İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin iskelet kasından saf bir insan miyoblast popülasyonu elde etmektir. Bu hücreler, miyojenik farklılaşmanın değerlendirilmesi ve mağaza tarafından işletilen kalsiyum girişinin ölçülmesi gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılır. Bu tekniğin ana avantajı, insan primer miyoblastlarının hızlı, basit ve tekrarlanabilir bir izolasyonuna izin vermesidir.

Bu miyoblastlar, kas rejenerasyonu sırasında kalsiyum sinyalini incelemek için yeni ex-vivo'dur. Bu yöntem, kas farklılaşması sırasında yer alan iyonik kanalların ve transkripsiyon faktörlerinin tanımlanması gibi kas alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çünkü bu yöntem, insan miyojenik farklılaşması sırasında gen fonksiyonları hakkında bilgi sağlayabilir.

Kas distrofilerini tedavi etmek için miyojenik kök hücreleri kullanma potansiyeli gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Kas örneğini altı santimetrelik steril bir plakaya aktarın, örneği PBS ile iki kez yıkayın. Kalan yağ dokusunu çıkarın ve numuneyi tartın.

Daha sonra, tripsin ekleyin ve kasları iki milimetreden daha küçük parçalar halinde kıyın. Kıyılmış bir kez, dokuyu bir karıştırma çubuğu içeren 200 mililitrelik bir ayrışma şişesine aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın, ardından ayrışma şişesi 90 mililitreye kadar dolana kadar kıyılmış dokuyu tripsin çözeltisinde toplamaya devam edin. Şimdi, dokuyu 37 santigrat derecede bir su banyosunda 60 dakika boyunca hafifçe karıştırarak inkübe edin.

Bir saat sonra, reaksiyonu durdurmak için 10 mililitre FCS ekleyin ve karışımı öğütme kullanarak homojenize edin. Şimdi, 70 mikronluk süzgeçleri iki adet 50 mililitrelik tüpe yükleyin ve süspansiyonu filtrelere pipetleyerek hücre süspansiyonunun yarısını her süzgeçten geçirin. Daha sonra, büyüme ortamındaki hücrelerin bir süspansiyonunu yapın ve 200.000 hücreyi dört mililitre ortam ile altı santimetrelik plakalara yerleştirin.

Plakaları inkübe edin, ortamı her üç günde bir değiştirin. Beş ila yedi gün sonra, hücreler %70 ila %80 oranında birleşmiş olmalı, ardından onları lekelemelidir. Başlamak için, birleşen hücrelerin plakasını PBS ile durulayın.

Ardından, bir mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve enzimin üç dakika çalışmasına izin verin. İki mililitre ortam ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Ardından, hücreleri döndürün ve bir mililitre ortamda yeniden askıya alın.

Ardından, hücreleri buz üzerinde saklarken bir hücre sayımı yapın. Gerçeklerin analizi için, her biri 100.000 hücreli yedi tüp yükleyin. Kalan hücreleri sıralamak için sekizinci bir tüpe yükleyin.

Hücreleri bir mililitre soğuk faks tamponu ile yıkayın, ardından tüpleri santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin ve atın. Uygun antikorlarla 200 mikrolitre faks tamponu ekleyin ve hücrelerin 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatmasına izin verin. 30 dakika sonra, hücreleri tekrar yıkayın ve 500 mikrolitre faks tamponunda yeniden süspanse edin, ardından hücreleri bir akış sitometresi kullanarak sıralayın.

CD45 pozitif hematopoietik hücreleri dışladıktan sonra, CD45 negatif hücreleri CD56 ekspresyonuna göre ayırın. Ardından, CD34, CD144 ve CD146 için CD56 pozitif popülasyonu kapılayın. Saflığı kontrol etmek için sıralanan popülasyonun bir kısmını yeniden analiz edin.

Şimdi, insan miyoblastlarını çekin ve beş mililitre besiyeri ile yıkayın. Ardından bunları bir mililitre ortamda yeniden askıya alın. Süspansiyonu dört mililitre orta içeren altı santimetrelik bir plakaya aktarın ve plakayı% 7 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bu prosedür için, kültürlenmiş miyoblastlara sahip olun ve taze transveksiyon ortamı yapın. Ortamı oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika inkübe edin. Orta inkübasyon sırasında miyoblastları hazırlayın.

İlk olarak, PBS ile bir kez durulayın. Ardından, yapışan hücreleri tripsinize edin. İki mililitre ortam ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Ardından, hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe toplayın. Onları döndürün ve bir mililitre ortamda yeniden askıya alın. Her transveksiyon için 200 mikrolitre ortamda 500.000 hücre hazırlayın.

Her 500 mikrolitre transveksiyon ortamına, 200 mikrolitrelik bir hücre alikotu ekleyin ve ardından pipet tabancasının sadece iki vuruşunu kullanarak karıştırın. Ardından, reaksiyonların oda sıcaklığında beş dakika devam etmesine izin verin. Beş dakika sonra, reaksiyonları her biri bir cam kapak kaymalı içeren 3,5 santimetrelik kültür kaplarına aktarın.

