Name: Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Keşfedin, histon antikor özgüllüğünü peptit mikroarraylerle analiz etme yöntemini. Kromatin biyokimyası ve epigenetik araştırmalarında antikor kalite kontrolü için bu entegre pipeline'ı öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen Van Andel Araştırma Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüsünden (CA181343) SBR&#39;e verilen bir araştırma ödeneği ile desteklendi

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Biyomedikal araştırma uygulamalarında antikor güvenilirliği en iyisi 46 , 47 . Bu, özellikle histamin PTM&#39;lerinin bolluğu ve dağılımını karakterize etmek için geliştirilen teknikler için anahtar araçlar olarak antikorların bulunduğu kromatin biyokimyasında geçerlidir. Burada sunulan protokol, histon PTM antikor özgünlüğünü analiz etmek için peptit mikrodizilerinin tasarım, imalat ve kullanımı için optimize edilmiş bir boru hattı detaylandırmaktadır. Bu boru ...

Genomik DNA, kromatin oluşturmak için ökaryotik hücre çekirdeğinin içinde histon proteinleri ile zarif bir şekilde paketlenmiştir. Kromatin tekrarlayan altbirimi, H2A, H2B, H3 ve H4 1 oktamerik bir çekirdek histon proteinleri etrafında sarılan 147 baz çift DNA&#39;dan oluşan nükleozomdur. Kromatin genel olarak gevşek biçimde paketlenmiş ökromatin ve yoğun sıkıştırılmış heterokromatin alanlar halinde düzenlenir. Kromatin sıkıştırma derecesi, protein makineleri, kopyalama, kopyalama ve onarım gibi temel DNA şablonlu işlemleri gerçekleştirmek için altta yatan DNA&#39;ya ne ölçüde erişebildiğini düzenler. Genetik erişilebilirliğin kromatin bağlamındaki kilit düzenleyicileri histon proteinlerinin yapılandırılmamış kuyruk ve çekirdek alanlarındaki 2 , 3 PTM&#39;leridir. Histon PTM&#39;leri doğrudan kromatin 4&#39;ün yapısını etkiler ve dolaylı olarak işlev görürlerh okuyucu proteinleri ve kromatin remodeling, enzimatik ve iskele aktivitelerini 5 sahip ilişkili makromoleküler kompleksler işe. Son iki on yılda histon PTM fonksiyonu üzerine yapılan çalışmalar, bu işaretlerin hücre akıbetini, organizma gelişimini ve hastalık başlatma / ilerlemesini düzenleyen önemli rol oynadığını göstermektedir. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik teknolojideki ilerlemelerle beslenen 80&#39;den fazla farklı histon artıkları üzerinde 20&#39;den fazla benzersiz histon PTM&#39;si keşfedildi 6 . Özellikle, bu modifikasyonlar sıklıkla kombinasyon halinde ortaya çıkmakta ve &quot;histon kodu&quot; hipotezi ile tutarlı bir şekilde sayısız araştırma, histon PTM&#39;lerinin 7 , 8 , 9&#39;un spesifik kombinasyonlarının tanınması yoluyla okuyucu proteinlerinin farklı kromatin bölgelerini hedef aldığını göstermektedir. Önemli bir zorluk, işlevleri GrHistone PTM&#39;lerinin listesine bağlı olarak ve belirli histone PTM kombinasyonlarının kromatin ile ilişkili dinamik fonksiyonları nasıl düzenlediğini belirlemek için kullandı. Antikorlar, histon PTM&#39;lerinin tespiti için linç pinin reaktifleridir. Bu nedenle, kromatin biyokimya araştırmasında kullanılmak üzere 1.000&#39;den fazla histon PTM&#39;ye spesifik antikor ticari olarak geliştirilmiştir. Yüksek verimli DNA dizileme teknolojisinin hızlı gelişimi ile bu reaktifler, ChIP-seq&#39;deki bireysel araştırmacılar ve büyük ölçekli epigenomik &quot;yol haritası&quot; girişimleri ( örn. , ENCODE ve BLUEPRINT) tarafından geniş ölçüde kullanılmaktadır (kromatin immüno çökeltme, yeni nesil sıralama ) Histonun yüksek çözünürlüklü mekânsal haritalarını üretmek için boru hatları PTM dağıtım genomu genişliği 10 , 11 . Bununla birlikte, son çalışmalar histon PTM antikorlarının özgüllüğünün oldukça değişken olduğunu ve bu reaktiflerin unf<html> Hedef dışı epitop tanıma, komşu PTM&#39;ler tarafından güçlü pozitif ve negatif etki ve belirli bir kalıntı ( örn. , Mono-, di- veya tri-metillisin) 12 , 13 , 14 , 15&#39;deki modifikasyon sırasını ayırt etme zorluğu gibi avorable özellikler , 16 , 17 , 18 . Bu nedenle, bu değerli reaktiflerle üretilen verileri doğru bir şekilde yorumlamak için histon PTM&#39;ye özgü antikor reaktiflerinin titiz kalite kontrolü gereklidir. Mikroarray teknolojisi, binlerce makromoleküler etkileşimin aynı anda yüksek verimli, tekrarlanabilir ve minyatür formatta sorgulanmasını sağlar. Bu nedenle protein-DNA 19&#39;u analiz etmek için çeşitli mikrodizim platformları yaratılmıştır ,&quot;&gt; 20, protein-protein 21 ve protein-peptid etkileşimlerinin 22. Gerçekten de, histon peptid mikrodizileri yazarlar, silgi yüksek verimli profil sağlayan kromatin biyokimya araştırma için bilgi keşif platformu olarak ortaya çıktı ve histonun okuyucuları PTMS 15 adres , 23 , 24 ve ayrıca histone antikor özgünlüğünün analizi için 17 , 25. Histon peptit dizileri, kromatin ve epigenetik araştırmalarının ötesinde, sistemik lupus