Name: İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Keşfedin yetişkin iskelet kasından insan miyoblastlarının hızlı ve tekrarlanabilir izolasyon yöntemini. Miyojenik farklılaşma ve kalsiyum sinyalleşmesi üzerine fonksiyonel çalışmalar için bu teknik kas rejenerasyonu araştırmalarına değerli katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (hibe numarası 310030-166313), &quot;Vakıf Marcel Levaillant&quot; ve &quot;Fondation pour la recherche osteo-articulaire&quot; başlıklı &quot;Fondation Suisse reourcheurs sur les maladies musculaires&quot; tarafından desteklendi.

Ortopedik cerrahi sırasında sağlıklı hastalarda cerrahi atık olarak insan kas örnekleri (semitendinöz kaslardan alınan dokular) toplandı. İnsan çalışmasıyla ilgili tüm yöntemler, İsviçre Düzenleyici Sağlık Otoriteleri&#39;nin yönergelerine ve düzenlemelerine uygun olarak ve İsviçre&#39;deki Cenevre Kanton Yetkilileri&#39;nden (Protokol CER n ° 12-259) Komisyon Yasası tarafından onaylanmıştır. . Bilgilendirilmiş ve yazılı onaylar, çalışmaya katılan tüm yetişkinlerden elde edildi. 1. İnsan iskelet kasında miyoblastların izolasyonu <ol><li> Tüm işlemler sırasında, seviye II doku kültürü başlığı altında çalışarak steril ortam ve steril tamponlar kullanarak steril koşulları muhafaza edin. Not: Bu prosedür pek çok insan iskelet kası üzerine uygulanabilir. </li></ol> 2. Ayrışma Protokolü <ol><li> Kas örneklerini (2 - 3 g) steril bir 6 cmplaka. </li><li> Kas numunelerini 5 - 10 mL fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın. Yıkamayı tekrar et. </li><li> Kıvrımlı makas ve kelepçe kullanarak bağ ve yağ dokularını çıkarın. </li><li> Kas örneğini tartın (bkz. Adım 2.13) ve yeni bir steril 6 cm plakaya aktarın. </li><li> 5 mL% 0.05&#39;lik Tripsin-EDTA ilave edin. </li><li> Makas kullanarak, kas dokusunu küçük parçalara (2 mm&#39;den daha az) kesin ve kıyplayın. </li><li> 10 mL serolojik bir pipet kullanarak, kıyılmış kas manyetik bir çubuk içeren 200 mL çözülme şişesine aktarın. 90 mL% 0.05&#39;lik Tripsin-EDTA çözeltisi ayrıştırılmış kasa ile ayrışma kutusuna aktarılana kadar bu adımı tekrarlayın. Ayrıştırma şişesini kapatın ve hafif çalkalamayla 60 ° C&#39;de 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ayrışma şişesini ısıtma banyosundan çıkarın ve ayrışma şişesine 10 mL fetal buzağı serumu (FCS;% 10 nihai hacim) ilave ederek enzimatik reaksiyonu durdurun. Karışımı bir pipetle homojenize edin. </li><li> HazırlıkHerbirinde 70 μm hücre süzgeçli iki 50 mL tüptür. Süspansiyon geçene kadar filtreye aşağı ve yukarı pipetle atarak hücre süretöründen hücre süspansiyonuna hücre süspansiyonunun yarısını geçirin. </li><li> Tüpleri 200 xg ve 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın. </li><li> 10 ml büyüme ortamı (GM, Tablo 1 ) ile hücreleri tekrar süspansiyon ve bir 50 ml tüp yerleştirilen bir 40 mikron hücre süzgeç hücreleri geçmek. Boruyu 200 xg ve 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın. </li><li> 10 ml&#39;lik GM ile hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 200 xg ve 20 ° C&#39;de tüpü 5 dakika boyunca santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın. </li><li> 1 mL GM ile hücreleri tekrar süspanse edin ve bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın. Not: Genellikle kas kütlesi başına 3 x 10 5 hücre verimi hasat edilmelidir. Verim, hücrelerin sayısının kas biyopsi ağırlığına bölünmesiyle hesaplanır(Adım 2.4). </li><li> 4 mL GM içeren steril bir 6 cm&#39;lik plakaya 2 x 10 5 hücre koyun ve 37 ° C&#39;de ve% 7 CO 2&#39;de inkübe edin. Gerektiği kadar çok tabak hazırlayın. </li><li> GM&#39;yi 3 gün sonra değiştir. Not: Derhal ayrışmış hücrelerin kültür plakasına yapışması için zaman gerekir. Dahası, ilk miyojenik hücre çoğaltma süresi yaklaşık 50-60 saattir. İlk bölünmeden sonra katlama süresi yaklaşık 20 saat. </li><li> Hücreler 70 ulaştıklarında, 7 gün, - - 5 sonra (10 x 1,5 yaklaşık 6 hücre / 6 cm plaka başına)% 80 kaynaşmaya, antikoru boyamasını ve hücre sıralama (aşama 3) başlar. </li></ol> 3. Antikor Boyama ve Hücre Ayırma <ol><li> PBS ile bir kez durulandıktan sonra yapışan hücreleri (6 cm&#39;lik plakada) 37 ° C&#39;de% 0.05&#39;lik Tripsin-EDTA&#39;nın 1 mL&#39;si ile inkübe edin ve 3 dakika boyunca% 7 CO 2 (veya% 5 CO 2&#39;de inkübe edin). GM&#39;yi 2 mL ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücreleri 15 mL tüp içine alın. Santrifüjden sonra (5 dakika boyunca 200 xg), resGM&#39;lerin 1 mL&#39;sindeki hücreleri geçiştir. </li><li> Bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın. </li><li> Buz üzerinde aşağıdaki prosedürleri uygulayın. Not: Sitometrede doğru flüoresans kompanzasyonu ayarlama prosedürü esastır ve herhangi bir sitometrede benzer olmalıdır. Negatif kontrol olarak borular 1 ve 2 kullanılır. Tüpler 3 - 7 ilk deney sırasında sitometredeki kompanzasyonu ayarlamak için kullanılır ( Tablo 2 ). Nihai konsantrasyonu, her bir antikor için kullanılabilir ve karşılık gelen izotip (1 ug / etrafında 10 6 hücre) aynı olması gerekir. </li><li> Tüpler 1 - 7 için tüp başına (5 mL tüp) 1 x 10 5 hücre gönderiniz ( Tablo 2 ). Kalan hücre süspansiyonunu, hücre ayırması için tüp 8&#39;e yerleştirin. </li><li> Hücreleri 1 mL soğuk FACS tamponu (PBS-% 5 FCS) ile yıkayın. Tüpleri 200 xg ve 4 ° C&#39;de 5 dakika kapatın ve santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın. </li><li> Tüp başına 200 μL FACS tampon ekleyin. Antikorları ekleyinE tüpü Tablo 2&#39;ye göre. 30 dakika boyunca buzda inkübe edin. </li><li> Hücreleri yıkayın: her tüp için 1 mL FACS tampon ekleyin. Tüpleri 200 xg ve 4 ° C&#39;de 5 dakika kapatın ve santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve atın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Hücreleri 500 μL FACS tamponuna tekrar süspanse edin. Tüpleri