Daha sonra, iki mililitrelik son hacim için 1,3 mililitre orta ekleyin ve bulaşıkları inkübe edin. 48 saatlik farklılaşmadan sonra, hücreler immün olarak boyanabilir veya kalsiyum görüntüleme kullanılarak analiz edilebilir. Her iki seçenek için de, önce yıkamak için bir mililitre oda sıcaklığında PBS kullanarak hücreleri iki kez dikkatlice yıkayın.

Miyotüpleri çıkarmaktan kaçının. Kalsiyum görüntüleme için, yıkanmış hücreleri kalsiyum içeren ortamda iki mikromolar fura-2 artı bir mikromolar treonik asit ile kaplayın. Ardından, karıştırmadan önce yaklaşık 30 dakika kuluçkaya yatmalarına izin verin.

Daha sonra, hücreleri modifiye edilmemiş kalsiyum içeren ortamla iki kez yıkayın ve ardından esterleşme için 10 ila 15 dakika inkübe edin. Şimdi, kapak fişini bir kültür plakasından çıkarın ve deney odasına yerleştirin. Hazneyi kalsiyum içeren ortamla doldurun, mikroskop altına yerleştirin ve ardından veri kaydını başlatın.

Fura-2, 340 ve 380 nanometrelerde dönüşümlü olarak uyarılır. Emisyon ışığı 510 nanometrede toplanır. 340 nanometre nanometre görüntülerini 380 görüntüye dalmak, dalgalanmalar ve kalsiyum konsantrasyonu nispeten düşük olduğu için görüntü oranlarını sağlar, her iki saniyede bir görüntü oranı elde eder.

İki veya üç dakika sonra, ortamı kalsiyum içermeyen ortamla değiştirin. Daha sonra, bir veya iki dakika boyunca, hücrelerde mağaza tarafından çalıştırılan kalsiyumun aktivitesini izleyin. Daha sonra, iç kalsiyum depolarını tüketmek için hücrelere bir mikromolar tapsigargin ekleyin.

Sekiz ila 10 dakika bekleyin, ardından ortamı hızlı bir şekilde kalsiyum içeren ortamla değiştirin ve kalsiyum hücrelere başarılı kanallardan girerken beş dakika boyunca kaydedin. Deneyi sonlandırdıktan sonra görüntüleri analiz edin. Arka planı tanımlayan birinci bölge için hücre olmayan bir alan seçin, ardından ikinci bölge için sitoplazmada bir alan seçin.

İki bölge, serideki görüntülerden herhangi birinde çizilebilir. Ardından, denemeleri çalıştır sekmesine gidin ve 340 ve 380 kanalları için referans görüntüleri seçin, birinci bölgeyi seçin ve ardından arka planı çıkar'a tıklayın. Şimdi, tüm görüntülerden arka planı kaldırmak için tüm denemeyi çalıştırın.

Tamamlandığında, zaman ve oran verilerinin günlüğe kaydedildiği bir elektronik tabloyu açmak için veri günlüğü seçeneğini tıklayın. Kas hücreleri büyütüldü, genişletildi ve faks kullanılarak sıralandı. Miyoblastlar, analiz edilen popülasyonun% 60'ından fazlasını temsil ediyordu.

Birincil insan miyoblastları daha sonra farklılaşma ortamında kültürlendi ve MEF2 ve miyozin ağır zincir proteinlerinin transkripsiyon faktörü için immün boyandı. Hücrelerin çoğunluğu miyozin ağır zincirini eksprese etti ve füzyon indeksi değerleri yaklaşık %60 olan miyotüpler oluşturdu, hücrelerin diğer %40'ı ise rezerv hücreler olarak da bilinen farklılaşmamış tek çekirdekli hücreler olarak kaldı. Tarif edilen depo ile çalıştırılan kalsiyum giriş deneyi, farklılaşmış hücreler üzerinde başarıyla gerçekleştirildi.

Aynı deneyin, TRPC ailesinin kalsiyum geçirgen kanallarına yönelik küçük enterferans yapan RNA ile transveksiyonlu hücreler üzerinde yapılması, yıkımın mağaza tarafından işletilen kalsiyum girişi üzerinde ölçülebilir bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, insan miyoblastlarını yetişkin iskelet kasından nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu hücreleri, kas farklılaşmasının ardışık adımlarını ve özellikle transkripsiyon faktörlerinin ve kalsiyum kanallarının deaktivasyonunu incelemek için kullanıyoruz.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saatten daha kısa sürede yapılabilir. İnsan miyoblastlarının verimini elde eden hızlı, basit, tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu işlem denenirken istenmeyen spontan farklılaşmalar olacağından miyoblast kültürlerinin tam güvene ulaşmasını önlemek önemlidir.