Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi
10 Haziran 2017
Bu protokol, bitki hücre duvarlarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizi kullanılarak görselleştirilmesi için genel bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.
Bu deneyin genel amacı, Raman görüntüleme ve çok değişkenli analiz ile bitki hücre duvarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozu görselleştirmek için genel bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem, ana kimyasal bileşenlerin bitki hücre duvarında nasıl dağıldığı gibi bitki biyokütlesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, minimum numune hazırlığı ile numune hakkında işçiliksiz ve tahribatsız bilgilerin elde edilebilmesidir.
Başlamak için, bitki örneğinden küçük bir doku bloğu kesin. Dokuyu 30 dakika kaynar deiyonize suya batırın. Daha sonra hemen 30 dakika oda sıcaklığında deiyonize suya aktarın.
Doku kabın dibine çökene kadar bu adımı tekrarlayın, bu da dokudaki havanın alındığını ve dokunun yumuşadığını gösterir. %20, 50, %70 ve% 90 oranında PEG ve deiyonize su ile saf PEG hazırlayın. Çözeltileri 65 santigrat derecede tutun.
Suyun yerini almak için dokuyu bir dizi kademeli PEG banyosunda inkübe edin ve PEG'nin sızmasına izin verin. Bir saat boyunca %20 PEG, bir buçuk saat %50 PEG, iki saat %70 PEG, iki saat %90 PEG ve 10 saat %100 PEG'de kurutun. Ardından, bir kaseti bir fırında 65 santigrat derecede önceden ısıtın.
PEG içeren doku bloğunu kasete dökün ve ardından doku bloğunu önceden ısıtılmış cımbız veya iğneler kullanarak istenen konuma yerleştirin. Kaseti yavaşça soğutun ve mendili kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın. Hedef dokuyu içeren PEG bloğunu keskin bir tıraş bıçağı kullanarak küçük bir blok halinde inceleyin.
Küçük PEG bloğunu mikrotomun üzerine monte edin ve PEG bloğundan ince bölümler kesin. Ardından, PEG'yi dokudan çıkarmak için bölümleri bir saat sınıfında 10 kez deiyonize su ile durulayın. Daha sonra, ekstraktları çıkarmak için bölümleri altı saat boyunca toluen ve etanol ile daldırın.
Bir beherde 65 mL deiyonize su, 0.5 mL asetik asit ve 0.6 g sodyum klorürü karıştırarak reaksiyon sıvısını hazırlayın. 5 mL'lik bir şişeye bir bölüm ve 3 mL reaksiyon sıvısı ekleyin. Şişenin üstünü vidalayın.
Daha sonra, dokunun ligninini çıkarmak için şişeyi iki saat boyunca 75 santigrat derecede bir su banyosunda ısıtın. Bölümü bir saat camında deiyonize su ile 10 kez durulayın. Daha sonra, işlenmemiş ve odunlaşmış bölümü bir cam mikroskop lamına aktarın.
Fırça veya iğne kullanarak bölümü dikkatlice açın. Fazla deiyonize suyu kağıt mendil ile çıkarın. Ardından, bölümü döteryum okside batırın.
Numuneyi bir cam kapak astarı ile örtün. Döteryum oksidin buharlaşmasını önlemek için kapak fişini oje ile kapatın. Konfokal Raman mikroskobunun cihaz işletim yazılımını açın.
Lazeri açın ve 100x mikroskop objektifi ile kristal ve silikonun hizmetine odaklanın. Cihazı kalibre etmek için kalibrasyon düğmesine tıklayın. Cihazı optik mikroskop moduna getirin ve mikroskop lambasını açın.
Mikroskop slaytını, kapak sürgüsü objektife bakacak şekilde sahneye monte edin. Numuneyi 20x mikroskop objektifi ile görüntüleyin ve ilgilenilen alanı bulun. Daldırma mikroskobu objektifine geçin.
Kapak kızağına daldırma yağı sürün, ardından numunenin yüzeyine odaklanın. Ardından, cihazı Raman test moduna geçirin ve mikroskop lambasını kapatın. Dikdörtgen bir araç kullanarak bir eşleme alanı seçin.
