sekmesindeki &quot;Matris Hesapla&quot; bölümüne gidin ve telafiyi gerçekleştirmek için &quot;Telafi Ayarlarını Hesaplayın&quot; panelinde &quot;Hesapla&quot; yı tıklayın. &quot;Telafi Sihirbazı&quot; ndan çıkmak için &quot;Bitir&quot; i tıklayın. </li></ol></li><li> PDGFRβ-PE-FMO kontrolünü yükleyin ve &quot;Başlat&quot; ı tıklayın. &quot;Tüm Olaylar&quot; arsa altındaki ilgi hücreleri etrafında bir poligon kapı (A Kapısı) çizin. </li><li> Alt çizgi oluşturmak için A Kapısının içinde çift tıklayın. Y eksenini DAPI olarak değiştirin ve canlı (DAPI düşük ) hücrelere çokgen kapıyı (Kapı B) çizin. I&#39;yi çift tıklayınB kapı kenarında bir çocuk komplosu oluşturmak. X ekseni FSC-H&#39;ye ve Y ekseni FSC-W&#39;ye değiştirin ve çiftleri yok etmek için, tekli noktaların etrafına bir çokgen kapı (Kapı C) çizin. </li><li> Alt çizgi oluşturmak için C Kapısının içinde çift tıklayın. X eksenini Nestin-GFP&#39;ye ve Y ekseni PDGFRβ-PE&#39;ye değiştirin. Verileri kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> Numuneyi yükleyin ve adım 2.11-2.12&#39;yi tekrarlayın. Kaydettikten sonra, numuneyi korumak için &quot;Duraklat&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> PDGFRβ-PE-FMO kontrolü temelinde PDGFRβ + ve Nestin-GFP + hücreleri için geçiş sınırlarını tanımlayın. PDGFRβ + Nestin-GFP - ve PDGFRβ + Nestin-GFP + popülasyonları için kapıları çizin. </li><li> &quot;Sıralama Yöntemi&quot; altında, &quot;2 Yönlü Tüpler&quot; i seçin ve &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP - &quot; ve &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; hücrelerini sol ve sağ toplama tüplerine atayın.dönük olarak. Toplama aşamasında ayırma tamponuyla doldurulmuş 15 mL toplama tüplerini monte edin ve &quot;Toplama Toplama&quot; düğmesine tıklayın &quot;. </li><li> Örneği çalışmaya devam etmek için &quot;Devam Et&quot; düğmesini tıklayın. PDGFRβ + Nestin-GFP - (tip I perişitler) ve PDGFRβ + Nestin-GFP + (tip II perişitler) hücreleri toplamak için &quot;Sırala Başlat&quot; ı tıklayın. </li></ol> 3. Post-sıralama Analizleri <ol><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de sıralanmış hücreleri santrifüjleyin, pelleti perisit ortamın 1 mL&#39;sinde tekrar süspansiyon haline getirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve bir hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu sayın. </li><li> ~ 1 x 104 hücre / cm2&#39;de poli-D-lisin (PDL) ile kaplanmış lamelleri üzerinde Tohum tipi I ve tip II perisitler. Perisit ortamda 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile 3 gün süreyle büyür. </li><li> 3. günde, bir peroksit mikroskobu kullanılarak perisit morfolojisini (faz kontrastı altında) ve endojen Nestin-GFP ekspresyonunu inceleyin(Uyarma lazeri: 488 nm, uyarma filtresi: 470/40 nm ve emisyon filtresi: 515/30 nm). Görüntüleri 20X (0.45 NA) bir hedefin altında çekin. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi sırasıyla adipojenik ve miyojenik farklılaşmayı başlatmak için perisit ortamını adipojenik (fare MSC bazal ortam + adipojenik stimülatör takviyesi) ve miyojenik (DMEM +% 2 at serumu) besiyeri ile değiştirin 20 . Ortamı her 2-3 günde değiştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehid (PFA) içinde 17. günde (adipojenik / miyojenik farklılaşmadan 14 gün sonra) hücreleri düzeltin. NOT: Dikkat, PFA bir kanserojendir. </li><li> Daha önceki yayınlarda 19 , 20&#39;de açıklandığı gibi, perilipin (adiposit markörü) ve S-myozine (olgun miyotür / miyofiber markeri) karşı immünositokimya uygulayın. <ol><li> Sabit hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS içinde 3 kez yıkayın. </li><li> Engelleme tamponu ekleyin (PBS% 5 eşek serumu,% 3 BSA ve% 0.3 Triton X-100 ile takviye edilmiştir) ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Hücreleri anti-perilipin (2 μg / mL) ve / veya anti-S-myosin (2 μg / mL) antikorları ile gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS&#39;de 3 kez yıkayın. </li><li> Hücreleri 1 saat oda sıcaklığında Alexa 555 eşek anti-tavşan (4 ug / mL) ve / veya Alexa555 eşek anti-fare (4 ug / mL) antikorları ile inkübe edin. </li><li> Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS&#39;de 3 kez yıkayın. </li><li> İmmünostained hücreleri DAPI içeren montaj ortamı ile monte edin (materyal tablosuna bakın). Bir floresan mikroskop (uyarma lazeri: 543 nm; 540/45 nm uyarım ve 600/50 nm emisyon) kullanarak perilipin ve S-miyozin ekspresyonunu inceleyin ve 40X&#39;lik bir hedef (0.60 NA) altında görüntü alın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+recruitment+after+injury%3A+lessons+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li>
<li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+myoblast+transfer%3A+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+CD34%2B%2F45-+and+CD34-%2F45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499(2011).</li>
<li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li>
<li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li>
<li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+regulates+PDGFRbeta%28%2B%29+cell+stemness+and+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415(2016).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
<li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28(2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured%2C+diseased%2C+and+aged+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245(2014).</li>
</ol>

