Name: Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Öğrenin, kolorektal kanser hücrelerinde tau fosforilasyonu, mikrotübül bağlama ve lokalizasyonunu konfokal mikroskopi ile nasıl analiz edilir. Bu yöntemler kanser ve demans araştırmalarında değerli uygulamalar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projenin bir parçası 'Kalkınma ve sanayileşme yüksek değer kozmetik hammadde deniz mikroalg' başlıklı, okyanuslar Bakanlığı ve balıkçılık, Kore tarafından finanse edilen ve intramural grant (2Z04930) tarafından desteklenen bu araştırma gerçekleştirildi Doğal ürünlerin KIST nin Gangneung Enstitüsü '.

1. reaktifler hazırlık <ol><li>Ekle 10 µL (1 mM) phenylmethylsulfonyl florür çözüm, 10 µL (1 x 100 x stoktan) proteaz inhibitörü kokteyl çözüm ve 10 µL (1 x 100 x stoktan) fosfataz inhibitörü kokteyl çözüm 1 x radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabelleği tam RIPA lizis arabellek hazırlamak için 1 ml.</li>
	<li>Hazırla 10 x genel tübülin arabellek (PEM) arabellek.
	<ol><li>Ekle 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N &#39; - bis - 2-ethanesulfonic asit, 10 mM (95,1 mg) etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N &#39;, N &#39;-tetraacetic asit, 10 mM (51 mg) MgCl 2 ve 1.25 M (10 M 3 mL) NaOH bir 50 mL tüp , mix 15 mL distile su ile ve bir girdap kullanarak geçiyoruz. (6,9 olmalıdır) pH kontrol edin. Eğer pH &#62; 6,9, arabellek atmak ve taze çok remake. 
		Not: NaOH bu pH 6,9 aşma değil emin olmak için 1.25 M olmalıdır. HCl pH ayarlama için kullanmak için tavsiye değil &#62; 6,9.</li>
		<li>Dropwise pH 6,9 olana Ekle NaOH. 10 X PEM arabellek ilâ 25 mL distile su ekleyin. Son olarak, bir şırınga ve 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre uygulama. Bu arabellek aliquots 1,5 mL tüpler içine bölmek ve depolamak saat 4'te ° C.</li>
	</ol></li> <li>Hazırla 5 örnek arabellek indirgeyici ve boya ile x.
	<ol><li>Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-5 mL 5 x SDS örnek arabellek de makyaj HCl (pH 6.8), 2.5 mL (% 25) % 50 gliserol, % 10 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), 1.2 mL distile su ve 1 mL (% 2). Mağaza &#8722; 20 ° c 
		Not: gliserol viskoz olduğu için ölçüm 1,25 mL gliserol zordur. Bir mL % 100 gliserol 1.26 g ağırlığında. Böylece, % 100 gliserol 1,575 g tartmak (hangi eşittir %100 1,25 mL veya 2.5 mL % 50 gliserol) bir 15 mL tüp ilk; Mix de diğer bileşenlerle.</li>
	</ol></li></ol> 2. Hücre kültürü, Curcumin tedavisi veya LiCl tedavi ve muayene Protein ifade <ol><li>Ekle ~ 1 10 6 HCT 116 hücreleri x 100 mm içine doku kültürü yemekleri ile % 10 fetal sığır takıma en az temel medya (MEM) içeren Serum (FBS) ve % 1 penisilin-streptomisin. Kültür bir gün sonra hücrelerin % 60-70 izdiham ulaşacaktır. 
	Not: Aşağıda açıklanan tedaviler Sayısı Tabaklar gerekli sayısını bağlıdır.</li>
	Hücreleri (mikroskopi kullanarak yaklaşık olarak) ~ %65 izdiham ulaşmak, takıma MEM orta kaldırıp serum ücretsiz MEM 5 mikron, ile 10 µM ve 30 µM curcumin veya 25 mM, 50 mM, 100 mM LiCl eklediğinizde <li>. Oksijen bir atmosferde % 5 CO 2 içeren 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>24 saat sonra tedavi, 1 mL buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) hücrelerle yıkama ve hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazımak. Alıntı hücrelerin içine 1,5 mL tüpler santrifüj kapasitesi ve santrifüj kapasitesi 1.800 x g 4 ° C'de hücre granül elde etmek için de 4 dk için transfer.</li>
	<li>Düzenli olarak tüpler dokunarak süre içinde tam RIPA arabelleği için 20 dk 4 ° C'de 100 µL granül askıya tarafından hücreleri parçalayıcı. Kısaca örnekleri solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Hücre homogenates 22,570 x g de benchtop santrifüj 20 dakika içinde 4'te santrifüj kapasitesi ° C. Transfer supernatants bir pipet kullanarak etiketli diğer tüpler.</li>
	<li>Supernatants protein konsantrasyonu ticari protein-tahlil Kitleri kullanarak Bradford tahlil 45 tarafından tedbir.</li>
	<li>Hazırlama örnekleri eşit protein konsantrasyonu (10 µg protein/13 µL örnek) hücre lysates ile 4 X SDS jel-yükleme arabellek. 4 x SDS jel-yükleme arabellek 400 mM dithiothreitol (DTT) içeren taze hazırlanan. 
	Not: Bu aşamada, örnekleri, saklanabilecek olan &#8722; 20 ° C gerekirse.</li>
	<li>Örnekleri 5 dakika süreyle 100 ° C'de ısı blokta bir girdap kullanarak örnekleri Mix ve onları ~ 10-15 için soğumasını bekleyin Incubate dk.</li>
	<li>Araya bir Elektroforez Sistemi.
	<ol><li>Yük 10 µg protein (13 µL örnek) başına % 10 SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) için iyi. Molekül ağırlıklı merdiveni tek şeritli jöleye üzerine yük. 
		Not: Elektroforez başlatılırken, protein merdiven belirgin moleküler ağırlık protein grupları çözümler. Moleküler ağırlık bilinmeyen protein gruplarından tahmin etmek için bu bantları kullanın.</li>
