Name: Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Öğrenin, bitki hücre duvarında lignin, selüloz ve hemiselülozu Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizle görselleştirme yöntemini. Bu teknik, biyokütle araştırmalarında yıkıcı olmayan kimyasal haritalama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mali destek için Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı&#39;na (2016YDF0600803) teşekkür ediyoruz.

1. Numune Hazırlama <ol><li> Bitki örneğinden küçük bir doku bloğu (yaklaşık 3 mm x 3 mm x 5 mm) kesin ( örn. Kavak kökü). </li><li> Dokuyu 30 dakika kaynar deiyonize suya daldırın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca hemen deiyonize suya aktarın. Doku, kabın altına sızana kadar bu adımı tekrarlayın; dokudaki havanın alınmış olduğunu ve dokunun yumuşadığını belirtin. Not: Bu adımdan önce altına batan numuneler için, genellikle bu döngüyü 3-5 kez tekrarlayın. </li><li> Deiyonize suyun içindeki 20, 50, 70, 90% (h / h) miktarlardaki polietilen glikol (PEG) ve saf PEG&#39;yi hazırlayın ve solüsyonları 65 ° C&#39;de tutun. </li><li> Suyu, yerinden çıkartmak ve PEG&#39;nin sızmasına izin vermek için, dokuyu bir dizi dereceli PEG banyosunda inkübe edin. Not: Genellikle, molekül ağırlığı 2,000 olan (PEG2000) PEG, gömme için kullanılır. <ol><li> Doku g ile işleyin(A) 1 saat boyunca% 20 PEG, (b) 1.5 saat boyunca% 50 PEG, (c) 2 saat boyunca% 70 PEG, (d) 2 saat boyunca% 90 PEG, ve (E)% 10 PEG ile 10 saat. </li></ol></li><li> Kaseti 65 ° C&#39;de fırında önceden ısıtın. Bloğu içeren PEG&#39;yi kasete dökün ve daha sonra önceden ısıtılmış cımbız veya iğne kullanarak doku bloğunu istenen bir yere yerleştirin. </li><li> Kaseti yavaşça soğutun ve doku kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Keskin bir tıraş bıçağı kullanarak küçük bir blok (yaklaşık 1 cm x 1 cm x 2 cm) içine hedef doku içeren PEG bloğu parçalayın ve mikrotom üzerine monte edin. </li><li> PEG bloğundan ince kesitleri kesin (tipik olarak 3-10 μm). </li><li> PEG&#39;yi dokudan çıkartmak için, bölmeyi deiyonize su ile bir saat camında 10 kez durulayın. </li><li> Ekstraktları çıkarmak için bölümleri toluen / etanol (2: 1, v / v) ile 6 saat bekletin. 65 mL deiyonize su, 0.5 mL asetik asit ve 0.6 g sodyum klorür karıştırılarak reaksiyon sıvısı hazırlanır.Bir kapta ritüel edin. 5 mL şişeye bir bölüm ve 3 mL reaksiyon sıvısı ekleyin. Şişenin üst kısmını vidalayın. </li><li> Dokunun lignini çıkarmak için şişeyi 75 ° C&#39;de 2 saat boyunca su banyosunda ısıtın. Parçayı deiyonize su ile 10 kez saat camında yıkayın. </li><li> İşlenmemiş / tasfiye edilmemiş bölümü cam mikroskop lamı üzerine aktarın. Fırçaları veya iğneleri kullanarak bölümü dikkatle açın. Ekstra deiyonize suyu kağıttan kağıtla çıkarın. </li><li> Kesiti D 2 O içine sokun. Numuneyi bir cam kapak folyosuyla örtün. D2O&#39;nun buharlaşmasını önlemek için kapak kağıdını oje ile mühürle. </li></ol> 2. Spektral Edinme <ol><li> Konfokal Raman mikroskopunun cihaz çalıştırma yazılımını açın. Lazeri açın (dalga boyu = 532 nm), 100X mikroskop objektifli kristal silisyumun yüzeyine odaklayın ve cihazı kalibre etmek için kalibrasyon düğmesine tıklayın. </li><li> Aleti değiştirOptik mikroskop moduna geçirin ve mikroskop lambasını açın. Mikroskop lamı, objektife bakacak şekilde kapak kaymasıyla birlikte sahneye monte edin. </li><li> 20X mikroskop objektifle örneği inceleyin ve ilgi alanını bulun. Lamel içine daldırma yağı uygulayın ve daldırmalı mikroskop objektif (60X, sayısal diyafram NA = 1.35) geçiş yapın. Numunenin yüzeyine odaklanın. </li><li> Cihazı, Raman test moduna getirin ve mikroskop lambasını kapatın. </li><li> Dikdörtgen bir araç kullanarak bir haritalama alanı seçin. Elde edilen spektrumların sayısını belirlemek için adım boyutunu değiştirin. Not: Adım boyutunun farkında olun (genellikle objektifin sayısal diyaframı ile hesaplanan spot çapından daha büyük, teorik olarak 1.22λ / NA). Bunun altındaki boyutlar aşırı örneklemeye neden olur. </li><li> Uygun bir edinim zamanında (genellikle &lt;8 saat) en iyi sinyal-gürültü oranı (SNR) ve spektral kaliteyi elde etmek için optimum spektral parametreleri ayarlayın, depeNumunenin uygunluğuna değinerek. Genellikle, görüntüleme parametrelerini cihaz yazılımında aşağıdaki gibi girin: lazer (532 nm), filtre (100%), delik (300), yarık (100), spektrometre (1,840 cm -1 ), oluklar (1200 t), objektif 60X yağ) ve edinme süresi (2 s). </li><li> Veri işleme öncesinde spektral verileri saklayın ve evrensel bir biçime ( ör. TXT dosyaları) dönüştürün. </li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Spektral verileri (TXT dosyaları) veri analizi yazılımına yükleyin ( örn., Matlab). SNR&#39;yi iyileştirmek için veri kümesindeki bir gürültü azaltma tekniği uygulayın ( örneğin, Savitzsky-Golay algoritması veya dalgacık algoritması) </li><li> Lignin ve polisakarit görüntüleri üretmek için işlem görmemiş numuneler kullanın. Lignin görüntülemede, aromatik halka simetrik gerilme titreşiminden dolayı 1,600 cm -1 civarında spektral zirveyi göz önünde bulundurun. Polisakkarit görüntüleme (selüloz ve hemiselüloz dahil) için, spektral zirveyi aCH ve CH 2 gerilmelerinden dolayı 2,889 cm -1 yuvarlaktır. </li><li> Selüloz ve hemiselüloz görüntüleri oluşturmak için lekeleyici örnekleri kullanın. Elde edilen spektrumlarda selüloz ve hemiselülozun spektrumlarını ayırt etmek ve dağılımlarını görüntülemek için kendinden modelleme eğrisi çözünürlüğü (SMCR) uygulayın. </li><li> Farklı hücre duvarı katmanlarından Raman spektrumlarını ayırt etmek için elde edilen verilere temel bileşen analizi (PCA) ve kümeleme analizi uygulayın. </li></ol>