Elde edilen spektrum sayısını belirlemek için adım boyutunu değiştirin. Adım boyutunun, hedefin sayısal açıklığı ile hesaplanan nokta çapından daha büyük olması gerektiğini unutmayın. Bunun altındaki boyutlar aşırı örneklemeye neden olur.
En iyi sinyal-gürültü oranını ve spektral kaliteyi elde etmek için optimum spektral parametreleri ve numune uygunluğuna bağlı olarak uygun bir alım süresini ayarlayın. Genel olarak, 532 nanometrelik bir lazer dalga boyu, %100'lük bir filtre, 300'lük bir delik, 100'lük bir yarık, 1840 ters santimetrelik bir spektrometre, 1200T'lik oluklar, 60x yağ hedefi ve iki saniyelik bir edinme süresi kullanarak görüntüleme parametrelerini cihaz yazılımına girin. Veri işlemeden önce spektral verileri kaydedin ve metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizine devam etmeden önce verileri evrensel bir formata dönüştürün.
Kavak hücre duvarının orijinal Raman spektrumları burada gösterilmektedir. Temel kaymalar ve kozmik ani yükselmeler dahil olmak üzere iki ana gürültü sinyali, gerçek sinyallerle birlikte kanallara yayılır. Bunlar veri analizinden önce kaldırılmalıdır.
Bu gürültü sinyallerini ortadan kaldırmak için Savitzky-Golay algoritması veya dalgacık algoritması gibi bir gürültü azaltma tekniği uygulanabilir. Lignin görüntüleme için, aromatik halka simetrik germe titreşimi nedeniyle 1600 ters santimetre civarındaki spektral zirveyi düşünün. Polisakkarit görüntüleme için, CH ve CH2889 gerilmeleri nedeniyle 2 ters santimetre civarında spektral zirveyi kullanın.
Bununla birlikte, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleri doğrudan oluşturulamaz. Delignifikasyon, bunların spektral özelliklerini ortaya çıkarmak için gerekli bir prosedürdür. Genel olarak, bu yöntemde yeniyiz.
Mücadele ediyoruz, çünkü numune kesitlerinin ele alınması ve görünümü ve veri analizi konusunda eğitim gerektiriyor. Bu videoyu izledikten sonra, yerinde yöntemler kullanılarak bitki hücre duvarı hakkında kimyasal bilgilerin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, bitki hücre duvarının inatçılığı gibi ek soruları yanıtlamak için kimyasal ön işlem gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.
Bu yöntem, bitki hücre duvarı içindeki iç yapısal yapı ve topokimya hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer biyolojik örneklere de uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, Raman görüntüleme ve çok değişkenli analiz kullanarak bitki hücre duvarlarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozu görselleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, bitki biyokütlesinin kimyasal bileşimi hakkında tahribatsız bilgiler sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki Biyolojisi
- Biyokütle Araştırmaları
- Analitik Kimya
Arka Plan
- Bitki hücre duvarı kompozisyonunu anlamak, biyokütle kullanımı için kritik öneme sahiptir.
- Raman görüntüleme, bitki dokularının ayrıntılı kimyasal haritalanmasına olanak tanır.
- Çok değişkenli analiz, görüntülemeden elde edilen karmaşık verilerin yorumlanmasına yardımcı olur.
- Bu yöntem, numune hazırlığını minimize eder ve tahribatsızdır.
Çalışmanın Amacı
- Bitki hücre duvarlarındaki ana kimyasal bileşenlerin dağılımını görselleştirmek.
- Bitki biyokütlesini analiz etmek için emek gerektirmeyen bir yöntem sağlamak.
- Bitki hücre duvarı yapısı ve bileşimi hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Bitki örneklerinden küçük doku bloklarının kesilmesi.
- Dokunun 30 dakika boyunca kaynayan deiyonize su içerisinde bekletilmesi.
- Dokunun 30 dakika boyunca oda sıcaklığındaki deiyonize suya aktarılması.
- Görselleştirme için Raman görüntülemenin ve veri yorumlama için çok değişkenli analizin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Lignin, selüloz ve hemiselülozun başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Hücre duvarlarındaki kimyasal bileşenlerin dağılım modellerinin gösterilmesi.
- Bitki dokularının analizi için tahribatsız bir yöntem sağlanması.