kapatın ve hücre ayırma işlemine kadar buz üzerinde tutun. Herbiri hücre ayırma işlemi sırasında hücreleri toplamak için gerekli 500 mcL GM ihtiva eden 1.5 mL&#39;lik 4 tüp hazırlayın. Onları buzda tutun. </li><li> İnsan miyoblastlarını akış sitometrisi ile sıralayın ( Şekil 1 ). CD45-pozitif hematopoietik hücreleri dışladıktan sonra, CD56 ekspresyonuna dayalı ayrı CD45 negatif hücreler. Ardından CD34, CD144 ve CD146 (insan miyoblastları CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- hücreleri olarak tanımlanır) için CD56 pozitif popülasyonunu kaplayın. Saflığı kontrol etmek için sıralanmış hücre popülasyonunun küçük bir bölümünü yeniden analiz edin. </li><li> İnsan miyoblini içeren tüpleri boşaltın15 mL&#39;lik bir tüpe ilave edin ve 5 mL&#39;lik GM ekleyerek bir kez yıkayın. Boruyu 200 xg ve 20 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin; Havayı aspire edin ve atın. </li><li> 1 mL GM&#39;de hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve 4 mL GM içeren kaplanmamış 6 cm&#39;lik bir plakada hücreleri plakaya yerleştirin (plaka başına 2 x 10 5 hücre). 37 ° C&#39;de ve% 7 CO 2&#39;de inkübe edin. </li></ol> 4. Hücre Bakımı <ol><li> Kültür ortamının yarısını her 2 günde değiştirin. Kültür çanak eski GM 2 mL çıkarın ve GM 2 mL ekleyin. Not: Myoblastlar, kültür koşulları için yararlı büyüme faktörleri üretirler. </li><li> Önceden farklılaşmayı önlemek için hücreler% 70-80&#39;e ulaştığında hücreleri deneyin. PBS ile bir kez durulandıktan sonra yapışmış hücreleri (6 cm&#39;lik plakada) 37 ° C&#39;de% 0.05 0.05 tripsin-EDTA ve 3 dakika% 7 CO 2 ile inkübe edin. GM&#39;yi 2 mL ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücreleri 15 mL&#39;lik bir tüp içerisinde toplayın. Santrifüjden sonra (5 dakika boyunca 200 xg), resüs1 mL GM&#39;de hücreleri bekletin. </li><li> Hücreleri sayın ve 4 mL GM plaka başına 2 x 10 5 hücre ile 6 cm levha hazırlamak. </li><li> İnsan miyoblastlarını 6 pasajda tutun veya mL başına% 1 DMSO, 1 x 10 6 hücre içeren GM içerisinde dondurun. Hücreleri aşamalı bir dondurucu kutuda dondurun (1 ° C / dakika); Uzun süreli depolamada, hücreleri sıvı nitrojene yerleştirin. </li></ol> 5. İnsan miyoblastlarının siRNA ile transfeksiyonu Not: Myoblastlar, ticari transfeksiyon reaktifi kullanılarak farklılaşmanın başlatılmasından iki gün önce transfekte edilir. Spesifik siRNA&#39;nın bir gene karşı etkisi her zaman bir kontrol siRNA&#39;nın etkisi ile karşılaştırılır. SiRNA&#39;lar, buz üzerinde tutulması ve eldivenlerle manipüle edilmesi gereken çift telli RNA&#39;lardır. <ol><li> 6 cm&#39;lik bir plakada (yaklaşık 1.5 x 10 6 hücre) insan miyoblastlarının% 70-80&#39;lik konfluent monolayerini elde edin. Not: transfeksiyon başına 5 x 10 5 hücre bir aleyhte elde edilmesi için gerekli olanGM&#39;de 2 gün sonra transfekte myoblastların akıcı tek tabaka. </li><li> Cam lamelleri hazırlayın (7. adımda kalsiyum görüntüleme için açıklanmıştır). </li><li> Sıcak GM,% 0.05&#39;lik Tripsin-EDTA ve PBS&#39;den 37 ° C&#39;ye. </li><li> Sterilizasyonu korumak için aşağıdaki basamakları basamak II doku kültürü kaputunda gerçekleştirin. </li><li> 1.5 mL&#39;lik bir tüpte, azaltılmış serum ortamı 500 mcL, 3 μL transfeksiyon reaktifi ve 1 uL siRNA 20 uM&#39;de gönderilir. Hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 15-20 dakika tutun. </li><li> Bu kuluçka süresi boyunca, miyoblastları transfeksiyon için hazırlayın. PBS ile bir kez durulandıktan sonra yapışmış hücreleri (6 cm&#39;lik plakada) 37 ° C&#39;de% 0.05 0.05 tripsin-EDTA ve 3 dakika% 7 CO 2 ile inkübe edin. GM&#39;yi 2 mL ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücreleri 15 mL&#39;lik bir tüp içerisinde toplayın. Santrifüjden sonra (5 dakika boyunca 200 xg), hücreleri 1 mL GM&#39;ye tekrar süspanse edin. </li><li> Bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın. </li><li> 5 x 10 5 hücreyi tekrar süspanse edinHer bir transfeksiyon için 200 uL GM&#39;de ( yani, 2 transfeksiyon için, 400 uL&#39;de tekrar süspansiyon haline getirin). </li><li> SiRNA-transfektan karışımının her 500 mcL&#39;ye hücre süspansiyonundan 200 uL ekleyin. İki kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Bir cam lamel içeren 3.5 cm&#39;lik bir kültür kabına 700 μL (hücreler + siRNA-transfectant) ekleyin. 2 mL&#39;lik nihai bir hacim elde etmek için GM ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 24 saat ve% 7 CO2 sonra tamamen taze GM 2 mL orta yerine. 24 saat sonra transfekte hücrelerin konfluent mono tabakası genellikle bulunur; Eğer öyleyse, GM&#39;yi 2 mL farklılaşma ortamı (DM, Tablo 1 ) ile değiştirerek miyoblast farklılaşmasına neden olun. </li><li> Farklılaşmanın başlatılmasından 24-48 saat sonra veya çoğalan miyoblastlarda kalsiyum görüntüleme deneyleri uygulayın. Not: İmmünofloresans, genellikle farklılaşmanın başlatılmasından 48 saat sonra yapılır. </li></ol> 6. ImmFarklılaştırma İşaretleyicileri İçin Unofluoresans Boyama Not: İmmünofloresan boyama DM&#39;de 48 saat sonra yapılır, ancak diğer farklılaşma zamanlarında da yapılabilir. Myogenin ve MEF2, sadece farklılaşmış hücrelerde (miyotüplere kaynaştırılmadan önce) eksprese edilen nükleer proteinlerdir ve boyama, farklılaşma sürecinin değerlendirilmesine izin verir. Myosin ağır zinciri (MyHC) sadece miyotüplerde ifade edilir ve miyotüp boyutu ve füzyon endeksini (miyotüplerdeki çekirdek sayısı / toplam çekirdek sayısı) tahmin etmek için kullanılır. <ol><li> DM&#39;de 48 saat sonra, bölünmüş hücrelerin konfluent monolayer&#39;ini oda sıcaklığında iki kez 1 mL PBS ile yıkayın. Miyotüplerin ayrılmasını önlemek için bunu dikkatle yapın. </li><li> RT&#39;de 15 dakika boyunca hücreleri 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile fikse edin. Her biri 5 dakika süreyle hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Hücreleri,% 