		<li>Örnekleri yükledikten sonra pozitif ve negatif elektrotlar Elektroforez Sistemi sabit voltaj korumak için bir güç kaynağına bağlayın. Başlangıçta, 70 V 20 dk için protein örnekleri yığın jel çözme jel taşımak başlangıç. Örnekleri ve protein merdiven jel sonuna ulaşana kadar sonra 125 V yaklaşık 70-120 min için voltajı yükseltin.</li>
		<li>Islak electroblotting sistemini kullanarak polivinilidin difluoride (PVDF) membran Jel Elektroforez tamamlanmasından sonra transfer. ~ 100 dk 100 blok V. için 25 90 dakika oda sıcaklığında %4 sığır serum albumin (BSA) engelleme arabellekte membran aktarım ° C.</li>
	</ol></li> <li>Leke molekül ağırlıklı merdiven yanında keserek işaretleyin. Şeffaf plastik levha ve keskin kesici leke kesim için kullanın. İlköğretim-antikor Çözümleri (1:5, 000 Anti-tau; anti-fosfo-tau 1:4, 000) hazırlamak ve bu çözüm 4 ° C'de blot gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Gecede kuluçka sonra leke 7 min için dört kez fosfat tamponlu tuz-ara-20 (PBST) çözümde yıkayın.</li>
	<li>İlgili ikincil-antikor Çözümleri (keçi Anti-tavşan ya da anti-fare IgG 1:5, 000) hazırlamak ve leke dört kez, 7 dk PBST yaklaşık 25 ° C. makinaya 90 dakika oda sıcaklığında Bu çözümde kuluçkaya.</li>
	<li>Geliştirmek üreticiye göre bir Kemiluminesan kit kullanarak leke &#39; s öneriler. Şeffaf plastik wrap kullanarak leke kapsar. Görüntüleri görüntüleme sistemi ile ilgili yazılım Kemiluminesan için bir Kemiluminesan tarafından elde.</li>
</ol> 3. Fosfataz tahlil <ol><li>(Kimden adım 2.5) hücre lysates ile alkalen fosfataz alkalen fosfataz arabellekte tedavisi.
	<ol><li>İçeren 20 µg toplam protein hem de kontrol ve tedavi örnekleri, 20 µL hazırlamak için örnekler. Ardından 2 µL alkalen fosfataz arabellek ve 10 µL alkalen fosfataz 20 µg toplam protein içeren hücre lysates hacmi ekleyin. Kadar 20 µL distile su ekle.</li>
	</ol></li> <li>1 h. durdurmak 50 mM son bir konsantrasyon ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyerek veya sodyum orthovanadate (Na 3 VO 4) 10 mM son bir konsantrasyon ekleme için tepki örnekleri 37 ° C'de kuluçkaya. Tepki de Isıtma 75 ° c 5 dakika süreyle tarafından durduruldu</li>
	<li>Fosfataz örnekleriyle kuluçka bitirmeden önce aynı toplama örnekleri fosfataz fosfataz tedavi örnekleri ile karşılaştırma için eklemeden hazırlayın.</li>
	<li>Ekle taze hazırlanmış 4 X SDS jel-yükleme arabellek içeren 400 mM DTT.</li>
	<li>Bir girdap kullanarak örnekleri örnekleri 5 dk. Mix için 100 ° C'de ısı blokta kuluçkaya. Serin için oda sıcaklığında ~ 10-15 dk.</li>
	<li>% 10 polyacrylamide jel SDS-PAGE tarafından çalıştırmak için bir Elektroforez Sistemi montajı.
	<ol><li>% 10 polyacry iyi başına yük 10 µg protein (13 µL örnek)lamide jel. Molekül ağırlıklı merdiveni yük.</li>
		<li>Örnek yükledikten sonra pozitif ve negatif elektrotlar Elektroforez Sistemi sabit voltaj korumak için bir güç kaynağına bağlayın. Başlangıçta, 70 V 20 dk için protein örnekleri yığın jel çözme jel taşımak başlangıç. Daha sonra 125 V gerilim artırmak ve örnekleri ve protein merdiven jel sonuna ulaşana kadar yaklaşık 70-120 dakika için jel çalıştırın.</li>
		<li>Islak electroblotting sistemini kullanarak PVDF membran üzerine Jel Elektroforez tamamlanmasından sonra transfer. Aktarım için ~ 100 dk 100 V.</li>
		<li>Leke küçük molekül ağırlıklı merdiven üstünde belgili tanımlık yan kesim yaparak mark. Leke kesim için şeffaf plastik levha ve keskin kesici kullanın.</li>
	</ol></li> <li>% 4 BSA engelleme arabelleği 90 dakika oda sıcaklığında membran engellemek.</li>
	<li>Gecede İlköğretim-antikor çözümü (1:5, 000 Anti-tau) 4 ° C'de blot kuluçkaya. Leke PBST içinde dört kez, 7 dk her yıkayın.</li>
	<li>İlgili ikincil-antikor çözüm (keçi Anti-fare IgG 1:5, 000) hazırlamak ve 90 dakika oda sıcaklığında leke kuluçkaya. PBST içinde dört kez, 7 dk her yıkayın.</li>
	<li>Geliştirmek üreticiye göre bir Kemiluminesan kit kullanarak leke &#39; s öneriler. Leke içinde şeffaf plastik bir şal örtmek. Görüntüleri görüntüleme sistemi ile ilgili yazılım Kemiluminesan için bir Kemiluminesan tarafından elde.</li>
</ol> 4. Mikrotubul bağlama tahlil <ol><li>Mikrotubul bağlama tahlil için adımları yineleyin 2.1-2.6.</li>
	<li>Hazırla 1 X 10 X PEM arabellek (2 mL) PEM arabelleğinden 4 ° C'de 20 µM (40 µL) Paklitaksel ve 1 mM (20 µL) GTP ekleyerek saklı. Mikrotubul üzerinden (MT) hisse senedi almak &#8722; 80 ° C dondurucu ve E. coli tau çalışma stoktan &#8722; 20 ° C dondurucu.</li>
	<li>Hazırlamak örnekleri göre Tablo 1.</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk. Ultracentrifuge 60 dk az 100.000 x g için 25 ° c için kuluçkaya.</li>
	<li>İçeren supernatants transfer 120 µL tau temizlemek için ilişkisiz ve tüpler etiketli.</li>
	<li>5 X 120 eklemek µL (aynı birim olarak süpernatant) ilişkili tau içeren Pelet arabelleğe örnek ve iyice karıştırın. Etiketli tüpler temiz ve iyice karıştırın çözüm transfer.</li>
	<li>Ölçmek protein konsantrasyonu (bkz. Adım 2.6). 
