Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, FACS kullanarak iskelet kaslarından perisitlerin alt popülasyonlarını izole etmektir. Bu yöntem, tip I ve tip II perisitler arasındaki biyolojik fark nedir gibi perisit biyolojisi alanındaki başlıca soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu protokolün ana avantajı, NG2 dsRED transgeni kullanılmadan tip I ve tip II perisitlerin aynı anda izolasyonuna izin vermesidir.

Bu protokolün uygulamaları sadece iskelet kasları ile sınırlı değildir. Perisitleri beyin gibi diğer organlardan izole etmek için de kullanılabilir. Başlamak için, önce istenen dokuyu bir nestin-GFP transgenik fareden elde edin ve ardından dokuyu antibiyotik içeren buz gibi soğuk PBS'de iki kez yıkayın.

Daha sonra numuneleri 10 santimetrelik steril bir plakaya aktarın. Daha sonra, steril makas ve bıçaklar kullanarak, kasları bir ila iki milimetre küp şeklinde ince parçalar halinde kesin. Gerekirse, dokunun kurumasını önlemek için az miktarda DMEM ekleyin.

Dokuyu mekanik olarak bozmak için 10 milimetrelik bir serolojik pipet ile yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, karışıma taze sindirim çözeltisi, %0.2 Tip 2 kollajenaz ile takviye edilmiş DMEM ekleyin ve numuneyi 35 RPM'de iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki saatlik inkübasyonun ardından, karışımı 18 gauge bir iğne ile titre edin ve elde edilen süspansiyonu beş dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.

Ardından, peleti %0.25 tripsin-EDTA içinde yeniden süspanse edin ve numuneyi 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra,% 20 FBS ile desteklenmiş 10 mililitre DMEM ekleyin ve numuneyi beş dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Peletlendikten sonra, hücreleri 10 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu beş dakika boyunca 500 x g'da döndürün.

Süpernatanı atın ve peleti 10 mililitre ayırma tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra, karışımı 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün ve elde edilen tek hücreli süspansiyonu 500 x g'da bir kez daha beş dakika santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri bir mililitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin, bunları hemositometre ile sayın ve mililitre başına beş kez 10 ila altıncı hücrenin süspansiyonunu elde etmek için daha da seyreltin.

Hücre sıralamasından önce, kontrolleri hazırlayın ve örnekleri metin protokolünde açıklandığı gibi boyayın. Sıralayıcıyı ve yazılımı açın ve istendiğinde 100 mikronluk bir sıralama çipini tarayın ve yerleştirin. Ardından, otomatik kurulum gerçekleştirmek için otomatik kurulum boncuklarını yükleyin.

Otomatik kurulum tamamlandıktan sonra Deney sekmesini açın ve Boş Şablon'a tıklayın. Ardından, Ölçüm Ayarları'na FL1 için DAPI, FL2 için Nestin-GFP ve FL3 için PDGFR-beta girin ve kalan kanalların kutularının işaretini kaldırın. 405, 488 ve 561 lazerleri etkinleştirin ve Yeni Deney Oluştur'a tıklayın.

Ardından, Ücretlendirme Sihirbazını Başlat seçeneğine tıklayın ve Ücretlendirme Sihirbazı yazılım komutlarını izleyin. Lekesiz kontrolü yükledikten sonra, Başlat'a tıklayın ve FSC ve BSC dedektörlerinin sensör kazancını ayarlamak ve popülasyonu ölçekte görselleştirmek için Dedektör Eşik Ayarları'nı seçin. Negatif popülasyonu histogramın sol tarafına yerleştirmek için floresan kanallarının kazanç düzeylerini ayarlayın ve Kaydet düğmesine tıklayarak verileri kaydedin.

Yazılım tarafından istendiğinde, tek renkli kontrolü yükleyin ve Başlat ve Kaydet'e tıklayarak verileri kaydedin. Ardından, histogramdaki pozitif popülasyonun kapısını kapatın ve İleri'ye tıklayın. Telafi yapmak için Ücret sekmesini açın, Matrisi Hesapla'yı seçin, ardından Ücret Hesaplama Ayarları panelini açın ve Hesapla'ya tıklayın.

