Locust Antenlerinde Odorant Reseptör Genlerinin RNA ile Lokalizasyonu Yerinde Hibridizasyon

Bu prosedürün genel amacı, düşük seviyeli eksprese edilen koku reseptör genlerinin yanı sıra böcek antenlerindeki diğer genleri, digoksigenin etiketli veya biyotin etiketli problar kullanarak lokalize etmektir. Bu işleme başlamak için, aktif olan ve sağlam antenleri olan yeni tüy döken yetişkin çekirgeleri seçin, ardından steril tıraş bıçakları kullanarak antenleri iki ila üç milimetrelik parçalara bölün. Daha sonra, OCT bileşiğini dondurucu bir mikrotom tutucuya uygulayın ve numuneleri bileşik üzerine yatay olarak yerleştirin.

Bileşik donana kadar dengelemek için tutucuyu eksi 24 santigrat derecede dondurucu mikrotomun içine aktarın. Daha sonra, tutucuyu çıkarın ve numuneleri küçük bir bileşikle kaplayın. Tutucuyu en az 10 dakika boyunca tekrar eksi 24 santigrat derecede dondurucu mikrotoma aktarın, ardından donmuş numuneleri 12 mikrometre kalınlığında dilimler halinde porsiyonlara ayırın.

Daha sonra dilimleri slaytlar üzerinde tek tek çözdürün ve 10 dakika havayla kurutun. Kriyostat bölümlerini hazırladıktan sonra, slaytları plastik bir kaba koyun ve slaytları %4 PFA solüsyonunda dört santigrat derecede 30 dakika inkübe ederek dokuları sabitleyin. 30 dakika sonra, slaytları bir X PBS'de bir dakika boyunca yıkayın.

Alkali proteinleri ortadan kaldırmak için, slaytları 10 dakika boyunca 0.2 molar hidrojen klorüre aktarın, daha sonra nükleik asidin yüzey proteinini ortadan kaldırmak için slaytları iki dakika boyunca% 1 Triton X-100 ile bir X PBS'ye aktarın. Ardından, slaytları bir X PBS'de 30 saniye boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra, slaytları formamid çözeltisi içinde dört santigrat derecede 10 dakika durulayın.

Slaytları boşaltın ve 100 mikrolitre seyreltilmiş antisens ve sense probları ekleyin, ardından kapak fişlerini doku bölümlerine yerleştirin. Daha sonra, ortamı nemli tutmak için kutunun altına formamid çözeltisi veya bir X PBS ekleyin, ancak slaytları sıvıya batırmayın. Bunu takiben, kapalı slaytları yatay olarak nemli bir kutuya yerleştirin ve 22 saat boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin.

Hibridizasyondan sonra, kapak kızaklarını dikkatlice çıkarın. Kenarları 60 santigrat derecede 0,1 X SSC'de 30 dakika boyunca bir külbütör üzerinde hafifçe çalkalayarak iki kez yıkayın, ardından slaytları bir X TBS'de 30 saniye durulayın. Her slaytta% 0.03 Tritin X-100 ile desteklenmiş TBS'ye bir mililitre% 1 bloke edici reaktif ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, engelleme solüsyonunu atın. Kromojenik tespit için, mililitre anti-digoksigenin-AP konjuge antikorunu mililitre AP çözeltisi başına 1.5 birime seyreltmek için TBS'de bloke edici reaktif kullanın. Daha sonra, kapsanan her slayta 100 mikrolitre AP çözeltisi ekleyin.

TSA tespiti için, mililitre başına 750 birim anti-digoksigenin-AP konjuge antikor ve anti-biyotin streptavidin HRP konjuge antikoru AP HRP çözeltisine seyreltmek için TBS'de bloke edici reaktif kullanın, ardından her kapalı slayta 100 mikrolitre AP HRP çözeltisi ekleyin. Kutuyu nemli tutmak, ancak ıslak olmamak için formamid solüsyonunu veya bir X PBS'yi ekleyin. Bunu takiben, slaytları nemli bir kutuda 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin.

Slaytları bir külbütör üzerinde% 0.05 TWEEN 20 ile desteklenmiş bir X TBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Bundan sonra, plastik kabı hafifçe çalkalanmış bir külbütör üzerinde bırakarak slaytları DAP tamponunda beş dakika durulayın. Kromojenik tespit için, her slayta 100 mikrolitre NBT / BCIP substrat çözeltisi ekleyin.

Kapak fişlerini dikkatlice slaytların üzerine yerleştirin, ardından slaytları alt tabaka solüsyonu ile nemli bir kutuda 10 dakika ila gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Zaman zaman mikroskop altında slaytlara bakarak gelişimi kontrol edin. Geliştirme hazır olduğunda, slaytları suya aktararak reaksiyonu durdurun.

TSA tespiti için, HNPP / Fast Red alt tabakasını şırınga filtresinden hareket ettirmek için bir şırınga kullanın, ardından bir kapak kayma ile kaplanmış her slayta 100 mikrolitre HNPP / Fast Red alt tabaka ekleyin. Bundan sonra, slaytları oda sıcaklığında HNPP / Fast Red substrat ile 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, kapak fişlerini dikkatlice çıkarın ve slaytları% 0.05 TWEEN 20 ile desteklenmiş bir X TBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Slaytları, kapalı slayt başına 100 mikrolitre TSA substratı ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Kapak fişlerini dikkatlice çıkarın ve slaytları PBS gliserolüne gömmeden önce% 0.05 TWEEN 20 ile desteklenmiş bir X TBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Kromojenik tespit için, optik mikroskop kullanarak doku kesitlerini gözlemleyin.

Burada, çekirge anteninin ardışık bölümleri üzerindeki LmigOR1 ve LmigORco antisens probunun etiketleme modeli gösterilmektedir. İşte çekirge anteninin ardışık bölümlerindeki LmigORco ve LmigOR2 antisens probunun etiketleme modeli. Ara sıra etiketlenmiş dendritik benzeri yapıların çizimi burada gösterilmiştir.

TSA tespiti için, konfokal bir mikroskop kullanarak doku kesitlerini gözlemleyin. Burada, LmigOR1 ve LmigORco'nun ekspresyonunu göstermek için uzunlamasına anten kesitinde iki renkli in situ hibridizasyon gerçekleştirildi. LmigORco'yu ifade eden hücre kümelerinde LmigOR1 eksprese eden hücrelerin lokalizasyonu, nöral kimliğini doğruladı ve burada kutulu alanların yakından bir görünümü var.

Bazen etiketli dendritik benzeri yapı bir okla gösterilir ve daire içine alınmış alanlar, LmigORco'yu ifade eden ve aynı duyarlılığı paylaşan koku alma reseptörü nöronları kümesini gösterir.