<ol><li>Gonzalo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Enzymes+Involved+in+Lignin+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation.</a> J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).</li>
<li>Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosatella%2C+AA+%22Ionic+Liquids+in+the+Biorefinery+Concept%3A+Challenges+and+Perspectives%22">Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives</a>. , Wiley. 38-64 (2016).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+tissue+specific+compositions+of+bioenergy+feedstocks+Through+hyperspectral+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%22%5BJournal%5D)">Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging.</a> Bio. 108 (2), 286-295 (2009).</li>
<li>Tolstik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+prediction+of+HCC+tissues+by+Raman+imaging+with+identification+of+fatty+acids+as+potential+lipid+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).</li>
<li>Schrader, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchrader%2C+B+%22Infrared+and+Raman+spectroscopy%3A+methods+and+applications%22">Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications</a>. , John Wiley and Sons. (2008).</li>
<li>Gierlinger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+plant+cell+walls+by+confocal+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).</li>
<li>Luca, A. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).</li>
<li>Schlücker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+comparison+of+point%2C+line%2C+and+wide-field+imaging+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies.</a> Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).</li>
<li>Cooper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169743998001749">Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications.</a> Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).</li>
<li>Cheng, H. J., Hsiau, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003259101000046X">The study of granular agglomeration mechanism.</a> Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+removing+spectral+contaminants+to+improve+analysis+of+Raman+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data.</a> Sci. Rep. 6, 39891(2016).</li>
<li>Shinzawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jrs.2525/abstract">Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging.</a> J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).</li>
<li>Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1267173">Self modeling curve resolution.</a> Technometrics. 13, 617-633 (1971).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+automatically+identifying+spectra+of+different+wood+cell+wall+layers+in+Raman+imaging+data+set%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set.</a> Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).</li>
<li>Kudelski, A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039914008001641">Analytical application of Raman spectroscopy.</a> Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bitki hücre duvarı, hücre köşesi (CC), ikincil duvar (SW, S1, S2 ve S3 katmanları) ve bileşik orta lamel (CML, orta lamel artı birincil birincil Duvar), bu da numunenin hazırlanması sırasında düz bir yüzey elde edilmesini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, ahşaptan daha karmaşık bir yapıya sahip bitki örnekleri, özellikle çim, çoğunlukla ince kesit vermeye izin vermek için katılaştırılmaya ihtiyaç duyar. PEG, suda çözünür olduğu için kesme ve Raman araştırması için ideal bir sert matristir. Deiyonize suyla durulama ile kola...