0.25 Triton X-100 içeren 1 mL PBS ile 45 dakika boyunca geçirin ve 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Engelle% 0.2 Tween-10 ve% 2 keçi serumu (blok çözeltisi) ile takviye edilmiş PBS&#39;de hücreleri inkübe ederek 30 dakika süreyle RT&#39;de bağışıklık kazandırır. </li><li> Blok solüsyonda seyreltilmiş birincil antikorları (3.5 cm&#39;lik plaka başına 600 μL) hazırlayın. Not: Aşağıdaki primer antikorlar kullanılır: fare anti-miyojenin (1: 600), tavşan anti-MEF2 (1: 300) ve fare anti-MyHC antikoru (MF20, 1: 1,000). Tavşan anti-MEF2 ile aynı engelleme çözeltisi, fare anti-miyozin ağır zinciri veya fare anti-miyojenin karıştırmak mümkündür. </li><li> Blok çözeltisini çıkarın ve 3.5 cm&#39;lik plaka başına birincil antikor çözeltileri 600 μL ekleyin ve gece boyunca 4 ° C&#39;de nemli bir odada inkübe edin. </li><li> Hücreleri 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın. Keçi anti-fare Alexa 488 (1: 1000), keçi anti-tavşan Alexa 546 (1: 1000), blok çözelti içinde hazırlanan sekonder antikorlar 600 mcL ile karanlık bir odada oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin: Ve DAPI (1:50, stok solüsyonu 15uM&#39;de). CAUTION: DAPI, eldivenlerle işlenmesi gereken toksik bir bileşiktir. </li><li> Aspire edin ve hücreleri 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Cam kaplamaları, antifadif çözeltili polivinil alkol montaj malzemesi kullanarak yerleştirin. Onları 4 ° C&#39;de tutun ve hücreleri görüntüleyene kadar ışığa karşı koruyun. </li></ol> 7. Kalsiyum Görüntüleme <ol><li> Önceki kültür, 25 mm çapında cam lamelleri hazırlayın. Yüzeydeki herhangi bir gres ve kiri temizlemek için 48 saat boyunca% 70 etanol içinde lamel koyun, lamel hücre adheransını azaltır. </li><li> Lamelleri birkaç kez suyla duruladıktan sonra, tekrar suya koyun ve sterilize edin (otoklavlanır). </li><li> 3,5 cm&#39;lik kültür plakasına bir lamel koyun ve kurumalarını bekleyin. Daha ileri deneyler için Petri yemeklerini saklayın veya hemen kullanın. </li><li> Transfere mikoblastlar (5 - 6 x 10 5 hücre) cam lamel ekleyin. Not: Deneyler, diferansiyasyonun indüksiyonundan 24-48 saat sonra yapılırÜzerinde veya çoğalmakta olan miyoblastlarda. </li><li> Ca 2+ görüntüleme yapmak için, hücreleri PBS ile 2 kez veya doğrudan deneyler için kullanılan ortamla yıkayın (kalsiyum içeren ortam, Tablo 3 ). Karanlıkta RT&#39;de yaklaşık 30 dakika boyunca hücrelere 2 uM Fura-2 / AM artı 1 uM pluronik asit yükleyin. Not: Pluronic acid, Fura-2&#39;yi çözündürmeye yardımcı olur. Fura-2 / AM ve pluronik asit kalsiyum içeren ortamda çözülür. </li><li> Hücreleri Fura-2 / AM ve pluronic asit olmaksızın aynı ortamda iki kez yıkayın ve Fura-2 / AM&#39;nin esterlenmesini sağlamak için karanlıkta ilave bir 10-15 dakika bekletin. </li><li> Fura-2 yükleme etkinliği çok düşükse, daha fazla Fura-2 ekleyin ( örn., 4 uM) ve / veya hücreleri daha uzun süre ( örn., 40 dakika) inkübe edin. </li><li> Kültür plakasındaki lamelleri çıkarın ve deney odasına yerleştirin. ~ 1 mL kalsiyum içeren ortam (deney hacmine bağlı olarak) ilave edinZihinsel oda). Mikroskop sahnesine yerleştirin ve kaydı başlatın. Not: Floresan Ca 2+&#39; ya duyarlı prob Fura-2, 340 nm ve 380 nm&#39;de dönüşümlü olarak uyarılır ve emisyon ışığı 510 nm&#39;de toplanır. Ca 2+ konsantrasyonundaki dalgalanmalar nispeten yavaş olduğu için, her 2 saniyede bir 1 oran alın. </li><li> SOCE&#39;yi etkinleştirmek için aşağıdaki klasik thapsigargin / Ca 2+ yeniden ilavesi protokolü kullanılır: hücreleri 2-3 dakika boyunca kalsiyum içeren ortamda bırakın. Ortamı, 1-2 dakika boyunca kalsiyumlu ortamla değiştirin. <ol><li> Dahili kalsiyum depolarını boşaltmak için 1 uM thapsigargin ekleyin. Not: Thapsigargin sarkoidozlu endoplazmik retikulum Ca 2+ ATPaz (SERCA) pompa aktivitesinin geri döndürülemez bir bloke edicisidir. 8-10 dakika sonra, ortamı hızla kalsiyum içeren besiyeri ile değiştirin. Ca 2+ , SOCE kanalları vasıtasıyla hücrelere girecektir. Deneyleri sona erdirmeden önce yaklaşık 5 dakika bekleyin. DİKKAT: Thapsigargin, eldiven ile işlenmesi gereken zehirli bir bileşiktir. </li></ol></li></ol> 8. Ca 2+ Ölçüm Analizi Not: Analiz edinme yazılımı ile gerçekleştirilir. <ol><li> Deneyi aç. Bölge 1&#39;i, hücrelerin olmadığı bir bölgede (arka plan bölgesi) çizin ve diğer bölgeleri analiz edilecek hücrelerin sitoplazmalarında çizin (bölgeler, herhangi bir görüntü üzerinde çizilebilir: 340 nm, 380 nm, Veya oran görüntüsü). &quot;Denemeleri çalıştır&quot;&gt; &quot;referans resimler&quot; e gidin. 340 ve 380 kanalların altında, &quot;bölge 1&quot; i seçip &quot;Arka plan çıkar&quot; ı tıklayın. </li><li> Arka plan bölgesi boyunca dolaşan floresan toz spotu gibi arka plan bölgesi ile hiçbir şeyin etkilenmemesini ve hücrelerin deneyler sırasında hareket etmemesini sağlamak için tüm denemeyi (F4: ileri) çalıştırın. Not: Seçilen ilgi bölgeleriKaranlık alanlar içermemelidir; Aksi takdirde, oran değerinde gürültülü görünecektir, zira arka planın bir kısmı ölçümde yer alacaktır. </li><li> &quot;Verileri kaydet&quot; i tıklayın ve tüm denemeyi tekrar oynayın. Not: Bu, zamanın ve oranın kaydedildiği bir e-tablo açar. Bireysel 340 nm ve 380 nm dalga boylarını kurtarmak da mümkündür. </li><li> SOCE hakkında bilgi almak için deneydeki iki önemli parametreyi çıkartın: Ca 2 + yeniden ilavenin genliği ve Ca 2+ giriş fazının eğimi ( Şekil 3 ). </li><li> Ca 2 + yükselmesinin maksimal amplitüdünden Ca 2+ yeniden ilavesinden hemen önce oran değerini çıkararak genliği elde edin. Ca 2+ yeniden eklemeden sonraki ilk saniyelerin doğrusal gerilemesi uyarak maksimal eğimi elde edin. Not: Thapsigargin tepkisinin eğrisi altındaki alan ayrıca extrac için bilgilendirici bir parametredirT, SR&#39;de depolanan serbest kalsiyum miktarını yansıtıyor. </li></ol>

