Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

Bu prosedürün genel amacı, kolorektal kanser hücrelerinde konfokal mikroskopi kullanarak tau fosforilasyonunu, tau'nun mikrotübül bağlanma yeteneklerini ve tau'nun lokalizasyonunu incelemektir. Bu yöntem, biyolojik araştırma alanlarının çoğu, özellikle fosforilasyon ve mikrotübül bağlanmasının önemli faktörler olduğu kanser ve demans araştırmaları için etkili olabilir. Sunulan fosforataz testinin temel avantajı, protein numunelerinin tüm fosforilasyonunu algılamak için kolay bir yol sağlamasıdır.

Mikrotübül bağlayıcı testin ana avantajı, mikrotübül bağlayıcı proteinleri bağlayıcı olmayan fraksiyonlardan ayırmak için basit bir prosedür olmasıdır. Bununla birlikte, tau lokalizasyon tekniğinin temel faydaları, nispeten az miktarda primer ve sekonder antikor gerektirmesidir. Bu prosedüre başlamak için, tüm reaktifleri metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın.

Yaklaşık bir milyon HCT 116 hücresini, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş minimum esansiyel besiyeri içeren kültür kaplarına aktarın. Hücreler %65 birleşmeye ulaştığında, FBS takviyeli ortamı çıkarmak için bir aspiratör kullanın. Ardından, kurkumin veya lityum klorür içeren serumsuz MEM ekleyin.

37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 24 saat inkübe edin. Bundan sonra, hücreleri 10 mililitre buzlu soğuk PBS ile yıkayın. Bir mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve ardından hücreleri kazımak ve 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

1800 kez G ve dört santigrat derecede dört dakika santrifüjleyin. Hücre peletlerini 100 mikrolitre tam RIPA tamponunda dört santigrat derecede 20 dakika boyunca askıya alıyoruz ve hücreleri parçalamak için tüplere düzenli olarak dokunduğunuzdan emin oluyoruz. Ardından, numuneleri 0,2 saniye boyunca açık ve 0,2 saniye boyunca toplam 2 saniye boyunca kapalı olarak %10'luk bir genlikte kısaca sonikleştirin.

Hücre homojenatını 20 dakika boyunca 22, 570 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanları yeni etiketli tüplere aktarın ve daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi Bradford testi ile protein konsantrasyonunu ölçün. 20 mikrogram toplam protein içeren numuneleri hazırladıktan sonra, her birine iki mikrolitre alkalin fosfataz tamponu ve 10 mikrolitre alkalin fosfataz ekleyin.

Ardından, her bir numunenin son hacmi 20 mikrolitre olacak şekilde damıtılmış su ekleyin. Numuneleri 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Numuneler inkübe edilirken, aynı konsantrasyonda, ancak karşılaştırma için fosfataz içermeyen ek numuneler hazırlayın.

Bir saat sonra, 50 milimolar final konsantrasyonunda EDTA veya 10 milimolar final konsantrasyonda sodyum ortovanadat ekleyerek reaksiyonu durdurun. 400 milimolar DTT içeren taze hazırlanmış 4XSDS jel yükleme tamponu ekleyin. Bir ısı bloğu kullanarak, numuneleri 100 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Numuneleri vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika soğumaya bırakın. Ardından, kuyu başına 13 mikrolitre numune ve moleküler tartımlı merdiveni %10'luk bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Elektroforez sistemini bir güç kaynağına bağlayın ve protein örneklerini istifleme jelinden çözme jeline taşımak için voltajı 20 dakika boyunca 70 volta ayarlayın.

Bundan sonra, 125 volta yükseltin ve numuneler ve protein merdiveni jelin sonuna ulaşana kadar jeli yaklaşık 70 ila 120 dakika çalıştırın. Islak bir elektroblotlama sistemi kullanarak, jeli yaklaşık 100 dakika boyunca 100 voltta bir poliviniliden florür membranına aktarın. Daha sonra, oda sıcaklığında 90 dakika boyunca% 4 sığır serum albümini lekelemek için zarı inkübe edin.

Lekeyi gece boyunca 4 santigrat derecede birincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin. Ertesi gün, lekeyi PBST'de üç kez yıkayın ve her seferinde yedi dakika yıkayın. Emin olmayan ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin.

Ardından, PBST ile dört kez yıkayın ve her yıkama yedi dakika sürer. Üreticinin talimatlarına göre bir kemilüminesans kiti kullanarak lekeyi geliştirin. Geliştirilen lekeyi şeffaf plastik sargı ile örtün ve ardından piyasada bulunan bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile lekenin kemilüminesans görüntülerini elde edin.

Taze numuneler hazırladıktan sonra, 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Numuneleri 60 dakika boyunca 100.000 kez G ve 25 santigrat derecede ultrasantrifüj edin. Daha sonra, bağlanmamış tau içeren her süpernatantın 120 mikrolitresini ayrı, temiz ve etiketli tüplere aktarın.

Bağlı tau içeren pelete 120 mikrolitre Fibic numune tamponu ekleyin. İyice karıştırdıktan sonra, girdap ve pipetleme ile karışımı temiz, etiketli tüplere aktarın. Eşdeğer protein konsantrasyonuna sahip numuneleri hazırladıktan sonra, 400 milimolar DTT içeren taze 4XSDS jel yükleme tamponu ekleyin.

Numuneleri 100 santigrat derecede beş dakika inkübe etmek için bir ısı bloğu kullanın. Numuneleri vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika soğumaya bırakın. Oyuk başına 13 mikrolitre numune ve moleküler ağırlık merdivenini %10'luk bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin.