Bitki biyokütlesi, Dünya'daki en bol yenilenebilir kaynaktır; esas olarak lignin, selüloz ve hemiselülozdan oluşur; ve çekici bir biyoenerji ve biyo-bazlı kimyasal kaynağı olarak kabul edilir1. Ne yazık ki, bozulmaya direnebilir ve bitki hücre duvarına hidrolitik stabilite veya yapısal sağlamlık kazandırabilir. Bu tür bir direnç, erişilebilir yüzey alanına, biyokütle partikül boyutuna, polimerizasyon derecesine, selüloz kristalliğine ve koruyucu lignin2'ye atfedilebilir. Bu nedenle, bitki hücre duvarının yapısal ve kimyasal doğasının kapsamlı bir şekilde anlaşılması, bitki biyolojisi ve kimyası açısından olduğu kadar ticari kullanım açısından da önemlidir. Kromatografi, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi gibi yaygın olarak kullanılan ıslak kimya analizleri, yalnızca ölçülen numunenin ortalama bileşim verilerini sağlar. Ayrıca, bu yöntemler invazivdir ve bitki dokusunun orijinal yapısını tahrip eder3. 
Raman görüntüleme tekniği, uzamsal olarak çözülmüş kimyasal bilgilerin tahribatsız görselleştirilmesi için güçlü bir araçtır4. Bir fotonla esnek olmayan saçılmaya neden olmak için bir lazer ışığı kullanır ve moleküler titreşimlerden kaynaklanan polarize edilebilirlikteki değişikliklere dayanır. Bu durumda, su zayıf Raman saçılımına neden olur, bu da bu yaklaşımı biyolojik örneklerin yerinde incelemeleri için uygun hale getirir5. Raman görüntüleme tekniğinin bitki hücre duvarına uygulanması, tek hücre ve hatta hücre duvarı katmanları ölçeğindeki çözünürlükle bitki hücre duvarlarının yapısını ve bileşimini doğal hallerinde açıklığa kavuşturabilir6. Bir bitki hücre duvarının tipik bir Raman görüntüleme analizi genellikle üç adımdan oluşur: 1) numune hazırlama, 2) spektral toplama ve 3) veri işleme. 
Raman görüntülemenin en büyük avantajlarından biri, minimum numune hazırlığı ile etiketsiz ve tahribatsız spektrumlar elde etme yeteneği olsa da, ilgilenilen yüzeyi ortaya çıkarmak için fiziksel numune kesitleme hala gereklidir. Teknik, optik focus7'nin korunmasına bağlı olduğundan, düz bir yüzey elde etmek için bu işlem dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Spektral alım, görüntü kalitesi ve kapsamlı alım süreleri arasında bir denge gerektirir8. Veri işleme, özellikle selüloz ve hemiselüloz gibi benzer kimyasal yapılara sahip bileşenler için görüntü verilerinden kimyasal bilgileri etkili bir şekilde çıkarmayı amaçlar. Güçlü spektral örtüşme nedeniyle, kesin spektrumları ayırt etmek zordur. Bu durumda, çok değişkenli analiz, saklanan yapısal ve kimyasal bilgileri etkili bir şekilde ortaya çıkarmak için basit bir yaklaşımdır9. Bu çalışma, lignin, selüloz ve hemiselüloz dahil olmak üzere bitki hücre duvarlarındaki ana bileşenleri görselleştirmek için Raman görüntülemenin kullanımını açıklayan genel bir protokol sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Termo Bilimsel Mikrom</td><td>HM430</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Raman mikroskobu</td><td>Horiba Jobin Yvon</td><td>Xplora</td><td></td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Şangay ZHICHENG</td><td>ZXFD-A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

bitki hücresi duvarında lignin, selüloz ve hemiselülozu görselleştirmek için raman görüntüleme ve Çok değişkenli analizin birleştirilmesi