<ol><li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration.</a> Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li>
<li>Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Adult skeletal muscle stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).</li>
<li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood-vessel-derived+multipotent+precursors+from+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (90), e51195(2014).</li>
<li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+stem+cells+from+cultures+of+cryopreserved+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle.</a> Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).</li>
<li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+Vivo+Expansion+and+In+Vivo+Self-Renewal+of+Human+Muscle+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li>
<li>Stiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+signalling+controls+store-operated+calcium+entry+required+for+development+and+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle.</a> Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-Operated+Calcium+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-Operated Calcium Channels.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).</li>
<li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-+and+Orai1-dependent+store-operated+calcium+entry+regulates+human+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).</li>
<li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+muscle+economy+myoblast+differentiation+and+excitation-contraction+coupling+use+the+same+molecular+partners%2C+STIM1+and+STIM2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2.</a> J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).</li>
<li>Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+cation+channels+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential cation channels in disease.</a> Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).</li>
<li>Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+TRPC+in+the+abnormal+calcium+influx+observed+in+dystrophic+%28mdx%29+mouse+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers.</a> J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).</li>
<li>Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+post-natal+human+myogenesis%2C+normal+myotube+size+requires+TRPC1-+and+TRPC4-mediated+Ca%282%29%28%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry.</a> J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).</li>
<li>Brinkmeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+in+skeletal+muscle%3A+gene+expression%2C+function+and+implications+for+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease.</a> Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).</li>
<li>Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+Ca2%2B+entry+in+muscle+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases.</a> BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).</li>
<li>Lacruz, R. S., Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases+caused+by+mutations+in+ORAI1+and+STIM1%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1.</a> Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-Ca%282%2B%29+signaling+is+required+for+the+hypertrophic+growth+of+skeletal+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice.</a> Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).</li>
<li>Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orai1-dependent+calcium+entry+promotes+skeletal+muscle+growth+and+limits+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue.</a> Nat Commun. 4, 2805(2013).</li>
<li>Konig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+hyperpolarization+triggers+myogenin+and+myocyte+enhancer+factor-2+expression+during+human+myoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Associated+Methylation+Suppresses+SPRY1%2C+Leading+to+a+Failure+of+Re-quiescence+and+Loss+of+the+Reserve+Stem+Cell+Pool+in+Elderly+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle.</a> Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).</li>
<li>Bettadapur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Culture+of+Aligned+Skeletal+Myotubes+on+Micromolded+Gelatin+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels.</a> Sci Rep. 6, 28855(2016).</li>
<li>Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li>
<li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li>
<li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2%2B-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li>
</ol>

Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur.

Yetişkin iskelet kasından insan miyoblastlarının izolasyonu ve kültürü, kas farklılaşması ve kas yenilenmesini incelemek için in vitro bir model sunar. Bu yazıda, insan miyoblastlarının yüksek verimliliğini basit ve maliyet-sınırlı şekilde arındırmaya olanak tanıyan bir protokol sunuyoruz. Buna ek olarak, bu teknik, izole edilen miyoblastların yüzdesi ve miyojenik farklılaşma verimi açısından güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Nitekim hücre sıralama sonrasında insan m...

İnsan iskelet kasları, miyojenik öncü hücrelerin kaynaşmasından kaynaklanan kontraktil, çok çekirdekli kas liflerinden oluşan gruplardan oluşur. İskelet kası, miyofibarların plazma membranı (sarcolemma) ile bazal lamina arasında bulunan iskelet kası kök hücreleri olan SC&#39;lerin varlığı nedeniyle hasardan sonra yeniden oluşma kapasitesine sahiptir. Yaralanmamış kasında, SC&#39;ler çoğunlukla sessiz bir durumda bulunur. Mekanik stres veya yaralanmaya tepki olarak, SC&#39;ler aktifleştirilir (miyoblastlar), çoğalır ve yeni miyofiberleri oluşturmak için ya da SC havuzu 1 , 2&#39;yi doldurmak için kendi kendini yenilemek üzere farklılaşır. Yıllar geçtikçe, SC&#39;leri ve yavrularını (miyoblastları) iskelet kası biyopsilerinden izole etmek için çeşitli teknikler geliştirildi. Bu hücreler üzerinde ifade edilen hücre yüzey markörlerinin daha iyi anlaşılması ve floresans ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması (FACS) metodolojisine 3 ile, 4 , 5 , şimdi insan kasları saf kas popülasyonlarını kas örneklerinden izole etmek mümkündür. Kalsiyum sinyali iskelet kası gelişimini, homeostazı ve yenilenmeyi düzenler. Özellikle, SOCE adlandırılan hücre-içi stokunun tükenmesi sonra aktive edilir Ca2 + girişi, bu işlemler için büyük önem 6 taşımaktadır. Hücre uyarımı üzerine, endo / sarkoplazmik retikulumdaki Ca 2+ seviyesi (ER / SR) azalır ve bu da, Ca 2+ girişinin ER / SR 7&#39;yi tekrar doldurmasına izin veren plazma membranı Ca 2+ kanallarını harekete geçirir. SOCE&#39;ye katılan iki ana protein, ER / SR Ca 2+ -gören stromal etkileşim molekülü 1 (STIM1) proteini ve plazma membranı Ca2 + kanalı Orai1&#39;dir. İskelet kası bu iki proteini ve aynı ailelerin diğer proteinlerini bol miktarda ifade eder (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 ve birkaç Ca 2+ geçirgen olmayan geçici alıcı potansiyel kanonik (TRPC) ailesi kanalları 10 , 11 , 12 , 13 . SOCE yolu boyunca Ca 2+ girişi, kas oluşumu / rejenerasyonu için çok önemlidir 14 . STIM1 veya Orai1 proteinlerinin mutasyonları kas hipotoni 15 esas açan kas fonksiyonu üzerinde zararlı etkileri vardır. SOCE bozukluğu olan hayvan modelleri, azaltılmış kas kütlesini ve kuvvetini, aynı zamanda artmış yorgunluk 6 , 16 , 17 ile birlikte gösterir . Belirtildiği gibi, diğer STIM ve Orai proteinleri ve birçok TRPC kanalı iskelet kasında eksprese edilir ve şimdiye kadar ilgili rolleri belirlenememiştir. D&#39;yi çalarakKendi ifade seviyelerine sahip oldukları için, SOCE&#39;deki etkilerini ve insan iskelet kası farklılaşması sırasındaki rollerini araştırmak mümkündür. SOCE ölçümü iki farklı yaklaşımla yapılabilir: elektrofizyolojik güncel kayıtlar ve Ca 2+ ölçümleri. Elektrofizyoloji, ilgi akımını ve buna bağlı elektrofizyolojik imzayı ölçtüğünden kesinlikle daha doğrudan bir yöntemdir. Bununla birlikte, bu tekniğin kas hücrelerine uygulanması çok zordur çünkü esas olarak kas hücrelerinin büyüklüğü ve endojen SOCE akımının küçük boyutu. Sitosolik Ca 2+ görüntüleme teknik açıdan çok erişilebilir, ancak sitosolde ölçülen Ca 2+ seviyesi hem Ca 2+ girişini hem de hücrenin yeniden dışarı pompalamasını ya da iç depolarda yansıtıldığından önlem daha dolaylı. Mikoblastların küçük insan iskeletinden izole edilmesini içeren bir metodolojiEnzimatik sindirim, amplifikasyon ve FACS sonrası etal kasa bu makalede açıklanmıştır. Zamanla farklılaşan belirteçlerin ekspresyonunu izleyen kas farklılaşması ve immünofloresan protokolü işlemi 18&#39;de tanımlanmıştır. Son olarak, SOCE&#39;nin ölçümü ve Ca 2+ sinyal verme ve iskelet kasının diferansiyasyonunda farklı iyon kanallarının rolü açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Jambon' s F10</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31550-023</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>Lot 41G5532K</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>O5482</td><td></td></tr><tr><td>fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Corning</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Deksametatanson</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Kreatin</td><td>Sigma</td><td>27900</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>Üridin</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA %0.05</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 & m hücreli süzgeç</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m hücreli süzgeç</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; mL tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15&nbsp; mL tüp</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5&nbsp; mL tüp (FACS)</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Kültür ortamı: OPTI-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Transfectant reagnt: RNAiMax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1756064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Fluka</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-MyHC *</td><td>DSHB</td><td>MF20 ve nbsp;</td><td>Konsantre</td></tr><tr><td>Fare anti-miyojenin</td><td>BD Pharmigen</td><td>556358</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-MEF2</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>C-21</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare Alexa488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Alexa 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti insan CD56-Alexa488</td><td>BD Pharmingen</td><td>557699</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti insan CD146-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>562135</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti insan CD45-PE-CF594</td><td>BD Pharmingen</td><td>562279</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti insan CD34-APC</td><td>BD Pharmingen</td><td>345804</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti insan CD144-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>560410</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 fare IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557702</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 fare IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 fare IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>562292</td><td></td></tr><tr><td>APC fare IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>550854</td><td></td></tr><tr><td>PE fare IgG1k</td><td>BD Pharmingen</td><td>556650</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>DİKKAT:&nbsp; toksik bileşik</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fluka</td><td>762400</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>DİKKAT&nbsp;: toksik bileşik&nbsp;</td></tr><tr><td>Oran görüntüleme elde etme yazılımı: Metafluor 6.3</td><td>Moleküler Cihaz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*&nbsp;: MF 20, Fischman, D.A.&nbsp; tarafından DSHB'ye yatırıldı;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan myoblastlarının İzolasyonu, miyojenik farklılaşmanın değerlendirilmesi ve mağazada kullanılan kalsiyum giriş Ölçümü