Hesaplama tamamlandıktan sonra, Ücret Sihirbazı'nı kapatmak için Son'u tıklatın. Artık kompanzasyon gerçekleştirildiğine göre, PDGFR-beta boyama için FMO kontrolünü yükleyin. Başlat'a tıklayın.

Tüm Olaylar grafiğinde, bir yavru nüfus grafiği oluşturmak için Kapı A'ya çift tıklayın. Ardından, yavru grafiğin y eksenini DAPI'ye atayın ve yalnızca canlı hücrelerden oluşan B Kapısı'nı çizin. Başka bir alt çizim oluşturduktan sonra, x eksenini FSC-H'ye ve y eksenini FSC-W'ye atayın ve C Kapısını tek hücre popülasyonunun etrafına çizin.

C Kapısı için, Nestin-GFP'ye karşı PDGFR-beta'nın bir alt grafiğini oluşturun. Ardından, verileri kaydetmek için Kaydet düğmesine tıklayın. Son olarak, örneği yükleyin, verileri kaydedin ve ardından örneği korumak için Duraklat'a tıklayın.

PDGFR-beta pozitif ve Nestin-GFP pozitif hücreler için geçit sınırlarını ayarlayın ve Tip I ve Tip II perisit popülasyonları için kapılar oluşturun. Burada, PDGFR-beta-PE-FMO Kontrolünde Tip I ve Tip II perisitler için geçit sınırları gösterilmektedir. Sıralama Yöntemi sekmesinde, İki Yönlü Tüpler'i seçin ve sol ve sağ toplama tüplerine tip I ve tip II perisitleri atayın.

Toplama aşamasına beş mililitre ayırma tamponu ile önceden doldurulmuş 15 mililitrelik toplama tüplerini yerleştirin ve Toplamayı Yükle düğmesine tıklayın. Örneği çalıştırmak için Sürdür düğmesine tıklayın ve hücreleri toplamak için Sıralamayı Başlat'a tıklayın. Sıralandıktan sonra, hücreleri beş dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.

Elde edilen peleti bir mililitre perisit ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometrede sayın. Her iki tipteki tohum perisitleri, santimetre kare başına yaklaşık bir kez 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda poli-D-lizin ile önceden kaplanmış lameller içeren 24 oyuklu bir plakada. Hücreleri 0.5 mililitre perisit ortamında üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin.

3 günlük inkübasyondan sonra, perisit morfolojisini inceleyin ve bir floresan mikroskobu altında, endojen nestin GFP ekspresyonlarını değerlendirin. Ardından, hücre farklılaşmasını başlatmak için perisit ortamını 0.5 mililitre adipojenik veya miyojenik ortamla değiştirin. Ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin.

14 günlük farklılaşmadan sonra, perilipin ve s-miyozini görselleştirmek için perisitleri boyayın ve hücreleri floresan mikroskobu altında görüntüleyin. Burada, izolasyonu takiben üç gün boyunca perisit ortamında büyütülen tip I ve tip II perisitlerin mikroskobik görüntüleri sunulmaktadır. Tip I perisitler, kısa çıkıntılara sahip yuvarlak hücre gövdeleri ve endojen GFP ekspresyonunun eksikliği ile karakterize edildi.

Tip II perisitler, uzun ve ince süreçlere sahip küçük hücre gövdelerine sahipti ve endojen GFP ekspresyonu göstermişlerdi. Her iki hücre tipi de dipojenik bir ortamda kültürlendiğinde, tip I perisitler, bir adiposit markörü olan perilipinin belirgin ekspresyonu ile kanıtlandığı gibi, adipositlere farklılaştı. Aksine, Tip II perisitler dipojenik bir farklılaşmaya cevap vermedi.

Son olarak, her iki tipin perisitleri miyojenik ortama farklı tepkiler göstermiştir. Tip I perisitler miyositlere farklılaşmazken, tip II perisitler, miyojenik aktivitelerini doğrulayan s-miyozin pozitif boyama ile kanıtlandığı gibi miyotüpler oluşturdu. Bu prosedürü denerken, geçit sınırlarını belirlemek için FMO kontrollerini dahil etmek önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması ile tip I ve tip II perisitlerin iskelet kasından nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.