	Not: örnekleri hazırlarken, çözüm (Adım 4.6) hacmi Pelet hem süpernatant örnekleri hazırlamak için kullanın.</li>
	<li>Hazırlamak eşdeğer protein konsantrasyonu örnekleri ve taze hazırlanmış 4 x SDS jel-yükleme arabellek DTT (400 mM) içeren ekleyin. 
	Not:-Ebilmek var olmak stok örnekleri, &#8722;, bu aşamada 20 ° C.</li>
	<li>3.5-3.10 adımlarını yineleyin.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>örnek</td> <td colspan="2"> adı</td> <td colspan="2"> gerekli mikrotubul </td> <td colspan="2"> ana Protein gerekli</td> <td colspan="2"> PEM-GTP-PTX</td></tr> <tr><td>1</td> <td colspan="2"> HCT 116-kontrol (6.21 μg/μl)</td> <td colspan="2"> 2 μl</td>
			<td colspan="2"> 9.66 μl (60 μg)</td>
			<td colspan="2"> 108.34 μl</td></tr>
		<tr><td>2</td> <td colspan="2"> HCT 116-Curcumin 10 mikron (4,81 μg/μl)</td> <td colspan="2"> 2 μl</td> <td colspan="2"> 16.63 μl (80 μg)</td> <td colspan="2"> 101.37 μl</td></tr> <tr><td>3</td> <td colspan="2"> HCT 116-Curcumin 20 mikron (3.28 μg/μl)</td> <td colspan="2"> 2 μl</td> <td colspan="2"> 30.49 μl (100 μg)</td> <td colspan="2"> 87.51 μl</td></tr> <tr><td>4</td> <td colspan="2"> HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) </td> <td colspan="2"> 2 μl</td> <td colspan="2"> 18.42 μl (100 μg)</td> <td colspan="2"> 99.58 μl</td></tr> <tr><td>5</td> <td colspan="2"> E. coli tau</td> <td colspan="2"> 2 μl</td> <td colspan="2"> 1 μl Tau-352</td> <td colspan="2"> 117 μl</td></tr> <tr><td>6</td> <td colspan="2"> MT sadece</td> <td colspan="2"> 2 μl</td> <td colspan="2"> X</td> <td colspan="2"> 118 μl</td></tr> <tr><td></td> <td colspan="2"></td> < td colspan = " 2"></td> <td colspan="2"></td> <td colspan="2"> 120 μl</td></tr></tbody></table> Tablo 1: örnek Mikrotubul bağlama tahlil için hazırlık.
 5. Yerelleştirme ve ifade Tau Curcumin içeren hücreleri tedavi sonra <ol><li>% 70 etanol kullanarak bir coverslip temiz ve kuru bir laboratuvar doku kullanarak. Bir tek coverslip etiketli 6-iyi doku kültürü plaka her kuyuya yerleştirin. Plaka biyolojik bir emniyeti dolap yerleştirin ve UV ışığı en az 3 h. geçiş</li>
	<li>Alt kültür hücreleri ve onları 2. 5 x 10 5 hücreleri/iyi önerilen kültür ortamında, 6-şey plaka ilgili kuyu tohum.</li>
	<li>~ 24 h sonra hücresel morfolojik değişiklikleri denetlemek için X 10 ve 40 X hedefleri kullanarak ters bir mikroskop kullanarak hücreleri incelemek. Gerekirse kaydetmek fotoğraf.</li>
	<li>İki kez PBS kullanarak hücreleri durulayın. % 3.7 formaldehit 37 ° C kuluçka karanlık hücrelerde düzeltmek. 
	Not: Fiksasyon formaldehit oda sıcaklığında tarafından çok iyi çalışıyor. Formaldehit işleme uygun kişisel koruyucu ekipman giyerler.</li>
	<li>PBS hücrelerde yıkayın. Buz gibi metanol hücreleri tamir &#8722; 15 dakika süreyle 20 ° C Permeabilize hücreleri % 0,1 ile % 3 BSA kuluçka tarafından PBS 10 dakika süreyle buzda Triton X-100 yıkama PBS hücrelerle.</li>
	<li>Kuluçkaya engelleme arabellek hücrelerde (% 3 BSA ve % 0.1 ara-20 PBS çözümünde) oda sıcaklığında 1 h için. 
	Not: Kuluçka 4 ° C'de 2 h için iyi, çok çalışıyor.</li>
	<li>% 3 BSA ve % 0.1 İlköğretim-antikor (1: 200, Anti-tau) çözüm hazırlamak ara-20 PBS (örneğin, 2 µL tau-13 antikor 0.4 mL arabelleği).</li>
	<li>Bir PVDF küçük parçalar koparıp membran parçaları düzgün 6-şey plaka; her şey içinde uygun böylece emmek onları suda 5 dk. yer her şey içinde kesik PVDF.</li>
	<li>Ekleyin 60 µL kesme için birincil antikor çözümün PVDF parçalar halinde her şey. Öyle ki hücreleri İlköğretim-antikor çözüm dokunabilir miyim coverslips yerleştirin. Karanlık, nemli odasında 4 ° C'de gecede kuluçkaya. PBS içinde dört kez yıkayın.</li>
	<li>% 3 BSA ve % 0.1 ikincil-antikor çözüm (fluoresein Birleşik 594 Anti-fare IgG 1: 400) hazırlamak ara-20 PBS.</li>
	<li>Parçaları düzgün 6-şey plaka her şey içinde uygun ve her şey içinde kesik PVDF suda 5 dk. yer onları emmek PVDF membran küçük parçalar koparıp.</li>
	<li>Ekleyin 80 µL ikincil-antikor çözüm her 6-şey plaka PVDF parçaları için. Öyle ki hücreleri ikincil-antikor çözüm dokunabilir miyim coverslip yerleştirin. 2 h. PBS ile yıkama için oda sıcaklığında karanlık, nemli bir odasında dört kez kuluçkaya.</li>
	<li>Mount örnekleri 4 montaj orta &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve düzeltme coverslips cam slaytlara.
	Cam slaytlara DAPI ile montaj orta <ol><li>Ekle bir damla. Coverslips her kuyudan çıkarın ve onları DAPI ile montaj orta içeren cam slaytlara yerleştirin. Yarış lekeli hücreleri içeren her coverslip yüzeyine dokunduğundan emin olunTing orta karşılık gelen cam slaytta.</li>
		<li>Uygula tüm her coverslip mühür ve bunları düzeltmek için çevresinde hava geçirmez Cam slaytlara cilası. Gerekirse, iki kez bu adımı yapmak.</li>
	</ol></li> <li>Incubate 1,5 saat karanlık bir oda oda sıcaklığında için.</li>
	<li>Coverslip karanlık bir odada daldırma yağ kullanarak confocal bir mikroskop kullanarak slaytları inceleyin.</li>
</ol>