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Raman görüntüsünün bitki biyokütle uygulamasına uygulanması, sulu çözeltiler üzerinde mekansal ve kompozisyonsal bilgi sunabileceği için artmaktadır. Analiz, genellikle kapsamlı numune hazırlığı gerektirmez; Yapısal ve kimyasal bilgiler etiketsiz olarak elde edilebilir. Bununla birlikte, her Raman görüntüsü binlerce spektrum içermektedir; Gizli bilgileri ayıklarken, özellikle de benzer kimyasal yapıya sahip bileşenler için güçlükler doğar. Bu çalışma, bu sorunu çözmek için çok değişkenli bir analizi ortaya koymaktadır. Protokol, bitki hücre duvarı içerisindeki lignin, selüloz ve hemiselüloz dahil olmak üzere ana bileşenleri görselleştirmek için genel bir yöntem oluşturmaktadır. Bu protokolde, numune hazırlama, spektral edinme ve veri işleme prosedürleri anlatılmıştır. Numune hazırlama ve veri analizinde operatör becerisine oldukça bağımlıdır. Bu yaklaşımı kullanarak, uzman olmayan bir kullanıcı tarafından bir Raman araştırması yapılabilir.H kalite verisi ve bitki hücre duvar analizi için anlamlı sonuçlar.

Şekil 1 , bir bitki hücre duvarının Raman görüntüsü için tipik bir mikro-Raman sistemine genel bir bakış sunmaktadır. Örnek olarak, kavak ( Populus nigra L.) orijinal Raman spektrumlarında belirgin taban çizgileri ve sivri uçlar bulunur ( Şekil 2a ). Raman görüntüleme veri seti (APRI) için otomatik ön işleme yöntemini yaptıktan sonra, bu iki spektral kirletici başarıyla kaldırılır ( Şekil 2b</strong...