- Bitki biyokütle uygulamalarındaki ileri araştırmaların kolaylaştırılması.
Sonuçlar
- Yöntem, bitki hücre duvarı bileşimini incelemek için etkilidir.
- Multivaryat analizle birleştirilen Raman görüntüleme, değerli bilgiler sunar.
- Bu yaklaşım, bitki biyolojisi ve biyokütle kullanımı alanındaki araştırmaları geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Bu yöntem, bitki hücre duvarlarındaki ligninin, selülozun ve hemiselülozun tahribatsız ve markörsüz görselleştirilmesini sağlayarak, biyokütle dönüşümü ve biyotabanlı malzeme geliştirme süreçlerinde mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Uzamsal olarak çözümlenmiş kimyasal kompozisyon verileri sunarak, enzim mühendisliği ve ön işlem optimizasyonu için hedef doğrulama süreçlerine yardımcı olur. Bu yaklaşım, tahribatlı analizlere olan bağımlılığı azaltır ve erken aşama biyokütle tarama iş akışlarında öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sindeki Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Biyokütle direnci ve enzim erişilebilirliği hakkındaki hipotezleri bilgilendirmek için bitki hücre duvarı mimarisinin incelenmesini sağlar.
- Operasyonel Değer: Kimyasal dağılımı enzimatik sindirilebilirlik sonuçlarıyla ilişkilendirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Biyokütle varyantlarının yüksek kapasiteli taraması için standardize edilebilen kantitatif spektral çıktılar üretir.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir numune hazırlama ve eğitim sonrası operatöre bağlı değişkenliğin minimize edilmesi yoluyla analiz hazırlığını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hücre duvarı bileşimini biyokütle verimi ve işleme verimliliğindeki fenotipik özelliklerle ilişkilendirerek hastalıkla ilgili sistem öngörüleri sağlar.
- Operasyonel Değer: Örnek setleri genelinde tutarlı, etiketsiz bileşim verileri sunarak keşif aşamasından preklinik ölçeklendirmeye kadar süreklilik sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece uyum sağlayarak erken biyokütle karakterizasyonunu destekler ve enzim ile ön işlem geliştirme hatlarında veri odaklı kararlar alınmasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Lignin-polisakkarit ağlarının doğrudan görselleştirilmesi yoluyla, biyokütle yıkımının önündeki yapısal engellere yönelik hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Hücre duvarı kompozisyonundaki genetik veya işlem kaynaklı değişikliklerin karşılaştırılmasına olanak tanıyan, analize hazır ve mekansal olarak çözünür kimyasal haritalar sunar.
- Analizler: Bileşen dağılımını ve ko-lokalizasyonunu nicelleştiren çok değişkenli çıktılar oluşturarak, farklı deneysel koşullar arasında objektif karşılaştırma yapılmasına imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Biyoyakıt veya biyoprodukt yollarında biyokütle uygunluğunu değerlendirmek için kompozisyonel kıyaslama noktaları sağlayarak preklinik doğrulamaya bağlanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla biyokütle ham maddesi ve proje aşamasında uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir görüntüleme ve analiz platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Biyokütle direncinin mekanistik belirsizliğini azaltarak hedef seçimindeki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış spektral veri toplama ve veri işleme protokolleri aracılığıyla standardizasyonu ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken aşamada kompozisyonel risk değerlendirmesi sağlayarak biyokütle suşu veya ön işlem geliştirme süreçlerindeki karar verme aşamalarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış yapısal ve kompozisyonel profillere dayanarak biyokütle hedeflerinin riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Raman spektroskopisi, çok değişkenli veri analizi ve bitki dokusu işleme konusunda uzmanlık gerektirir.
- Uygun lazer dalga boylarına ve objektiflere sahip konfokal Raman mikroskoplarına erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilirliği sağlamak için numune hazırlama, kesitleme ve veri yorumlama süreçlerinde ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Yöntemin, farklı hücre duvarı karmaşıklığına sahip çeşitli bitki türlerine veya doku tiplerine uygulanması durumunda adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Selüloz ve hemiselüloz sinyallerini ayırt edebilmek için lignin giderme ihtiyacı ile sınırlıdır; bu durum prosedür adımlarını ve potansiyel değişkenliği artırır.