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

Uydu hücreleri (SC), kas liflerinin plazma membranı ile çevresindeki bazal laminat arasında bulunan kas kök hücreleridir. Kas rejenerasyonu için gereklidirler. İskelet kaslarında sıklıkla görülen yaralanmalar üzerine SC&#39;ler harekete geçirilir. Myoblastlar olarak çoğalıyor ve kas lezyonlarını onarmak için ayırt ediliyorlar. Kas farklılaşması sırasında gerçekleşen birçok olay arasında, sitosolik Ca 2+ sinyalleri büyük önem taşır. Bu Ca2 + sinyaller hem de hücre dışı alanı Ca2 + girişi, özellikle depo çalışan Ca2 + girişi (SOCE) itibaren, iç Ca2 + depolardan Ca + 2 serbest ortaya çıkar. Bu makale, ortopedik ameliyattan sonra toplanan kas örneklerinden saf bir insan miyoblast popülasyonunu elde etmek için kullanılan bir metodu açıklamaktadır. Doku mekanik ve enzimatik olarak sindirilir ve hücreler çoğaltılır ve daha sonra spesifikasyonların varlığına göre akış sitometrisi ile sıralanırFik membran belirteçleri. Elde edilen insan miyoblastları büyütülür ve büyüme faktörlerini kültür ortamından uzaklaştırarak ayırt etmeyi taahhüt eder. Spesifik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyon seviyeleri ve in vitro immünofloresans, kontrol koşullarında ve Ca 2 + sinyallemeyle ilgili proteinleri susturmadan sonra miyojenik farklılaşma sürecini değerlendirmek için kullanılır. Son olarak, SACE&#39;nin güvenilir ve tekrarlanabilir ölçümlerini sağlayan bir ratiometric Ca 2+ probu olarak Fura-2&#39;nin kullanımını ayrıntılarıyla açıkladık.

Bir insan kas örneğinin enzimatik ayrışmasından sonra, hücreler GM&#39;de amplifiye edildi. CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- hücreleri olarak tanımlanan insan miyoblastları FACS&#39;den sonra elde edildi. Myoblastlar, analiz edilen popülasyonun% 60&#39;ından fazlasını temsil etti ( Şekil 1 ). Primer insan miyoblastları yeniden oluşturuldu, konfluansa kadar çoğaltıldı ve 48 saat DM&#39;de kültürlendi. Transkripsiyon faktörü MEF2 ve kas spesifik protein miyozin ağır zinciri (MyHC) ek...