Bu protokol, bitki hücre duvarlarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizi kullanılarak görselleştirilmesi için genel bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Bu deneyin genel amacı, Raman görüntüleme ve çok değişkenli analiz yoluyla bitki hücre duvarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozun görselleştirilmesi için genel bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, ana kimyasal bileşenlerin bitki hücre duvarında nasıl dağıldığı gibi bitki biyokütlesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, minimum numune hazırlığı ile numune hakkında emek gerektirmeyen ve tahribatsız bilgilerin elde edilebilmesidir.Başlamak için, bitki örneğinden küçük bir doku bloğu kesin. Dokuyu 30 dakika boyunca kaynayan deiyonize suyun içinde bekletin. Ardından, dokuyu hemen oda sıcaklığındaki deiyonize suya aktararak 30 dakika bekletin.Dokudaki havanın atıldığını ve dokunun yumuşadığını gösteren, doku kabın tabanına çökene kadar bu adımı tekrarlayın. %20, %50, %70 ve %90'lık PEG ve deiyonize su alikotlarının yanı sıra saf PEG hazırlayın. Çözeltileri 65 °C'de tutun.Suyu uzaklaştırmak ve PEG'nin sızmasına izin vermek için dokuyu bir dizi dereceli PEG banyosunda inkübe edin. %20 PEG'de bir saat, %50 PEG'de bir buçuk saat, %70 PEG'de iki saat, %90 PEG'de iki saat ve %100 PEG'de 10 saat boyunca kurutun. Ardından, bir kaseti fırında 65 degrees Celsius sıcaklıkta önceden ısıtın.PEG içeren doku bloğunu kasede dökün ve ardından önceden ısıtılmış cımbız veya iğneler kullanarak doku bloğunu istenen konuma yerleştirin. Kasedi yavaşça soğutun ve dokuyu kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın. Hedef dokuyu içeren PEG bloğunu, keskin bir ustura bıçağı kullanarak küçük bir blok şeklinde ayırın.Küçük PEG bloğunu mikrotoma sabitleyin ve PEG bloğundan ince kesitler alın. Ardından, PEG'i dokudan uzaklaştırmak için kesitleri bir saat camı içerisinde deiyonize su ile 10 kez durulayın. Sonrasında, ekstraktif maddeleri gidermek için kesitleri altı saat boyunca toluen ve etanol içerisinde bekletin.Bir beher içinde 65 mL deiyonize su, 0,5 mL asetik asit ve 0,6 g sodyum klorürü karıştırarak reaksiyon sıvısını hazırlayın. Bir kesit ve 3 mL reaksiyon sıvısını 5 mL'lik bir viyale ekleyin. Viyalenin kapağını vidalayarak kapatın.Ardından, dokudaki lignini uzaklaştırmak için flakonu 75 °C'lik bir su banyosunda iki saat boyunca ısıtın. Kesiti, bir saat camı içerisinde deiyonize su ile 10 kez durulayın. Sonra, işlem görmemiş ve lignini uzaklaştırılmış kesiti cam bir mikroskop lamına aktarın.Kesiti fırçalar veya iğneler kullanarak dikkatlice açın. Fazla deiyonize suyu kağıt havlu ile alın. Ardından, kesiti döteryum okside daldırın.Numuneyi bir lamel ile kapatın. Döteryum oksit buharlaşmasını önlemek için lamelin kenarlarını oje ile mühürleyin. Konfokal Raman mikroskobunun cihaz işletim yazılımını açın.Lazeri açın ve 100x mikroskop objektifi ile kristal ve silikon yüzeyine odaklanın. Cihazı kalibre etmek için kalibrasyon düğmesine tıklayın. Cihazı optik mikroskop moduna getirin ve mikroskop lambasını açın.Mikroskop lamını, lameli objektife bakacak şekilde sahneye yerleştirin. Numuneyi 20x mikroskop objektifi ile görüntüleyin ve ilgi alanını belirleyin. İmmersiyon mikroskop objektifine geçiş yapın.Lam üzerine imersion yağı uygulayın, ardından numune yüzeyine odaklanın. Sonrasında, cihazı Raman test moduna getirin ve mikroskop lambasını kapatın. Dikdörtgen bir araç kullanarak bir haritalama alanı seçin.Elde edilen spektrumların sayısını belirlemek için adım boyutunu değiştirin. Adım boyutunun, objektifin sayısal açıklığı ile hesaplanan spot çapından daha büyük olması gerektiğini unutmayın. Bu değerin altındaki boyutlar aşırı örneklemeye yol açacaktır.En iyi sinyal-gürültü oranını ve spektral kaliteyi elde etmek için optimum spektral parametreleri ve örnek uygunluğuna göre uygun bir kazanım süresini belirleyin. Genel olarak, cihaz yazılımına görüntüleme parametrelerini 532 nanometre lazer dalga boyu, %100'lük bir filtre, 300'lük bir delik (hole), 100'lük bir yarık (slit), 1840 inverse centimeters'lik bir spektrometre, 1200T kanallar, 60x yağ daldırmalı objektif ve iki saniyelik bir kazanım süresi kullanarak girin. Veri işlemeden önce spektral verileri kaydedin ve metin protokolünde açıklandığı üzere veri analizine geçmeden önce verileri evrensel bir formata dönüştürün.Kavak hücre duvarının orijinal Raman spektrumları burada gösterilmektedir. Baz hattı kaymaları ve kozmik sıçramalar dahil olmak üzere iki ana gürültü sinyali, gerçek sinyallerle birlikte kanallara yansır. Bunlar veri analizinden önce temizlenmelidir.Bu gürültü sinyallerini ortadan kaldırmak için Savitzky-Golay algoritması veya wavelet algoritması gibi bir gürültü azaltma tekniği uygulanabilir. Lignin görüntüleme için, aromatik halkanın simetrik germe titreşiminden kaynaklanan 1600 cm⁻¹ civarındaki spektral tepeyi dikkate alın. Polisakkarit görüntüleme için, CH ve CH2 germeleri nedeniyle 2889 cm⁻¹ civarındaki spektral tepeyi kullanın.Ancak, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleri doğrudan oluşturulamaz. Bunların spektral özelliklerini açığa çıkarmak için delignifikasyon gerekli bir işlemdir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanmaktayız.Numune kesme işlemi ve veri analizinin kullanımı ile görünümü konusunda eğitim gerektirdiği için bu süreçte zorluklar yaşanabilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, in-situ yöntemleri kullanarak bitki hücre duvarı hakkında kimyasal bilgilerin nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bitki hücre duvarının dirençliliği gibi ek soruları yanıtlamak için, bu prosedürü takiben kimyasal ön işlem gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu yöntem, bitki hücre duvarı içindeki iç yapısal doğa ve topokimya hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer biyolojik örneklere de uygulanabilir.

combining-raman-imaging-multivariate-analysis-to-visualize-lignin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve polifenolik lignin bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol açıklar.

Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve duvar türetilen karbonhidrat bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Etiket lignin bitki hücre duvarlarında görselleştirme ve farklı dokuları, numune veya türlerin lignification karşılaştırılması sağladığını konfokal Raman mikroskobu dayalı bir yöntem sunulmaktadır.

Etiket- In situ</emBitki Hücre Duvarlar Lignification> Görüntüleme

Bitki hücre duvarı yapısı ve kimyası özellikleri, biyoyakıtlar ve biyo-malzemeler için ideal hammaddeleri belirlemek için değerlendirilir. Standart yöntemlerin büyük veri kümelerine uygulandığında sınırlamaları vardır. Bu yüksek verimli ön arıtma, enzim sakarifikasyonu ve piroliz-moleküler ışın kütle spektrometresi yöntemleri, çok sayıda biyokütle örneğini düşük deney süresi ve maliyeti ile karşılaştırır.

Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması

Kristalin selüloz, bitki hücre duvarının önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, hücresel bir çözünürlükte nicelleştirilmesi teknik olarak zordur.  Burada, uzay-zamansal bir çözünürlükte hücre duvarı bileşimi hakkında bilgi elde etmek için polarize ışık teknolojisinin ve kök kesitlerinin kullanımını rapor ediyoruz.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

BLISS, lignification dinamikleri, eğitim için bir çift etiketleme iletişim kuralı geliştirilmiştir. Sentetik monolignol kullanarak gazetecilere ve SPAAC ve CuAAC bioorthogonal sıralı bir arada tepkiler, bu metodoloji açıyor lignins planta içindeBiyogenez düzenleyen faktörler derinlemesine analiz için yolu tıklatın.

Lignification Dynamics ile tıklatın kimya tesislerinde görselleştirme: Çift etiketleme BLISS olduğunu!

Bu protokol, förster rezonans enerji transferini (FRET) rhodamine bazlı floresan problar ve lignin polimeri arasında doğrudan kalın bitki bölümlerinde değerlendirmek için spektral ve floresan ömür ölçümlerini birleştiren orijinal bir kurulum tanımlamaktadır.

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

Bu protokol, canlı insan meme kanseri hücrelerinin etiketsiz, non-invaziv fenotiplemesi için Raman spektroskopisi ve tomografik faz mikroskobunu birleştiren multimodal bir yaklaşım sunar. Hızlı, kantitatif morfo-kimyasal analiz için kullanıcı dostu, insan yanlılığı içermeyen bir analiz hattı içerir ve kanser araştırmaları ve hücre biyolojisindeki uygulamalarla ayrıntılı moleküler ve yapısal bilgiler sağlar.

Canlı Etiketsiz Meme Kanseri Hücrelerinin Fenotiplemesini Geliştirmek için Multimodal Bir Görüntüleme Çerçevesi

Bu yazıda, kağıt diskler üzerindeki antikorların kovalent immobilizasyonu için periyodik oksidasyon ve glutaraldehit çapraz bağlama yöntemleri sunulmuştur. İmmobilize antikorların bağlanma aktivitesi değerlendirildi. Bu sonuçlara dayanarak, immünoglobulin G (IgG) tespiti için yeni bir kağıt bazlı immünolojik test geliştirmek için bir glutaraldehit çapraz bağlama yöntemi kullanıldı.

Selüloz Kağıt Diskler ve Çıplak göz Kolorimetrik İmmüno Onların Uygulamaları antikorların bağlama Kovalent

Burada, siyanobakteriyel hücrelerdeki glikojen içeriğini ölçmek için güvenilir ve kolay bir test sunuyoruz. İşlem, çökeltme, seçilebilir depolimerizasyon ve glikoz artıklarının belirlenmesini gerektirir. Bu yöntem hem vahşi hem de genetik mühendisliği yapılmış suşlar için uygundur ve siyanobakterilerin metabolik mühendisliğini kolaylaştırabilir.

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Öğrenin, bitki hücre duvarında lignin, selüloz ve hemiselülozu Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizle görselleştirme yöntemini. Bu teknik, biyokütle araştırmalarında yıkıcı olmayan kimyasal haritalama sağlar.

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi (Video) | JoVE Journal

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

Daha fazla video keşfet