Yazarlar onlar ifşa birşey yok bildirin.

Bu el yazması toplam tau algılamak için farklı yordam koşullar kurulmuş ve tau curcumin ve LiCl ile tedavi kolorektal kanser hücrelerinde fosforile. Tau protein örneklerinde genel fosforilasyon durumunu değerlendirmek için fosfataz tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil herhangi bir protein fosforilasyon durumunu incelemek için kullanılabilir.
Bu tahlil protein hamle sigara fosforile durumuna yavaş fosforile ilkesine dayanır. Alkalen fosfataz ve alkalen fosfataz arabellek bu protokol için kullanılır...

Tau aslında tübülin1ile birlikte saf bir ısı-kararlı Mikrotubul ilişkili protein olarak tespit edilmiştir. Tau sadece daha yüksek Ökaryotlar2,3,4' te ifade edilir. Tau ana fonksiyonu Mikrotubul derleme1,5,6kontrol etmektir. Ayrıca mikrotübüller7, aksonal transport8, aksonlar çapı9değişimler, nöroma polarite ve ateş10polimerizasyon için katkıda bulunur. Tau da bazı sinyal yolları kontrol etmek için bir protein iskele davranır. Sıçan beyin çalışmalar önermek o tau nöron özel ve akson11' öncelikle yerelleştirir. Tau Mikrotubul polimerizasyon ve nöronal gelişim için gerekli olduğundan, tau merkezi sinir sistemi aksonal gelişiminde önemli bir rol oynamaya onaylanmadığına karar; Bu hipotez sonraki vitro ve in vivo deneyler tarafından doğrulanmadı. Nöronlar yanı sıra, karaciğer, böbrek ve kas hücreleri12,13de dahil olmak üzere farklı nöronal olmayan hücrelerde, tau ifade edilir. Tau da insan meme, prostat, kolorektal, mide ve pankreas kanseri hücre satırları ve dokular14,15,16,17,18, ifade edilir 19. tau da dahil organları20bükülmüş tubulofilaments olarak dahil-vücut miyozit içinde bulundu.
Tau birkaç translasyonel modifikasyonlar taşıyabilir. Tüm translasyonel modifikasyonlar fosforilasyon yaygın olarak kullanılır. Artan tau fosforilasyon mikrotübüller, nihayet sitoiskeleti istikrarsızlaştırıcı için onun ilgi azalır. Seksen beş fosforilasyon siteleri insan Alzheimer hastalığı beyin dokulardan izole tau protein tarif edilmistir. Bu siteleri, serin, % 41 treonin ve sadece % 6 tirozin kalıntıları21,22,%2353 teşkil etmektedir. Tau fosforilasyon onun yerelleştirme, fonksiyon, bağlama, çözünürlük ve diğer translasyonel modifikasyonlar, duyarlılık etkiler. Ayrıca tau fosforilasyon normal ölçüde daha (veya fosfat grupları ile tam doygun) Alzheimer hastalığı24yapısal ve işlevsel özellikleri çoğaltır hyperphosphorylation bilinir. Tau aksonal mikrotübüller düzgün tutar ve normal nöronal fizyolojik koşullar altında çalışmasını sağlar. Ancak, hyperphosphorylated tau Mikrotubul sökme nedeniyle nöronal kaybına neden bir iyi organize edilmiş Mikrotubul bağlama korumak başarısız olur. Tau fosforilasyon normal düzeyde uygun tau işleyişi için gereklidir, ancak tau karakteristik fosforilasyon seviyesine bir değişiklik yapıldığında ve hyperphosphorylated25ise normal işlevine başarısız olur. Alzheimer hastalığı ve bazı diğer yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıklar, tau hyperphosphorylated olur ve eşleştirilmiş Helisel filamentler ve neurofibrillary tangles26,27oluşturur. Böylece, tau fosforilasyon ve Mikrotubul bağlama belirlemek için önemli yöntemlerdir.
Kolorektal kanser, bir yaşlanma ilişkili kanser üçüncü en sık kanser ve ölümüne neden olan üçüncü önde gelen kanser hem erkek hem de kadınlar için28tanısı var. Kolorektal kanser Batı dünyasının29ana ölümüne neden olan kanser biridir. Kolorektal kanser ve Alzheimer hastalığı yaşlanma ile ilişkili olan ve her ikisi de nerede insanlar benzer beslenme alışkanlıkları zevk gelişmiş ülkelerde özellikle oldu çünkü iki hastalık bir şekilde ilişkili. Buna ek olarak, tau-pozitif ve negatif tau kanser hücrelerinin farklı yanıt kemoterapötik ajanlar, örneğin, Paklitaksel16için.
Curcumin Curcuma longa, Hint baharat zerdeçal30ana türevleri biridir. Yüzyıllar boyunca, Güney Asya nüfus zerdeçal günlük olarak besinlerinde tüketilen sahip. Curcumin kolorektal kanser, Alzheimer hastalığı, şeker hastalığı, Kistik fibrozis, inflamatuvar barsak hastalığı, artrit, hiperlipidemi, ateroskleroz ve iskemik kalp hastalığı31, de dahil olmak üzere farklı hastalıkları tedavi etmek için kullanılır 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lityum veya kolorektal kanser hücrelerini öldürmek de onların nükleer silahların yayılmasına karşı39önlemek. Lityum de tau toplama azalır ve onun hyperphosphorylation bir transgenik fare modeli41,42,43gözlemlediği gibi engeller olarak Alzheimer hastalığı40 tedavi etmek için kullanılabilir, 44.
Bu el yazması amaçlamaktadır: 1) ölçü toplam tau ve fosfo-tau ifade seviyelerinde işlem görmüş hücreleri; 2) genel tau fosforilasyon ölçmek için bir fosfataz tahlil tarif; 3) tau Mikrotubul bağlama incelemek; ve 4) kolorektal kanser hücre çizgiler curcumin veya LiCl ile tedavi confocal mikroskobu tarafından tau yerelleştirilmesine. Sonuçları curcumin ile hücre tedavi, hangi kolon kanseri için sözde iyi bir kemoterapötik Ajan ve tedavi LiCl ile her iki toplam tau ifade azaltabilir ve tau kolorektal kanser hücre hatlarında fosforile olduğunu ortaya koyuyor. Bu tedaviler de tau nükleer translocation neden olabilir. Ancak, beklenmedik bir şekilde, curcumin tau mikrotübüller için bağlama geliştirmek başarısız olur.