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

Bu prosedürün genel amacı, yetişkin iskelet kasından saf bir insan miyoblast popülasyonu elde etmektir. Bu hücreler, miyojenik farklılaşmanın değerlendirilmesi ve depoya bağlı kalsiyum girişinin ölçümü gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılır. Bu tekniğin temel avantajı, insan primer miyoblastlarının hızlı, basit ve tekrarlanabilir bir şekilde izole edilmesine olanak sağlamasıdır.Bu miyoblastlar, kas rejenerasyonu sırasında kalsiyum sinyallemesini incelemek için yeni ex-vivo modellerdir. Bu yöntem, kas farklılaşması sırasında rol oynayan iyon kanallarının ve transkripsiyon faktörlerinin belirlenmesi gibi kas alanıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca bu yöntem, insan miyojenik farklılaşması sırasındaki gen fonksiyonlarına dair içgörü sağlayabilir.Bu yöntem, miyojenik kök hücrelerin kas distrofilerinin tedavisinde kullanılması potansiyeli gibi diğer çalışmalara da uygulanabilir. Kas örneğini steril bir altı santimetrelik plakaya aktarın ve örneği iki kez PBS ile yıkayın. Kalan tüm yağ dokusunu temizleyin ve örneği tartın.Ardından, tripsin ekleyin ve kas dokusunu iki milimetreden daha küçük parçalar halinde ince ince doğrayın. Doğrama işlemi tamamlandığında, dokuyu bir manyetik karıştırıcı çubuğun bulunduğu 200 mililitrelik bir disosiyasyon şişesine aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve disosiyasyon şişesi 90 mililitreye ulaşana kadar tripsin çözeltisindeki doğranmış dokuyu toplamaya devam edin. Şimdi, dokuyu 37 °C'deki bir su banyosunda, hafifçe karıştırarak 60 dakika boyunca inkübe edin.Bir saat sonra, reaksiyonu durdurmak için 10 mililitre FCS ekleyin ve karışımı tritürasyon yoluyla homojenleştirin. Ardından, iki adet 50 mililitrelik tübe 70 mikronluk süzgeçler yerleştirin ve hücre süspansiyonunun yarısını pipetleme yoluyla her bir süzgeçten geçirin. Son olarak, hücrelerin büyüme ortamında bir süspansiyonunu hazırlayın ve 200.000 hücreyi, dört mililitre ortam içeren altı santimetrelik plakalara ekleyin.Plakları, her üç günde bir besiyerini değiştirerek inkübe edin. Beş ila yedi gün sonra, hücreler %70 ila %80 konfllüen olduğunda onları boyayın. Başlamak için, konflüen hücrelerin bulunduğu plağı PBS ile durulayın.Ardından, bir mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve enzimin üç dakika boyunca etki etmesini bekleyin. İki mililitre besiyeri ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Sonra, hücreleri santrifüjleyerek çöktürün ve bir mililitre besiyeri içinde yeniden süspande edin.Ardından, hücreleri buz üzerinde saklarken hücre sayımı yapın. Olgu analizi için, yedi tüpün her birine 100.000 hücre yükleyin. Kalan hücreleri ayıklama işlemi için sekizinci bir tüpe yükleyin.Hücreleri bir mililitre soğuk fax tamponu ile yıkayın, ardından tüpleri santrifüjleyin ve süpernatantı aspire ederek atın. Uygun antikorlar içeren 200 mikrolitre fax tamponu ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 30 dakika sonra hücreleri tekrar yıkayın ve 500 mikrolitre fax tamponu içinde yeniden süspanse edin, ardından hücreleri bir akış sitometresi kullanarak ayırın.CD45 pozitif hematopoetik hücreler dışlandıktan sonra, CD45 negatif hücreleri CD56 ekspresyonuna göre ayırın. Ardından, CD56 pozitif popülasyonu CD34, CD144 ve CD146 için kapılayın (gate). Saflığı kontrol etmek için ayrıştırılan popülasyonun bir kısmını yeniden analiz edin.Şimdi, insan miyoblastlarını çekin ve beş mililitre besiyeri ile yıkayın. Ardından bunları bir mililitre besiyeri içinde yeniden süspande edin. Süspansiyonu, dört mililitre besiyeri içeren altı santimetrelik bir plağa aktarın ve plağı 37 °C'de %7 karbondioksit ile inkübe edin.Bu prosedür için, kültüre edilmiş miyoblastları hazır bulundurun ve taze transveksiyon medyumu hazırlayın. Medyumu oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika boyunca inkübe edin. Medyum inkübasyonu sırasında miyoblastları hazırlayın.Öncelikle, hücreleri bir kez PBS ile durulayın. Ardından, yapışık hücreleri tripsinizasyon işlemine tabi tutun. İki mililitre besiyeri ekleyerek reaksiyonu durdurun.Ardından, hücreleri 50 mL'lik bir tüpe toplayın. Santrifüjle çöktürün ve 1 mL besiyerinde yeniden süspande edin. Her bir transfeksiyon için, 200 µL besiyeri içinde 500.000 hücre hazırlayın.Her 500 µL transveksiyon ortamına, 200 µL hücre alikotu ekleyin ve ardından pipet tabancasını yalnızca iki kez kullanarak karıştırın. Daha sonra, reaksiyonların oda sıcaklığında beş dakika boyunca sürmesine izin verin. Beş dakika sonra, reaksiyonları her biri bir cam lamel içeren 3,5 cm'lik kültür kaplarına aktarın.Ardından, toplam hacmi iki mililitreye tamamlamak için 1,3 mililitre besiyeri ekleyin ve plakları inkübe edin. 48 saatlik farklılaşmanın ardından, hücrelere immünboyama yapılabilir veya kalsiyum görüntüleme kullanılarak analiz edilebilir. Her iki seçenek için de, öncelikle hücreleri yıkama amacıyla oda sıcaklığında bir mililitre PBS kullanarak dikkatlice iki kez yıkayın.Miyotüplerin ayrılmasından kaçınmaya çalışın. Kalsiyum görüntüleme için, yıkanmış hücreleri kalsiyum içeren ortamda iki mikromolar fura-2 AM ve bir mikromolar treonik asit ile kaplayın. Ardından, karıştırmadan önce yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe edilmelerini sağlayın.Ardından, hücreleri modifiye edilmemiş kalsiyum içeren ortamla iki kez yıkayın ve daha sonra esterleşme için 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edin. Şimdi, lamelini kültür plağından çıkarın ve deney haznesine yerleştirin. Hazneyi kalsiyum içeren ortamla doldurun, mikroskobun altına yerleştirin ve ardından veri kaydını başlatın.Fura-2, sırasıyla 340 ve 380 nanometrelerde uyarılır. Emisyon ışığı 510 nanometrede toplanır. 340 nanometre görüntülerin 380 nanometre görüntülere bölünmesi, görüntü oranlarını sağlar; dalgalanmalar ve kalsiyum konsantrasyonu nispeten düşük olduğundan, her iki saniyede bir görüntü oranı alınır.İki veya üç dakika sonra, ortamı kalsiyum içermeyen ortamla değiştirin. Ardından, hücrelerdeki depo kaynaklı kalsiyum aktivitesini bir veya iki dakika boyunca izleyin. Sonrasında, hücrelerin iç kalsiyum depolarını tüketmek için hücrelere bir mikromolar thapsigargin ekleyin.Sekiz ila 10 dakika bekleyin, ardından besiyerini hızla kalsiyum içeren besiyeri ile değiştirin ve kalsiyumun suc kanalları aracılığıyla hücrelere girişini beş dakika boyunca kaydedin. Deneyi sonlandırdıktan sonra görüntüleri analiz edin. Arka planı tanımlamak için bölge bir olarak hücre bulunmayan bir alan seçin, ardından bölge iki için sitoplazmada bir alan seçin.İki bölge, serideki görüntülerden herhangi biri üzerinde çizilebilir. Ardından, deneyleri çalıştır sekmesine gidin ve 340 ve 380 kanalları için referans görüntüleri seçin, birinci bölgeyi seçin ve ardından arka planı çıkar seçeneğine tıklayın. Şimdi, tüm görüntülerden arka planı kaldırmak için deneyin tamamını çalıştırın.İşlem tamamlandığında, zaman ve oran verilerinin kaydedildiği bir hesap çizelgesini açmak için veri günlüğünü kaydet seçeneğine tıklayın. Kas hücreleri FACS kullanılarak büyütüldü, çoğaltıldı ve ayrıştırıldı. Miyoblastlar, analiz edilen popülasyonun %60'ından fazlasını oluşturmaktaydı.Primer insan miyoblastları daha sonra farklılaşma ortamında kültüre edilmiş ve MEF2 transkripsiyon faktörü ile miyozin ağır zincir proteinleri için immün boyanmıştır. Hücrelerin çoğunluğu miyozin ağır zincir ekspres etmiş ve yaklaşık %60 füzyon indeksi değerlerine sahip miyotüpler oluşturmuştur; hücrelerin geri kalan %40'ı ise rezerv hücreler olarak da bilinen farklılaşmamış mononükleolu hücreler olarak kalmıştır. Tarif edilen store-operated kalsiyum girişi deneyi, farklılaşmış hücreler üzerinde başarıyla gerçekleştirilmiştir.TRPC ailesinin kalsiyum geçirgen kanallarını hedefleyen küçük müdahale edici RNA ile transfekte edilmiş hücrelerde aynı deneyin gerçekleştirilmesi, nakavt işleminin depo tarafından işletilen kalsiyum girişinde ölçülebilir bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, yetişkin iskelet kasından insan miyoblastlarının nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu hücreleri, kas farklılaşmasının ardışık aşamalarını ve özellikle transkripsiyon faktörlerinin ve kalsiyum kanallarının deaktivasyonunu incelemek için kullanıyoruz.Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, uygun şekilde uygulandığında üç saatten kısa sürede tamamlanabilir. İnsan miyoblast verimini elde eden hızlı, basit ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu prosedürü uygularken, istenmeyen spontan diferansiyasyon oluşacağı için miyoblast kültürlerinin tam konfluense ulaşmasının önlenmesi önemlidir.

isolation-human-myoblasts-assessment-myogenic-differentiation-store

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Kas hücreleri en karmaşık ökaryotik hücreler arasındadır. Tüm gelişim aşamalarında genetik manipülasyon ve net görüntülemeye izin veren yüksek derecede olgun miyofiberlerin in vitro farklılaşması için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Sunulan vibratome kesilmiş miyokardiyal dilimlerden insan ve hayvan ventriküler kardiyomiyosit izolasyon için bir protokoldür. Kalsiyuma dayanıklı hücrelerin yüksek verimi (200 hücre/mg'a kadar) az miktarda dokudan (&lt;50 mg) elde edilebilir. Protokol soğuk iskemiye maruz kalan miyokardiyum için 36 saate kadar geçerlidir.

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.

Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

Bu makalede, 3D insan iskelet kas mikrotleri dizileri ve kas gücü ve kalsiyum elleçleme analizleri de dahil olmak üzere minimal invaziv aşağı akış in situ fonksiyon tahlilleri üretmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan İskelet Kas Mikrotissularında İskelet Kas Sağlığının Fonksiyonel Ölçümlerinin Değerlendirilmesi

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Bu protokol, yetişkin ve yenidoğan fare iskelet kaslarından birincil miyoblastların doku ayrışması, ardışık filtrasyon, ön kaplama ve tanımlanmış kültür koşulları yoluyla izole edilmesi ve zenginleştirilmesi için standartlaştırılmış bir yöntem sunar; böylece uydu hücresinden türetilen miyoblast kültürlerinin sonraki deneysel uygulamalar için oluşturulması ve bakımı mümkün olur.

In vitro miyogenez çalışmaları için iskelet kası uydu hücrelerinin izolasyonu

Keşfedin yetişkin iskelet kasından insan miyoblastlarının hızlı ve tekrarlanabilir izolasyon yöntemini. Miyojenik farklılaşma ve kalsiyum sinyalleşmesi üzerine fonksiyonel çalışmalar için bu teknik kas rejenerasyonu araştırmalarına değerli katkı sağlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Daha fazla video keşfet