Tüm yazarların ifşa ettikleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Perisitler kılcal damarların 21 , 26 abluminal yüzeyinde bulunan çok-enerjili perivasküler hücreler 22 , 23&#39;tür . İskelet kaslarında, perisitler adipogenik ve / veya miyojenik yolaklarda 19 , 20 , 24 arasında ayrım yapabilir. Son çalışmalar, farklı markör ekspresyonu ve belirgin farklılaşma potansiyelleri ol...

Kas distrofisi şimdiye kadar etkili bir tedavisi olmayan bir kas dejeneratif bozukluğudur. Doku yenilenmesini teşvik eden terapilerin gelişimi daima büyük ilgi gördü. Hasar sonrası doku rejenerasyonu ve onarımı yerleşik kök hücrelere / progenitör hücrelere bağlıdır 1 . Uydu hücreleri, kas yenilenmesine 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 katkıda bulunan miyojenik prekürsör hücrelere adanmıştır. Bununla birlikte, bunların klinik kullanımı, sınırlı göç ve enjeksiyondan sonra düşük hayatta kalma oranlarının yanı sıra , in vitro amplifikasyon sonrasında azalmış farklılaşma yetenekleri nedeniyle engellenmektedir 8 , 9 , 10 , 11 . Satelli&#39;ye ek olarakIskelet kasları, trombosit türevi büyüme faktörü reseptör-beta (PDGFRp) -pozitif interstisyel hücreler gibi miyojenik potansiyeli 12 , 13 , 14 , 15 , 16 olan birçok hücre popülasyonunu da içerir. Kas türevi PDGFRβ + hücrelerinin, miyojenik hücrelere farklılaşabildiklerini ve kas patolojisini geliştirdiklerini ve 14 , 17 , 18 , 19 , 20 nolu fonksiyonları yerine getirebildiklerini gösteren kanıtlar vardır. PDGFRβ çoğunlukla pluripotik 22 , 23 olan perivasküler hücreler olan perisitleri 21 işaret eder. PDGFRβ&#39;ya ilaveten, Neuron-Glial 2 (NG2) ve CD146 da dahil olmak üzere birçok diğer belirteçler, iPerisitleri dentify 21 . Bununla birlikte, bu belirteçlerin hiçbirinin çevreye özgü olmadığına dikkat edilmelidir. Son çalışmalar, tip I ve tip II olarak adlandırılan, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve farklı fonksiyonlar 19 , 24 , 25 gösteren kas perisitlerinin iki alt türünü ortaya çıkarmıştır. Biyokimyasal olarak, tip I perisitler NG2 + Nestin - iken, tip II perisitler NG2 + Nestin + 19 , 24&#39;tür. Fonksiyonel olarak, tip I perisitler adipogenik farklılaşmaya maruz kalabilirler, yağ birikimi ve / veya fibrozise katkıda bulunurlar, oysa tip II perisitler miyojenik yol boyunca ayırt ederek kas yenilenmesine katkıda bulunurlar 19 , 24 , 25 . Bu sonuçlar şunu göstermektedir: (1) tip I perisitler bYağlı dejeneratif bozuklukların / fibrozun tedavisinde hedeflenen ve (2) tip II perisitlerin, kas distrofisi için büyük terapötik potansiyele sahip olduklarını göstermiştir. Bu popülasyonların daha fazla araştırılması ve karakterizasyonu, tip I ve tip II perisitlerin yüksek saflıkta ayrılmasını sağlayan bir izolasyon protokolü gerektirir. Şu anda, perisit alt popülasyonlarının izolasyonu NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transjenik fareler 19 , 24&#39;e dayanmaktadır. NG2-DsRed farelerin mevcudiyeti ve çoğu NG2 antikorunun kalitesi, bu yöntemin yaygın kullanımını sınırlar. Tüm NG2 + perisitlerinin ayrıca 19 , 20 , 24 iskelet kaslarındaki PDGFRβ&#39;yı eksprese ettiği göz önüne alındığında, percyit&#39;lerin izolasyonu ve alt popülasyonları için NG2&#39;nin PDGFRβ ile değiştirilebileceği hipotezi altındayız. Bu çalışma, FACS tabanlı bir protokolü tanımlamaktadır.PDGFRβ boyama ve Nestin-GFP sinyalini kullanır. Bu yöntem araştırmacılar için daha az talepkar, çünkü: (1) NG2-DsRed fonunu gerektirmez ve (2) iyi karakterize edilmiş ticari olarak temin edilebilir PDGFRβ antikorlarını kullanır. İlaveten, tip I ve tip II perisitlerin yüksek saflıkta eşzamanlı olarak izole edilmesini sağlar ve bu perisit alt popülasyonlarının biyolojik ve terapötik potansiyelleri hakkında daha fazla araştırma yapılmasına izin verir. Saflaştırmanın ardından, bu hücreler kültürde yetiştirilebilir ve morfolojileri görselleştirilebilir. Bu çalışma aynı zamanda, çift transgenik farelerden saflaştırılanlar gibi bu yöntemi kullanarak izole edilen tip I ve tip II perisitlerin sırasıyla adipojenik ve miyojenik olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Hücre Sıralayıcı</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Kurulum Boncukları</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Perisit Büyüme Ortamı</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Bazal Orta (Fare)</td> <td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Adipojenik Stimülatör Takviyesi (Fare)</td> <td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin/EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR ve beta; -PE Antikoru</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin Antikoru</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>S-Miyozin Antikoru</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-tavşan antikoru ve nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-fare antikoru</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Vektör Laboratuvarları ile Montaj Ortamı</td><td></td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G İğneler</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serolojik Pipet</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBoncuk</td><td>eBiyobilim</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