<table><tbody><tr><td>HCT 116 hücreli</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>MEM (EBSS)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>ThermoFisher (Gibco)</td> <td>16000044</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>penisilin-streptomisin</td><td>Hipklon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>WelGene</td><td>LS 015-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mm çanak</td><td>Corning</td><td>430161</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>Corning</td><td>Coster 3516</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tau 13 antikor</td><td>abcam</td><td>ab19030</td><td></td></tr><tr><td>Ditiyotreitol (DTT)</td> <td>Roche</td><td>10 708 984 001</td><td>Depolama Sıcaklığı 2&ndash; 8 & derece; C</td></tr><tr><td>Mikrolitre Santrifüjler</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>MIKRO 200 R</td><td></td></tr><tr><td>Paklitaksel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td>Depolama Sıcaklığı 2&ndash; 8 & derece; C</td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>78246</td><td>Depolama Sıcaklığı 2&ndash; 8 & derece; C</td></tr><tr><td>Mikrotübüller (MT)</td><td>Hücre iskeleti</td><td>MT001</td><td>4 > C (kurutulmuş)</td></tr> <tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td> <td>ile Montaj Ortamı</td><td>4 > Karanlıkta C</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>WelGene</td><td>LB 001-02</td><td></td></tr><tr><td>Sonik Ayırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>Model 500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100 XP</td><td></td></tr><tr><td>BORULAR</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Görüntüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc XRS +</td><td>4 & derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Protein tahlili boya reaktifi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tubulin (11H10) Tavşan mAb</td><td>Hücre sinyali</td><td>2125</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Tavşan mAb</td><td>Hücre sinyali</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tau (fosfo S396) antikoru</td><td>abcam</td><td>ab109390</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>FastAP Isıya Duyarlı Alkalin Fosfataz</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Fosfataz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Hücresi Sinyalizasyonu</td><td>5870</td> 4 <td>° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Hücresi Sinyalizasyonu</td><td>5871</td><td>4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>RIPA Tampon</td><td>Sigma</td><td>R 0278</td><td>Depolama Sıcaklığı 2&ndash; 8 & derece; C</td></tr><tr><td>Tau-352 insan</td><td>Sigma</td><td>T 9950</td><td>Mağaza -20 &°C'de; C</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X - 100</td><td>Mağaza yaklaşık 25 > C</td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG İkincil Antikor</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11005</td><td>4 &°C'de saklayın; Karanlıkta C</td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskopi</td><td>Leica</td><td>Mikrosistem Leica TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Affymetrix</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>Protein Testi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>4 & derecede saklayın; Ç</td></tr></tbody></table>

tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin tau proteinin birlikte mikrotubul bağlama için

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Mikrotubul ilişkili protein tau çoğunlukla akson yerelleştirir nöronal bir proteindir. Genellikle tau Mikrotubul derleme ve sabitleme yer çünkü normal nöronal işleyişi için gereklidir. Nöronlar yanı sıra, tau insan meme, prostat, mide, kolorektal ve nerede neredeyse benzer yapısını gösterir ve benzer işlevleri nöronal tau giderek artan pankreas kanserleri ile ifade edilir. Tau ve onun fosforilasyon miktarı onun işlevini mikrotübüller sabitleyici değiştirin ve Alzheimer hastalığı gibi farklı nörodejeneratif hastalıklarda eşleştirilmiş Helisel filamentler gelişmesine yol. Tau ve Mikrotubul bağlama özellikleri fosforilasyon durumunu belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, tau hücre içi lokalizasyonu inceleyerek farklı hastalıklarda önemlidir. Tau fosforilasyon ve mikrotübüller kolorektal kanser hücreleri veya curcumin ve LiCl tedavi olmadan içinde tau bağlama ölçmek için bu el yazması detayları standart iletişim kuralları. Bu tedaviler kanser hücre çoğalması ve geliştirme durdurmak için kullanılabilir. Hücre içi tau yerelleştirilmesini immünhistokimya ve confocal mikroskobu antikorlar düşük miktarda kullanırken kullanarak incelenir. Bu deneyleri hkr tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama etkileyen bileşikler eleme için kullanılabilir. Roman therapeutics için farklı tauopathies kullanılan veya bu iletişim kurallarını kullanarak ilgili antikanser ajanların potansiyel olarak karakterize edilebilir.

Toplam tau ve fosfo-tau ifadesi curcumin veya LiCl (şekil 1) farklı konsantrasyonları hücrelerle tedavi sonra incelenmiştir. Hücre tedavisi curcumin üç farklı konsantrasyonları ile tau ifade seviyeleri azalma; Ancak, fosfo-tau ifade curcumin düşük konsantrasyon ile tedavi üzerine artmış ama daha yüksek curcumin konsantrasyonları hücrelerle tedavi üzerine düşmüştür. Anti-fosfo-tau (Ser396) fosfo-tau tespiti için kullanıldı. LiCl (şekil 1</...

Bu el yazması tau hyperphosphorylation, tau bağlama mikrotübüller ve hücre içi tau ilaç tedavileri takip yerelleştirilmesini ölçme ölçmek için standart iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller sürekli uyuşturucu ya da tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama hedef diğer bileşikler eleme için kullanılabilir.

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Bu prosedürün genel amacı, kolorektal kanser hücrelerinde konfokal mikroskopi kullanarak tau fosforilasyonunu, tau'nun mikrotübül bağlama yeteneklerini ve tau lokalizasyonunu incelemektir. Bu yöntem, fosforilasyon ve mikrotübül bağlamanın önemli faktörler olduğu çoğu biyolojik araştırma alanı için, özellikle de kanser ve demans araştırmaları için etkili olabilir. Sunulan fosforataz analizinin temel avantajı, protein örneklerinin toplam fosforilasyonunu algılamak için kolay bir yol sunmasıdır.Mikrotübül bağlama deneyinin temel avantajı, mikrotübül bağlayan proteinleri bağlamayan fraksiyonlardan ayırmak için basit bir prosedür olmasıdır. Öte yandan, tau lokalizasyon tekniğinin temel faydası, nispeten az miktarda primer ve sekonder antikor gerektirmesidir. Bu prosedüre başlamak için, tüm reaktifleri metin protokolünde belirtildiği şekilde hazırlayın.Yaklaşık bir milyon HCT 116 hücresini, %10 fetal bovine serum ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş minimum esansiyel medyum içeren kültür kaplarına aktarın. Hücreler %65 konfluense ulaştığında, FBS destekli medyumu uzaklaştırmak için bir aspiratör kullanın. Ardından, kurkumin veya lityum klorür içeren serumsuz MEM ekleyin.%5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Bunun ardından, hücreleri 10 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve ardından hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı (cell scraper) kullanarak hücreleri 1,5 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın.1800 ×g'de ve 4 °C'de dört dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre pelletlerini, hücreleri liz etmek için tüplere düzenli olarak vurmaya dikkat ederek, 4 °C'de 20 dakika boyunca 100 µL tam RIPA tamponu içinde süspanse ediyoruz. Ardından, numuneleri %10 amplitütte, 0,2 saniye açık ve 0,2 saniye kapalı olacak şekilde toplam 2 saniye boyunca kısaca sonikasyona tabi tutun.Hücre homojenatını 22.570 ×g'de ve dört °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantları yeni etiketlenmiş tüplere aktarın ve ardından metin protokolünde belirtildiği gibi Bradford testi ile protein konsantrasyonunu ölçün. 20 µg toplam protein içeren örnekleri hazırladıktan sonra, her birine iki µL alkali fosfataz tamponu ve 10 µL alkali fosfataz ekleyin.Ardından, her bir örneğin son hacmi 20 µL olacak şekilde distile su ekleyin. Örnekleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Örnekler inkübe olurken, karşılaştırma yapmak için aynı konsantrasyonda ancak fosfataz içermeyen ek örnekler hazırlayın.Bir saat sonra, reaksiyonu final konsantrasyonu 50 millimolar olacak şekilde EDTA veya final konsantrasyonu 10 millimolar olacak şekilde sodyum ortovanadat ekleyerek durdurun. 400 millimolar DTT içeren taze hazırlanmış 4XSDS jel yükleme tamponu ekleyin. Bir ısı bloğu kullanarak, numuneleri 100 °C'de beş dakika inkübe edin.Numuneleri vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika soğumaya bırakın. Ardından, her bir kuyucuğa 13 µL numune ve moleküler ağırlık marker'ını %10'luk poliakrilamid jele yükleyin. Elektroforez sistemini bir güç kaynağına bağlayın ve protein numunelerinin istifleme jelinden ayırıcı jele geçmesi için voltajı 20 dakika boyunca 70 volt olarak ayarlayın.Bundan sonra, voltajı 125 volta yükseltin ve örnekler ile protein merdiveni jelin sonuna ulaşana kadar jeli yaklaşık 70 ila 120 dakika boyunca çalıştırın. Islak bir elektroblotting sistemi kullanarak, jeli 100 volta yaklaşık 100 dakika boyunca bir poliviniliden florür membrana aktarın. Ardından, membranı bloklamak için oda sıcaklığında 90 dakika boyunca %4 sığır serum albümini içinde inkübe edin.Blotu, birincil antikor çözeltisi içinde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, blotu PBST ile her biri yedi dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 90 dakika boyunca sekonder antikor çözeltisi içinde inkübe edin.Ardından, her biri yedi dakika sürecek şekilde dört kez PBST ile yıkayın. Blotun geliştirmesini, üretici talimatlarına uygun olarak bir kemilüminesans kiti kullanarak gerçekleştirin. Geliştirilen blotu şeffaf plastik film ile kapatın ve ardından ticari olarak mevcut bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile blotun kemilüminesans görüntülerini alın.Taze numuneler hazırlandıktan sonra, bunları 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Numuneleri 100.000 ×g'de ve 25 °C'de 60 dakika boyunca ultrasantrifüjleyin. Ardından, bağlanmamış tau içeren her bir süpernatanttan 120 µL'yi ayrı, temiz ve etiketlenmiş tüplere aktarın.Bağlı tau içeren pelete 120 µL Fibic örnek tamponu ekleyin. Vorteksleyerek ve pipetleyerek iyice karıştırdıktan sonra, karışımı temiz, etiketli tüplere aktarın. Eşdeğer protein konsantrasyonundaki örnekleri hazırladıktan sonra, 400 mM DTT içeren taze 4XSDS jel yükleme tamponu ekleyin.Numuneleri beş dakika boyunca 100 °C'de inkübe etmek için bir ısıtma bloğu kullanın. Numuneleri vorteksleyin ve ardından 10 ila 15 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Her kuyuya 13 µL numune ve moleküler ağırlık markerı yükleyerek %10 poliakrilamid jeli üzerinde yürütün.Elektroforez sisteminin pozitif ve negatif elektrotlarını bir güç kaynağına bağlayın ve ardından voltajı 20 dakika boyunca 70 volt olarak ayarlayın. Bundan sonra voltajı 125 volta yükseltin ve örnekler ile protein merdiveni jelin sonuna ulaşana kadar jeli yaklaşık 70 ila 120 dakika boyunca çalıştırın. Jeli bir poliviniliden florür membran üzerine 100 volt ile yaklaşık 100 dakika boyunca aktarmak için ıslak bir elektroblotting sistemi kullanın.Blot membranını, oda sıcaklığında 90 dakika boyunca %4 sığır serum albümini içinde inkübe edin. Ardından, dört santigrat derece sıcaklıkta bir gece boyunca primer antikor çözeltisinde inkübe edin. Ertesi gün, blot'u her biri yedi dakika süren toplam dört kez PBST ile yıkayın.Yıkanmış blotu, ilgili sekonder antikor çözeltisi içinde oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. Ardından, PBST ile yedi dakika boyunca, yıkama işlemini toplam dört kez tekrarlayarak yıkayın. Kemilüminesans kiti kullanarak blotu görüntüleyin.Şeffaf plastik film ile kapatın ve kemilüminesans görüntüleme sistemi kullanarak görüntüler elde edin. Başlamak için, lamelleri altı kuyucuklu bir doku lameli plakasının kuyucuklarına yerleştirin ve ardından her kuyucuğa önerilen kültür ortamında 250.000 hücre ekin. 24 saat sonra hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.Kurkumin içeren serumsuz MEM ekleyin ve %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 derece Celsius'ta 24 saat inkübe edin. Bunun ardından, hücreleri tekrar buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Hücreleri, karanlıkta, 37 derece Celsius'luk bir inkübatörde %3,7 formaldehit ile sabitleyin.Hücreleri PBS ile yıkayın ve ardından hücreleri 20 °C'de buz gibi soğuk metanolda 15 dakika boyunca fikse edin. Bunun ardından, hücreleri buz üzerinde PBS içinde %3 BSA ve %0,1 Triconex 100 içeren solüsyonda 10 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca bloklama tamponunda inkübe edin.Ardından, her kuyucuktaki kesilmiş poliviniliden florür parçasına 60 µL primer antikor çözeltisi ekleyin. Lamelleri, hücrelerin antikor çözeltisiyle temas edecek şekilde yerleştirin. Karanlık ve nemli bir bölmede, 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, hücreleri dört kez PBS ile yıkayın. Poliviniliden florür parçalarının her birine 80 µL sekonder antikor çözeltisi ekleyin ve hücrelerin antikor çözeltisiyle temas etmesini sağlayacak şekilde lamelleri yerleştirin. Oda sıcaklığında, karanlık ve nemli bir bölmede iki saat boyunca inkübe edin.Bundan sonra, hücreleri dört kez PBS ile yıkayın. Örnekleri DAPI içeren montaj ortamına yerleştirin ve ardından lamelleri cam slaytlara sabitleyin. Daha sonra oda sıcaklığında, karanlık bir bölmede bir buçuk saat boyunca inkübe edin.Slaytları konfokal mikroskop kullanarak inceleyin. Bu çalışmada, spesifik tau fosforilasyonu bir fosfo-tau antikoru kullanılarak değerlendirilmektedir. Kurkumin ile işlem gören hücrelerde, kurkumin konsantrasyonu arttıkça tau ekspresyonunun azaldığı görülmektedir.Diğer yandan, fosfo-tau ekspresyonunun kurkuminin daha düşük konsantrasyonlarında arttığı, yalnızca çok yüksek konsantrasyonlarda azaldığı görülmektedir. Ardından, lityum klorür ile işlem görmüş hücreler incelenir. Görüldüğü üzere, lityum klorür uygulaması altında hem tau hem de fosfo-tau ekspresyonu anlamlı derecede azalmıştır.Genel fosforilasyon daha sonra fosfataz testi ile değerlendirilir. Fosfataz ile işlem görmüş örneklerde Tau'nun, işlem görmemiş kontrol örneğine kıyasla daha hızlı göç ettiği görülür; bu durum kontrol örneğinin fosforile olduğunu gösterir. Kurkumin ile işlem görmüş hücre örnekleri çok benzer sonuçlar göstermiş olup, bu durum kolorektal kanser hücre hatlarına uygulanan işlemin tau fosforilasyonunu azaltmadığını göstermektedir.Lityum klorür ile işlem görmüş hücre örneklerinde, hem fosfataz ile işlem görmüş hem de işlem görmemiş örnekler neredeyse aynı aralıkta elektroforez edilmiş olup, bu durum tau fosforilasyonunda bir azalma olduğunu göstermektedir. Ardından, tau 352 pozitif kontrol olarak kullanılarak hücre örneklerinin mikrotübül bağlanma testi başarıyla kurulmuştur. Burada gösterildiği üzere, hem kurkumin hem de düşük konsantrasyonda lityum klorür uygulaması, mikrotübül bağlanma aktivitesinin inhibe olmasıyla sonuçlanmaktadır.Ardından konfokal mikroskopi uygulanır. Kurkumin uygulamasının ardından, tau'nun çekirdeğe transloke olduğu görülür. Bu durum, nükleer tau'nun nöronal DNA korumasında kilit bir rol oynadığını bildiren önceki çalışmaları desteklemektedir.Bu videoyu izledikten sonra, protein örneklerinin toplam fosforilasyonunu belirlemek için fosfataz analizinin nasıl yapılacağını ve mikrotübül bağlanma analizinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi bir şekilde kavramış olmalısınız. Çeşitli küçük miktarlarda antikor kullanarak konfokal mikroskopi ile immünofloresan analizinin nasıl yürütüleceğini çözebilmelisiniz. Burada sunulan prosedürler maliyet açısından etkili olup, farklı tauopatilerin ve kanserlerin tedavisine yönelik yeni terapötik ajanların keşfine ve geliştirilmesine potansiyel olarak yardımcı olacaktır.