Elektroforez sisteminin pozitif ve negatif elektrotlarını bir güç kaynağına bağlayın ve ardından voltajı 20 dakika boyunca 70 volta ayarlayın. Bundan sonra, 125 volta yükseltin ve numuneler ve protein merdiveni jelin sonuna ulaşana kadar jeli yaklaşık 70 ila 120 dakika çalıştırın. Jeli yaklaşık 100 dakika boyunca 100 voltta bir poliviniliden florür membranına aktarmak için ıslak bir elektroblotlama sistemi kullanın.

Oda sıcaklığında 90 dakika boyunca% 4 sığır serum albümini ile lekelemek için zarı inkübe edin. Daha sonra, dört santigrat derecede birincil antikor çözeltisi içinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, lekeyi PBST ile dört kez yıkayın ve her yıkama yedi dakika sürer.

Yıkanmış lekeyi ilgili ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. Ardından, yıkamayı toplam dört kez tekrarlayarak yedi dakika boyunca PBST ile yıkayın. Bir kemilüminesans kiti kullanarak lekeyi geliştirin.

Şeffaf plastik sargı ile örtün ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak görüntüler elde edin. Başlamak için, kapak kaymalarını altı oyuklu bir doku örtü plakasının kuyucuklarına yerleştirin ve daha sonra önerilen kültür ortamındaki her bir oyuğa 250.000 hücre tohumlayın. 24 saat sonra, hücreleri PBS ile iki kez durulayın.

Kurkumin içeren serumsuz MEM ekleyin ve 24 saat boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, hücreleri tekrar buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Hücreleri karanlıkta 37 derecelik bir inkübatörde% 3.7 formaldehit içinde sabitleyin.

Hücreleri PBS ile yıkayın ve ardından hücreleri 15 dakika boyunca 20 santigrat derecede buz gibi soğuk metanolde sabitleyin. Bundan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca PBS'de% 3 BSA ve% 0.1 Triconex 100'de buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici tamponda inkübe edin.

Daha sonra, her bir oyukta kesilmiş poliviniliden florür parçasına 60 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Kapak kaymalarının, hücreler antikor çözeltisi ile temas edecek şekilde yerleştirilmesi. Gece boyunca 4 santigrat derecede karanlık nemli bir odada inkübe edin.

Ertesi gün, hücreleri PBS ile dört kez yıkayın. Poliviniliden florür parçalarının her birine 80 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve kapak fişlerini hücreler antikor çözeltisi ile temas edecek şekilde yerleştirin. Oda sıcaklığında karanlık ve nemli bir odada iki saat inkübe edin.

Bundan sonra, hücreleri PBS ile dört kez yıkayın. Numuneleri DAPI ile montaj ortamına monte edin ve ardından kapak kızaklarını cam kızaklara sabitleyin. Daha sonra oda sıcaklığında karanlık bir odada bir buçuk saat inkübe edin.

Konfokal bir mikroskop kullanarak slaytları inceleyin. Bu çalışmada, cite spesifik tau fosforilasyonu bir fosfo-tau antikoru kullanılarak değerlendirilmiştir. Kurkumin ile tedavi edilen hücrelerin, kurkumin konsantrasyonu arttıkça azalmış tau eksprese ettiği görülmektedir.

Öte yandan, fosfo-tau ekspresyonunun daha düşük kurkumin konsantrasyonlarında arttığı, sadece çok yüksek konsantrasyonlarda azaldığı görülmektedir. Lityum klorür ile muamele edilen hücreler daha sonra incelenir. Görülebileceği gibi, hem tau hem de fosfo-tau'nun ekspresyonu, lityum klorür tedavisi altında önemli ölçüde azalmıştır.

Genel fosforilasyon daha sonra fosfotaz testi ile değerlendirilir. Tau'nun fosfotaz ile muamele edilmiş numunelerde, muamele edilmemiş kontrol numunesine kıyasla daha hızlı göç ettiği görülmüştür, bu da kontrol numunesinin fosforile olduğunu gösterir. Kurkumin ile muamele edilen hücre örnekleri çok benzer sonuçlar gösterdi, bu da tedavi kolorektal kanser hücre hatlarının tau fosforilasyonunu azaltmadığını gösterdi.

Hem fosfataz ile muamele edilmiş hem de muamele edilmemiş numuneler, lityum klorür ile muamele edilmiş hücre numunelerinde hemen hemen aynı aralıkta elektroforeze edildi ve bu da tau fosforilasyonunda bir azalma olduğunu gösterdi. Daha sonra, hücre örneklerinin mikrotübüler bağlanma testi, pozitif kontrol olarak tau 352 kullanılarak başarılı bir şekilde kurulur. Burada gösterildiği gibi, hem kurkumin hem de düşük konsantrasyonda lityum klorür tedavisi, mikrotübül bağlanma aktivitesinin inhibe edilmesine neden olur.

Daha sonra konfokal mikroskopi yapılır. Kurkumin tedavisini takiben, tau'nun çekirdeğe yer değiştirdiği görülür. Bu, nükleer tau'nun nöronal DNA korumasında kilit oyuncu olduğunu bildiren daha önceki çalışmaları desteklemektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, protein örneklerinin tüm fosforilasyonunu belirlemek için bir fosfotaz testinin nasıl gerçekleştirileceğini ve bir mikrotübül bağlama testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Çeşitli küçük miktarlarda antikor kullanarak konfokal mikroskopi ile bir immünofloresan testinin nasıl gerçekleştirileceğini anlayabilmelisiniz. Burada sunulan prosedürler uygun maliyetlidir ve potansiyel olarak farklı tau-forez ve kanserleri tedavi etmek için yeni terapötik ajanların keşfine ve geliştirilmesine yardımcı olacaktır.