eritematosus ve diğer otoimmün hastalıkların teşhis / prognostik testi olarak potansiyel bir kullanıma sahiptir; kromatin otoantikorları, 27 26 oluşturulur. Burada, tasarım, imalat ve que için geliştirdiğimiz entegre bir boru hattı tanımlıyoruzHistonları ve PTM&#39;lerini tanıyan antikorlar için özgüllük profilleri üretmek için histon peptidi mikrodizileri kullandı. Boru hattı, yakın zamanda geliştirdiğimiz, mikroarray deneylerinin tasarım ve analiz aşamalarını bütünleştiren, açık kaynaklı ve interaktif bir yazılım uygulaması olan ArrayNinja tarafından kolaylaştırıldı 28 . ArrayNinja, Google Chrome&#39;da en iyi şekilde çalışır. Kısacası, streptavidin kaplı cam mikroskop lamlarında belirli bir konumda biyotinle konjuge edilmiş histone peptidlerinin bir kütüphanesinin depolanması için bir robotik temas mikrodizisi yazıcı kullanılır. Ardından diziler, antikor-epitop etkileşimlerini sorgulamak için rekabetçi ve paralel bir tahlil formunda kullanılabilir ( Şekil 1 ). Peptid kütüphanesi, tek başına PTM&#39;leri (lizin asetilasyonu, lisin / arginin metilasyonu ve serin / treonin fosforilasyonu) içeren yüzlerce benzersiz sentetik peptid ve büyük oranda proteomik veri kümelerinden türetilen ilgili kombinasyonlardan oluşur. Peptid sentezi ve geçerliliği için yöntemler<html> Başka yerlerde detaylandırılmıştır 23 . Bu dizilim platformunu kullanarak halen devam eden histon PTM antikor tarama çabalarımızdan elde edilen veriler, halka açık bir web kaynağı, Histone Antikor Özgüllilik Veritabanı (www.histoneantibodies.com) üzerinde arşivlenir. Özellikle, bu protokolün çeşitlemeleri ile imal edilen histon peptit mikroarrayleri, histon PTM okuyucu alanlarının 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 ve daha yakın zamanda profil histonuna aktivitesini karakterize etmek için yaygın bir şekilde kullanılmıştır PTM yazar ve silgi faaliyetleri 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: Bir Histone Peptid mikroarrayinde Antikor Taramasının Kademeli Prosedürünün Çizgi Film Tasvirleri. Tanımlanmış translasyon sonrası modifikasyonları (kırmızı ve mavi daireler) barındıran biyotinlenmiş histon peptidleri, streptavidin kaplı cam üzerinde biyotin-floresein ile birlikte basılmıştır. Pozitif etkileşimler kırmızı floresans olarak görselleştirilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Baskı Tamponu</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin kaplı cam mikroskop slaytları</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polipropilen 384 kuyulu plaka</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-floresein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>kontakt mikrodizi yazıcı</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Mikrodizi Yazıcı</td></tr><tr><td>Kontak Mikrodizi Yazıcı</td><td>Gen Makineleri</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Mikrodizi Yazıcı</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Engelleme Tamponu</td><td>ArrayIt</td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik balmumu kalemi</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Hidrofobik Bariyer PAP</td></tr><tr><td>Kalem Silikon Conta</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Hibridizasyon Kabı</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>veya benzeri kap</td></tr><tr><td>Floresan boya konjuge ikincil antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (tavşan karşıtı)</td></tr><tr><td>Floresan boya konjuge ikincil antikor</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (fare karşıtı)</td></tr> <tr><td>Balmumu Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodizi Tarayıcı</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>veya eşdeğeri mikrodizi tarayıcı</td></tr><tr><td>EipTitan Histon Peptit Mikrodizi</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histon Peptit Mikrodizi</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODİFİYE HİSTON Peptit Dizisi</td><td>Aktif Motif</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Histon Kodu Peptit Mikrodizileri</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>Balmumu</td><td>Kraliyet Meşe</td><td>GulfWax</td><td>balmumu yazıcı için</td></tr><tr><td>Nemlendirilmiş Mikrodizi Slayt Hibridizasyon Odası</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek verimli mikroskop slayt yıkama odası</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slayt santrifüj</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Antikor 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Antikor 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş histon peptit</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Örnek peptit. Çeşitli modifikasyonlara sahip benzer peptitler, çeşitli ticari kaynaklardan temin edilebilir.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

