Yüksek molekül ağırlıklı Biotinylated Dextran Amin uygulama içinde sıçan izleme Thalamocortical projeksiyon için geliştirmek

Bu videonun genel amacı, merkezi sinir sisteminde optimal nöral etiketlemeyi incelemek için yüksek moleküler ağırlıklı BDA uygulaması için rafine bir protokol göstermektir. Bu önlem, sinir ağı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Nöral devreler aracılığıyla nöral etiketlemenin çerçeve yapısını görselleştirerek.

Bu tekniğin temel avantajı, yerel bir nöral devreyi ve kimyasal özelliklerini başlatma fırsatı sağlamasıdır. Bir cam mikropipet ile donatılmış bir mikrolitre mikroşırınga hazırlayın ve sıvı parafin çekerek test edin. Fareyi onaylanmış bir protokol kullanarak uyuşturduktan sonra, bir kuyruk tutamına reaksiyon olmamasıyla derin anesteziyi onaylayın.

Daha sonra hayvanın başının üst kısmını elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin ve ameliyat bölgesini %10 povidon iyot, ardından %70 etanol ile ovalayın. Kulaklara künt kulak çubukları yerleştirerek ve farenin üst kesici dişlerini ağız tutucusuna yerleştirerek fareyi stereotaksik cihaza sabitleyin. Gözlere oftalmik bir merhem sürün.

Steril koşulları korumak için steril cerrahi eldivenler ve örtüler kullanın. Ameliyat bölgesinin kafa derisini tekrar %70 etanol kullanarak temizleyin. Bir neşter ile deride sagital bir kesi yaptıktan sonra, sagital sütür boyunca, kası ve periosteuumu kafatasından uzaklaştırmak için steril pamuk uçlu aplikatörler kullanın.

Bir atlastan önceden tanımlanmış koordinatları kullanarak, kraniyotominin yerini belirleyin. Meninksler görünene kadar yaklaşık bir milimetre derinliğe kadar delmek için yuvarlak uçlu bir çapak matkabı kullanarak bir kraniyotomi yapın. Serebral korteksi enjeksiyon bölgesi üzerinde açığa çıkarmak için mikro forseps kullanarak dura mater'i çıkarın.

Sıvı parafini mikroşırıngadan çıkarın ve ardından% 10 BDA çözeltisi hazırlayın. Şırıngayı mikroenjeksiyon aparatına monte edin ve mikropompayı bağlayın. Stereomikroskop altında, mikroenjeksiyon aparatını manipüle edin.

Doldurulmuş cam mikropipeti beynin kortikal yüzeyinden 5,8 milimetre derinliğe kadar VPM'ye yerleştirin. Ardından, üç dakikalık bir süre boyunca VPM'ye 100 nanolitre %10 BDA'yı basınçlı enjeksiyonu yapmak için mikro pompayı kullanın. Beş dakika sonra pipeti yavaşça geri çekin.

Yarayı steril iplikle dikin, ardından fareyi bilincini geri kazanana ve tamamen iyileşene kadar ılık bir iyileşme alanına yerleştirin. Sıçanı ötenazi yaptıktan sonra, sıçanın göğüs boşluğunu açmak ve kalbe erişmek için makas ve forseps kullanın. Sol ventriküle, aorta doğru intravenöz bir kateter yerleştirin ve ardından sağ kulak kepçesini açın.

İlk olarak, kalpten çıkan kan berraklaşana kadar yaklaşık bir ila iki dakika boyunca fizyolojik sıcaklıkta% 0.9 salin ile perfüzasyon yapın. Daha sonra 0.1 molar fosfat tamponunda 250 ila 300 mililitre% 4 paraformaldehit ile devam edin. Diseke edilen beyni oda sıcaklığında iki saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.

Daha sonra beyni 0.1 molar PBS'de% 30 sükroza aktarın ve dört santigrat derecede üç gün boyunca kriyoproteksiyon yapın. Üç gün sonra, beyin çözeltiye battığında, bir beyin matrisi yardımıyla beyni koronal yönde üç bloğa bölün. Merkezi blok, primer somatosensoriyel kortekste talamusun ventral posteromedial çekirdeğini içerir.

Beynin merkezi bloğunu, koronal düzlemde kesit almak ve dondurulduğunda 40 mikronda kesit almak için kayan mikrotomun donma aşamasına monte edin. Bölümleri, 0.1 molar PBS içeren altı oyuklu bir tabakta toplayın. Bölümleri 0.1 molar PBS'de yaklaşık bir dakika sallayarak durulayarak boyamaya başlayın.

Daha sonra bölümleri,% 0.3 Triton X-100 içeren 0.1 molar PBS'de AF500 / 525 yeşil floresan Nissl boyasında karışık bir streptavidin-AF594 çözeltisine aktarın ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Boyamadan sonra, bölümleri 0.1 molar PB'de sallanarak üç kez yıkayın. Standart histokimyasal teknikleri kullanarak bölümleri mikroskop slaytlarına monte edin.

Bölümleri yaklaşık bir saat havayla kurutun. Damıtılmış su içinde %50 gliserin uygulayın ve slaytları görüntülemeden önce tomurcuk bölümlerine ve kapak kaymasına uygulayın. Bu temsili fotomikrograf, yeşil Nissl boyamanın arka planında talamusun ventral posteromedial çekirdeğinin kırmızı renkte BDA enjeksiyon bölgesini göstermektedir.

Dördüncü katmandaki talamil kortikol aksonları ve beşinci ve altıncı katmanlardaki kortikal talamik nöronlar dahil olmak üzere thoresan BDA etiketlemesi burada gösterilmiştir. Karşılaştırma için, bu fotomikrograf, standart bir avidin-biyotin peroksidaz prosedürü ile geleneksel BDA etiketlemesinin, thoresan BDA etiketlemesine benzer bir nöral etiketleme modeli ortaya çıkardığını göstermektedir. BDA etiketli bir dikenli bölümün bu daha yüksek büyütme görünümü, anterograd olarak etiketlenmiş aksonal arborları kırmızı renkte ayrıntılı olarak gösterir.

Retrograd olarak işaretlenmiş nöronal hücre gövdesi, dendritler ve dendritik dikenler burada ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, kraniyotomi ve stereotaksik enjeksiyon, uygun şekilde yapılırsa 20 ila 30 dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, nöronal bağlantıları ve nöral etiketlemenin ayrıntılı yapısını canlandırmak için yüksek moleküler ağırlıklı BDA'nın nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.