fare İskelet kasılarından tip i ve tip ii perisitlerin İzolasyonu

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Perisitler perivasküler multipotent hücreler olup, farklı organlarda hatta aynı dokuda heterojenlik gösterirler. İskelet kaslarında, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve ayırdedici özelliklere sahip en az iki perisit alt popülasyonu (tip I ve tip II olarak adlandırılır) bulunur. NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transgenik fareler kullanılarak, tip I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) ve tip II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) perisitler başarıyla izole edilmiştir. Bununla birlikte, bu çift transgenik farelerin mevcudiyeti bu saflaştırma yönteminin yaygın kullanılmasını engeller. Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna izin veren alternatif bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, floresanla aktive hücre ayırma (FACS) tekniğini kullanır ve Nestin-GFP sinyaliyle birlikte NG2 yerine PDGFRβ&#39;yı hedef alır. İzolasyondan sonra, I ve ty yazınPe II pericyitler farklı morfolojilere sahiptir. Buna ek olarak, çift transgenik farelerden izole edilenler gibi bu yeni yöntemle izole edilen tip I ve tip II perisitler sırasıyla adipojenik ve miyojeniktir. Bu sonuçlar, bu protokolün perisit alt popülasyonlarını iskelet kaslarından ve muhtemelen diğer dokulardan izole etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Lazer yoğunluğu ve kanal dengelemesi de dahil olmak üzere FACS parametreleri, lekesiz kontrol ve tek renkli kontrollerin sonuçlarına dayanarak düzeltilir. PDGFRβ-PE-FMO kontrolü, PDGFRβ-PE + popülasyonu için kapıyı ayarlamak için kullanılır ( Şekil 1A ). PDGFRβ-PE - hücreleri arasında, Nestin-GFP + ve Nestin-GFP&#39;yi temsil eden iki popülasyon açıkça ayrılır ( Şekil 1A ). PDGFRβ-PE +...

Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna olanak tanıyan bir FACS tabanlı protokolü açıklamaktadır.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Bu prosedürün genel amacı, iskelet kaslarından FACS kullanarak perisit alt popülasyonlarını izole etmektir. Bu yöntem, tip I ve tip II perisitler arasındaki biyolojik fark nedir gibi perisit biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajı, NG2 dsRED transgenini kullanmadan tip I ve tip II perisitlerin eş zamanlı olarak izole edilmesine olanak tanımasıdır.Bu protokolün uygulamaları iskelet kasları ile sınırlı değildir. Beyin gibi diğer organlardan perisitleri izole etmek için de kullanılabilir. Başlamak için, öncelikle nestin-GFP transgenik bir fareden istenilen dokuyu elde edin ve ardından dokuyu antibiyotik içeren buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.Ardından örnekleri steril 10 santimetrelik bir plağa aktarın. Sonrasında, steril makas ve bıçaklar kullanarak kasları bir ila iki milimetreküp boyutunda ince parçalara ayırın. Gerektiğinde, dokunun kurumasını önlemek için az miktarda DMEM ekleyin.Dokuyu mekanik olarak parçalamak için 10 mm'lik bir serolojik pipetle yukarı aşağı pipetleyin. Ardından karışıma, %0,2 Tip 2 kollajenaz ile desteklenmiş DMEM olan taze sindirim solüsyonu ekleyin ve örneği 37 °C'de, 35 RPM'de iki saat boyu

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, bir fare beyninden serebral perisitleri izole etmek için bir yöntemi göstermektedir. İzole edilen hücreler, perisit proliferasyonunu teşvik etmek için perisite özgü ortamda kültürlenir.

Fare Serebral Perisitlerinin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Myofibers izolasyonu ve kültürü altın...

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Biz, böylece yeni doğan düz kas hücresi kasılma ve gevşeme dahil sinyal yollarının daha iyi çalışma izin olarak, yeni ve P7 kadar küçük farelerden pulmoner arter düz kas hücrelerinin primer kültürleri (PASMC) izole etmek için kullanışlı bir teknik geliştirdik.

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Mikrovasküler endotel hücreleri iskelet kas (MMEC) kas kılcal iç duvar şekil ve her ikisi de, düzenleyen sıvıları/molekülleri ve geçiş (bağışıklık) hücre arasında kas doku ve kan değişimi. Birincil fare MMEC, yalıtım burada açıklandığı gibi kapsamlı tüp bebek araştırmalar "myovascular birimi" sağlar.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

Temel araştırma ve biyoloji ve tedavi potansiyelini araştırmak için murine kardiyak perisitleri izole etmek ve arındırmak için bir protokol optimize ettik.

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Biz murine serebral perisit lerin çıkarılması için bir protokol sıyoruz. Antibiyotiksiz zenginleştirme odaklı perisit çıkarma dayanarak, bu protokol, böylece kullanılan deneysel hayvan sayısını azaltarak, yüksek saflık ve yüksek verim sağlayan in vitro çalışmalar için değerli bir araçtır.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

Burada, homozigot mutant Lamin Δ8-11 fare modeli, Emery-Dreifuss kas distrofisi (EDMD) için çok ciddi bir model erken doğum sonrası gelişim aşamalarında verimli bir şekilde tek kas lifleri elde etmek için bir yöntem öneriyoruz.

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Bu protokol, kas kök hücrelerinin ve fibro-adipojenik progenitörlerin farelerde bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar. Protokol, tek kas diseksiyonu, floresan aktive hücre sıralama ile kök hücre izolasyonu, immünofloresan boyama ile saflık değerlendirmesi ve 5-etinil-2'-deoksiüridin dahil etme testi ile S-faz girişinin kantitatif ölçümünü içerir.

Sessiz Kök Hücre Popülasyonlarının Bireysel İskelet Kaslarından İzolasyonu

ScRNA-seq gereksinimlerini karşılayan fare beyni kortikal perisitlerini elde etmek için, CD13⁺/CD31⁻ seçimine dayalı kritik optimize edilmiş bir FACS protokolü sunuyoruz. Ana iyileştirmelerimiz, hücre canlılığını ve RNA bütünlüğünü önemli ölçüde artırır ve güvenilir transkriptomik profilleme imkanı sağlar.

Fare Kortikal Dokusundan Perisitlerin Tek Hücreli Dizileme için FACS Kullanılarak İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin, fare iskelet kaslarından FACS ile Tip I ve Tip II perisitleri aynı anda izole etme yöntemini. Bu protokol, perisit biyolojisi ve rejeneratif tıp alanındaki araştırmaları kolaylaştırır.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet