Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Bu prosedürün genel amacı, küçük hacimli geri dönüşüm ACSF'nin basitleştirilmiş karbojenasyon araçlarını sağlamak ve bir floresan mikroskobu üzerine monte edilmiş bir kayıt odası kullanarak alan potansiyellerinin uzun vadeli kayıtlarını elde etmek için bir yöntem sağlamaktır. Bu yöntem, hücresel bir öğrenme ve anı modunda sinaptik iletimi ve hafıza oluşumunu düzenleyen altta yatan lignin yolakları ile ilgili nöroplastisite alanındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, spesifik antagonistler veya agonistler kullanılarak yapılan deneylerin maliyet etkinliğini artırmak için küçük bir biyo rezervuarın oksijen seviyesini stabilize etmeye yardımcı olmasıdır.

Akut hipokampus dilimlerinin hazırlanması, laboratuvarımızın doktora öğrencileri Xia ve Weiguang tarafından gösterilmiştir. Bu işleme başlamak için, dorsal korteksin bir parçasını her yarım kürenin sırt kenarı boyunca 70 derecelik bir açıyla incelemek için soğuk bir cerrahi bıçak kullanın. Soğuk bir diş çimentosu spatulasıyla, yüzeyi kısa bir süre kurutmak için her yarım küreyi bir parça filtre kağıdına aktarın.

Yeni kesilmiş yüzeylere sahip iki yarım küreyi, yarım kürelerin kuyruk ucu tıraş bıçağına bakacak şekilde hızlı etkili yapışkan yapıştırıcı kullanarak buz gibi soğuk dilimleme platformuna monte edin. Ardından, dilimleme platformunu bir vibratomun soğutma odasına yerleştirin. Hazneyi dilimleme tamponu ile iki ila dört santigrat derecede doldurun ve karbonjenize edin.

Bundan sonra, yeterli vibrotom ayarlarını kullanarak 350 mikrometre dilimler kesin. Makas olarak iki enjeksiyon kanülü kullanarak hipokampal oluşumu subikulumdan ve entorinal kortekslerden izole edin. Bir pastör pipeti kullanarak önceden hazırlanmış inkübasyon odasının dilim tutma ağından kabarcıkları çıkarın.

Daha sonra, stratum piramidal kısmında bir miktar şeffaflığa sahip olan dilimleri, geniş ağızlı bir pastör pipeti ile inkübasyon odasının ağı üzerindeki dilimleme platformundan aktarın. Bu adımda, geri dönüşüm sisteminin çıkış akışına üç bir boru konektörü ekleyin. Üç boru konektörünün orta kolunu bir karbojen besleme borusuna bağlayın ve akış hızını bir hava akış ölçer ile düzenleyin.

Bundan sonra, geri dönüşüm sisteminin girişine ikinci bir üç boru konektörü ekleyin. Orta kolu hat içi ısıtıcıya bakan boruya, üst kolu ince bir silikon tüpe ve alt kolu rezervuardan giriş borusuna bağlayın. Ardından, peristolik pompa tarafından üretilen dilim haznesindeki ACSF'nin titreşiminin minimum olduğu tüp boyunca bir konuma ince bir silikon tüp üzerine bir tüp sıkacağı yerleştirin.

Şimdi, küçük bir parça lens temizleme kağıdını ve U şeklinde bir platin tel üzerine sabitlenmiş bir naylon ağı daldırma dilimi haznesinde birkaç dakika önceden ıslatın. Bundan sonra, U şeklindeki platin teli çıkarın. Geri dönüşümü kapatın ve lens temizleme kağıdına bir dilim yerleştirin.

Ardından, dilim tutma ağını hemen dilimin üzerine yerleştirin. Pompayı açın ve hedefi ACSF'ye daldırmadan dilimin 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Bu arada kayıt elektrodunu ACSF ile doldurun ve pipet tutucusuna monte edin.

Metal stimülasyon elektrodunun yalıtımını sodyum bikarbonat çözeltisine yerleştirerek kontrol edin. Elektrodu bir DC voltaj jeneratörünün negatif kutbuna bağlayın ve bir diseksiyon mikroskobu altında uçta kabarcık oluşumunu gözlemleyin. Ardından, test edilmiş epoksi yalıtımlı tungsten stimülasyon elektrodunu manipülatör tutucusuna ve referans telini dilim haznesine yerleştirin.

Hazneye ikinci bir referans elektrodu ekleyin ve bunu kayıt elektrodunun baş aşamasının referans soketine bağlayın. Amplifikatör kontrol yazılımında, sıfır kelepçe modu kutusuna tıklayın, ardından çıkış kazancı liste kutusuna çift tıklayın. 100'lük bir kazanç seçin, yüksek geçiren filtre kutusu kabına çift tıklayın, üç kilohertz seçin ve 0.1 hertz'i seçmek için düşük geçiren filtre liste kutusu AC'ye çift tıklayın.