assay-for-phosphorylation-microtubule-binding-along-with-localization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, kolorektal kanser hücrelerinde bir fosfataz testi ile tau proteininin fosforilasyon durumunu değerlendirmek için bir protokolü açıklar. Fosfataz enzimi, tau proteini üzerinde bulunan fosfat grupları üzerinde etki ederek, tedavi edilmemiş tau proteini örneklerine kıyasla tau proteininin SDS PAGE jeli üzerindeki hareketliliğini arttırır.

CRC Hücrelerinde Fosfataz Deneyi: Kolorektal Kanser Hücrelerinde Tau Proteininin Fosforilasyon Durumunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, kolorektal kanser hücrelerinde mikrotübül bağlayıcı tau proteinini bağlayıcı olmayan hiperfosforile tau protein fraksiyonlarından ayırmak için kullanılan mikrotübül bağlama testi açıklanmaktadır. Bu tahlil, tau proteininin fosforilasyon durumunu değiştirebilen ve mikrotübül bağlanmasını etkileyen çeşitli kimyasalların etkisini belirlemeye yardımcı olur.

CRC Hücrelerinde Mikrotübül Bağlanma Deneyi: Kolorektal Kanser Hücrelerinde Mikrotübül Bağlayıcı Tau Proteinini İncelemek İçin Bir Yöntem

Proteinleri tampona bırakmak için dokuyu homojenize edin. Proteaz inhibitörleri, proteaz aktivitesini bloke ederek protein bozulmasını önler.

Western Blot Analizi Kullanılarak Fare Beyin Örneklerinde Fosforile Tau Proteinlerinin Tespiti

Bu video, bir proteindeki çoklu fosforilasyonları tanımlamak için nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) tekniklerinin kullanımını göstermektedir. Bir proteinin spesifik amino asitte fosforilasyonu, komşu amid hidrojenin deshieldasyonuna neden olur ve bu da spektral farkı oluşturur.

Proteinlerdeki Çoklu Fosforilasyonları Tanımlamak için Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Bu videoda, kantitatif bir değerlendirme için floresanla aktive edilen hücre sıralaması yoluyla analiz edilen, pH'a duyarlı floresan etiketli Tau agregatları kullanılarak murin mikroglia tarafından Tau alımını ölçen hücre bazlı bir test gösterilmektedir.

Mikroglia tarafından Tau proteini alımını değerlendirmek için hücre bazlı bir test

Değiştirilmemiş ve hiperfosforile tau proteinleri hiperfosforizasyonu bağımlı hızlı agregasyon kinetiğini ortaya çıkarmak için, iki in vitro toplanma deneylerde kullanıldı. Bu deneyler Alzheimer hastalığının ilerlemesini altında yatan fibriller oluşturmak için hiperfosforilize tau eğilimini modüle edebilir bileşikler için gelecek ekranlar için önünü.

In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Burada nicelik eylem Anti-tau antikorların mekanizmaları daha iyi tanımlamak için bir araştırma aracı oluşturma amacıyla microglia tarafından tau alımını değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklayın.

Antikor aracılıklı Tau izni Microglia tarafından eğitim için tahlil hücre tabanlı

Tau, hem mikrotübülleri bağladığı sitoplazmada hem de Alzheimer hastalığına bağlı genlerin modülasyonu da dahil olmak üzere alışılmadık işlevler uyguladığı çekirdekte bulunan nöronal bir proteindir. Burada, sitoplazmik Tau gelen herhangi bir girişim hariç nükleer Tau işlevini araştırmak için bir yöntem açıklar.

Tau Subsellojen Lokalizasyonunun Hastalıkla İlgili Genlerin İfadesini Araştırmaaracı Olarak Modülasyonu

Tübülin polimerleri olan mikrotübüller, ökaryotik hücrelerde bir hücre iskeleti bileşeni olarak çok önemli bir rol oynar ve dinamik kararsızlıkları ile bilinir. Bu çalışma, çeşitli fare dokularındaki mikrotübüllerin stabilitesini değerlendirmek için mikrotübülleri kararlı mikrotübüllere, kararsız mikrotübüllere ve serbest tübüllere ayırmak için fraksiyonlamak için bir yöntem geliştirdi.

Fare Dokularında Kararlı Mikrotübülleri, Labil Mikrotübülleri ve Serbest Tübülleri Ayırmak için Kantitatif Mikrotübül Fraksiyonlama Tekniği

Öğrenin, kolorektal kanser hücrelerinde tau fosforilasyonu, mikrotübül bağlama ve lokalizasyonunu konfokal mikroskopi ile nasıl analiz edilir. Bu yöntemler kanser ve demans araştırmalarında değerli uygulamalar sunar.

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

Daha fazla video keşfet