histon antikor Özgüllüğünün peptit mikroarraylerle analizi

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Histon proteinleri üzerindeki translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM&#39;ler), kromatin yapısını ve gen ekspresyonunu düzenleme rolleri için geniş çapta incelenmektedir. Histon PTM&#39;lerine spesifik antikorların seri olarak üretilmesi ve dağıtımı, bu işaretler üzerinde araştırmayı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Histon PTM antikorları, birçok kromatin biyokimya uygulaması için önemli reaktifler olduğundan, doğru veri yorumlaması ve sahadaki ilerlemenin devam etmesi için antikor özgüllüğünün titiz analizi gereklidir. Bu protokol, histone antikorlarının spesifikliğini profillemek için peptit mikrodizilerinin tasarım, imalat ve kullanımı için entegre bir boru hattı tarif eder. Bu prosedürün tasarım ve analiz yönleri ArrayNinja tarafından kolaylaştırılmış ve açık kaynaklı ve etkileşimli bir yazılım paketi, son zamanlarda mikroarray baskı formatlarının uyarlanmasını hızlandırmak için geliştirdi. Bu boru hattı, piyasada bulunan ve yaygın olarak kullanılan histon PTM antibodisinin çok sayıda taranması için kullanılmıştırS ve bu deneylerden elde edilen veriler çevrimiçi ve genişletici bir Histon Antikor Özgüllilik Veritabanı aracılığıyla serbestçe elde edilebilir. Histonların ötesinde, burada açıklanan genel metod, PTM&#39;ye spesifik antikorların analizine genel olarak uygulanabilir.

Bu protokol, histone PTM antikor özgünlüğünün analizi için bir peptid mikroarray platformu tasarlamak ve üretmek için kullanılmıştır. Çekirdek ve varyant histon proteinleri 38 üzerinde bulunan PTMS bilinen kombinasyonların birçok temsil - (uzunluğu 40 kalıntıları 20) dizi 300&#39;den benzersiz peptid özellikleri bir kütüphane sorgular. Bu boru hattı, yaygın olarak kullanılan ve piyasada mevcut olan histon PTM antikorlarının taranması için bir çalışmacıdır ve tam v...

Bu el yazısı, histonları ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını tanıyan antikorların spesifiklik profiline peptid mikroarray teknolojisinin uygulanması için yöntemleri açıklamaktadır.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Bu videonun amacı, histon antikorlarının özgüllüklerini profillemek için peptit mikro dizileri tasarımının, üretiminin ve kullanımının entegre bir iş akışını tanımlamaktır. Histonları ve onların çeşitli post-translasyonel modifikasyonlarını tanıyan antikorlar, kromatin biyokimyası araştırmalarında temel reaktiflerdir. Histon modifikasyon fonksiyonuna dair anlayışımızı derinleştirmek için bu araçlara güveniyoruz.Güncel çalışmalar, histon antikor davranışlarında tutarsızlıklar olduğunu ortaya koymaktadır. Antikor seçimi, epigenetik deneylerdeki en kritik unsur olduğundan, bu reaktifler için kapsamlı ve titiz kalite kontrol önlemleri gerekmektedir. Burada, histonları ve bunların post-translasyonel modifikasyonlarını tanıyan antikorlar için özgünlük profilleri oluşturmak amacıyla geliştirdiğimiz peptid mikro dizileri tasarlama, üretme ve analiz etmeye yönelik entegre bir iş akışını sunmaktayız.Bu iş akışı, mikroarray deneylerinin tasarım ve analiz aşamalarını entegre eden ve tarafımızca geliştirilen, açık kaynaklı interaktif bir yazılım uygulaması olan Array Ninja ile kolaylaştırılmaktadır. Array slide tasarımına başlamak için, "plan a slide layout" başlığı altından kullanılacak mikroa