Kayıt yazılımında, edin, açık protokole tıklayın. Epizodik stimülasyonlara ve 50 ila 100 milisaniye boyunca 10 ila 20 kilohertz'de güçlendirilmiş potansiyellerin dijitalleştirilmesine izin veren ve epizodik bir kaydın başlamasından 10 milisaniye sonra otomatik olarak bir uyaran izolatörünü tetikleyen ayarlara sahip bir protokol seçin. Stimülasyon ve kayıt elektrotlarını stratum piramidal ile aynı hizada ve paralel olarak yerleştirin.

Ardından, edin, protokolü düzenle'ye tıklayın ve açılır pencerede tetikleyici sekmesini seçin. Tetikleyici kaynak kutusuna tıklayın ve tetikleyici kaynağı olarak boşluk çubuğunu seçin. Ardından, tamam düğmesine tıklayın ve edinmeyi başlatmak için kayıt düğmesine tıklayın.

Uyaran izolatör yazılımında voltaj kontrol kutusuna tıklayın ve sıfır girin. İndir düğmesine tıklayın. Bunu takiben, kayıt yazılımı penceresine tıklayın ve boşluk çubuğuna basın.

1000 ile 8000 arasındaki değerleri sırayla girerek bu döngüyü tekrarlayın. Stimülasyon gücünü FEPSP eğim değerleriyle ilişkilendirin ve FEPSP eğiminin maksimumunun %40'ını elde etmek için gereken stimülasyon gücünü belirleyin. Voltaj kontrol kutusuna tıklayın ve belirlenen değeri girin.

Ardından, indir düğmesine tıklayın. Kayıt yazılımında, durdur düğmesine ve ardından edinme menüsüne tıklayın. Protokolü düzenle'ye tıklayın ve açılır pencerede tetikleyici sekmesini seçin.

Ardından, tetikleyici kaynak kutusuna tıklayın ve tetikleme kaynağı olarak dahili zamanlayıcıyı seçin. Tamam düğmesine ve ardından her 60 saniyede bir alan potansiyellerinin otomatik kaydını başlatan kayıt düğmesine tıklayın. 30 ila 60 dakika sonra durdur düğmesine tıklayın.

Kayıt yazılımında, al'a tıklayın, protokolü açın ve temel kayıtla aynı protokolü seçin. Tamam düğmesine tıklayın ve ardından kaydet'e tıklayın. Saha potansiyel kayıtlarını iki ila dört saat boyunca otomatik olarak çalıştırmaya devam edin.

Tamamlandığında, kaydı sonlandırmak için durdur düğmesine tıklayın. Bu şekil, küçük bir ACSF rezervuarının geri dönüşümü ile çıkış karbojenasyonu ve rezervuar karbojenasyonu kullanılarak sinaptik iletimin aktiviteye bağlı güçlendirilmesinin temsili kayıtlarını göstermektedir. Potansiyesyon, sıfır zaman noktasından sonra saniyede üç kez 100 hertz trenle indüklendi.

Bu şekil, küçük bir ACSF rezervuarının geri dönüşümü ile çıkış karbojenasyonunun, yalnızca rezervuar karbojenasyonu ile yapılan deneylere kıyasla LTD indüksiyonunu geliştirdiğini göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, dilim hazırlama beş ila 10 dakika içinde yapılabilir ve uygun şekilde gerçekleştirilirse saatlerce stabil bir alan potansiyeli kaydı da elde edilebilir. Bu prosedürü denerken, karbojenasyon seviyenizi, perfüzyon hızınızı, elektrotların konumunu ve spesifik eşdeğerliğinizin stimülasyon stresini ayarlamanız önemlidir.

Bu prosedürü takiben, aktiviteye bağlı sinaptik plastisitenin indüksiyonuna yanıt olarak ravin sondalarının sap hücresel lokalizasyonunun virilizasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için yama kelepçesi, adli mikroskopi gibi başka bir yöntem gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nöroplastisite alanındaki araştırmacıların, kuyu sekmesi ve transgenik fare genlerinin in vitro hipokampal dilimlerinde hücresel bir öğrenme ve hafıza modu olarak aktiviteye bağlı sinaptik plastisiteyi keşfetmelerinin yolunu açar. Bu videoyu izledikten sonra, temporal hipokampustan akut dilim hazırlığının nasıl gerçekleştirileceğini ve küçük bir geri dönüştürülmüş ACSF hacmi kullanılarak sinaptik iletimlerin uzun süreli kaydı için nasıl kararlı koşulların elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Hayvanlarla ve kimyasal bileşiklerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven giymek ve uygun dezenfeksiyon gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.