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, histon peptitleri üzerindeki translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler) tanıyan antikorların özgüllüğünü profillemek için peptit mikrodizi teknolojisini uygulayan bir tekniği göstermektedir. Bilinen PTM kombinasyonlarına sahip hareketsizleştirilmiş florofor konjuge histon peptitleri içeren bir mikrodizi slaytı, hedef PTM'ye özgü antikorlarla muamele edilir. Bu işlem, antikorun hedef için özgüllüğünü ve hedef olmayan PTM'lerle potansiyel çapraz reaktivitesini tanımlamaya yardımcı...

Antikorların Özgüllük Profili için Bir Peptit Mikroarray Teknolojisi

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Peptit dizisi taraması, protein-protein etkileşim bölgelerini tanımlamak için yüksek verimli bir testtir. Bu, bir hedef proteinin çoklu etkileşimlerinin haritalanmasına izin verir ve bir proteini hedef alan inhibitörler için bölgeleri belirlemek için bir yöntem olarak hizmet edebilir. Burada peptit dizilerini taramak ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

İn vivo protein-DNA etkileşimlerini haritalama yöntemleri, genomik araştırmanın her yönü için çok önemli hale geliyor, ancak zahmetli, maliyetli ve zaman alıcı. Burada, sınırlı miktarda hücre ile in vivo protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için kromatin immünopresipitasyonunu otomatikleştiren, ticari olarak temin edilebilen bir robotik sıvı işleme sistemi sunulmaktadır.

ChIP-seq Denemeleri otomatikleştirme 10.000 HeLa Hücreleri üzerinde epigenetik Profilleri oluşturmak için

SPOT yöntemiyle sentezlenen peptit dizileri, Protein lizin metiltransferazların (PKMT'ler) substrat özgüllüğünü analiz etmek ve biyolojik rollerini anlamak için PKMT'lerin substrat spektrumunu tanımlamak için kullanılabilir. Bu protokol, peptit dizilerinin nasıl sentezleneceğini, PKMT'lerle nasıl metilleneceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

SPOT Peptit Diziler Protein Lizin Methyltransferases Özgünlüğü Analizi

Burada yazarlar, saflaştırılmış bir monoklonal antikor ve nokta-leke hibridizasyonulama yoluyla peptit taraması kullanarak doğrusal bir antijenik epitop tanımlamak için basit ve verimli bir protokol sunmaktadır. Tanımlanan epitop daha sonra terapötik ve tanısal uygulamalarda kullanılabilir.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

İnsan lökosit antijeni (HLA) serileri organ donörü ve alıcı çiftleri arasındaki uyuşmazlıklar antikor aracılıklı ret organ nakli yapılan en önemli nedeni vardır. Burada Anti-donör HLA alloantibodies organ alıcıları içinde soruşturma için bireysel bağış HLA dizileri üzerinde temel alan özel antijen diziler kullanımı mevcut.

Peptid diziler HLA Alloantibodies Organ nakli olarak algılanması için kişiselleştirilmiş

Bu protokol için bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanarak Zika virüs belirli tanılama peptidler keşfetmek için bir teknik açıklar. Bu iletişim kuralı readly ortaya çıkan diğer bulaşıcı hastalıklar için adapte edilebilir.

Zika virüs belirli tanılama Epitope bulma

Burada, MHC sınıf I ve sınıf II peptit komplekslerinin yüksek kaliteli immünopeptidomik veriler sağlayan fare ve insan hücre çizgilerinden arındırılması için bir protokol sunuyoruz. Protokol, piyasada bulunan antikorları kullanarak numune hazırlamaya odaklanır.

İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

İnsan Spindlin Aile Üyesi 4'te (SPIN4) genetik varyantlar, yeni bir gelişimsel bozukluk olan kemik aşırı büyümesi olan hastalarda yakın zamanda tespit edilmiştir. Nükleozomlar bağlamında modifiye histonların SPIN4 bağlanma substratları olarak biyokimyasal tanımlanmasını tanımlayan bir protokol ve yeni sonuçlar sunulmaktadır.

Değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4'ün (SPIN4) bağlanma substratları olarak tanımlanması

Keşfedin, histon antikor özgüllüğünü peptit mikroarraylerle analiz etme yöntemini. Kromatin biyokimyası ve epigenetik araştırmalarında antikor kalite kontrolü için bu entegre pipeline'ı öğrenin.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Daha fazla video keşfet