bir
26 Temmuz 2017
Burada, organizmanın iyi beslenmiş bir beslenme durumundan aç kalmış beslenme durumuna geçmesiyle bakırdan kaçınma davranışındaki ve ortak bir besin kaynağını bulma yeteneğini değerlendirmek için tasarlanmış Caenorhabditis elegans spesifik bir analiz sunuyoruz.
Bu besin durumu temelli bakır çekimsizliği analizini genel hedefi, dört saatlik bir süre boyunca kimyasal bir uyarana ve besin kaynağına karşı nematodların tepkisini değerlendirmektir. Bu, besin durumunun eşzamanlı değerlendirmesini sağlar. Bu yöntem, davranışsal sinirbilim alanını, yıldız şartlarına rağmen lokomotor düzenleri ve çekimsiz kimyasallara tepki düzenini modüle etmeyen mutantları tanımlayarak destekleyebilir.
Bu tekniğin ana avantajı, uzun bir süre boyunca gerçekleştirilebilmesidir, bu da solucanların dört saat boyunca giderek daha fazla aç kalması üzerinden besin durumunun analizini sağlar. Deney organizmalarını analiz için hazırlamak için, deney başlamadan 24 saat önce, her akış başına 10 L4 evresinde nematod seçin, böylece test edilen organizmaların genç yetişkin olduğuna emin olun. Test edilen her mutant veya kontrol nematodu için, 10 L4 seçin.
L4 organizmaları, standart agar plakalar üzerinde standart OP50 E.Coli ile ekimlenerek, 24 saat boyunca standart yöntemlerle sürdürün. Deneyden 24 saat önce, bir kalem ve kalın kalıcı bir kalem kullanarak, önceden hazırlanmış bir nematod büyüme ortamı veya NGM plakasının alt tarafına, plakanın dış kenarı boyunca bir çizgi çizin. Plakanın her iki kenarından eşit uzaklıkta bir orta çizgi bariyeri işaretleyin.
Yalnızca bakır bariyerden bir tarafına 50 mikrolitre OP50 E.Coli ile plakayı ekin, tekdüze bir çimen oluşturmak için. Bakterilerin bakır çözeltisiyle temas etmeyeceğinden emin olmak için plakanın alt tarafındaki işaretli çizgileri kullanın. Bakır çözeltisinin plakanın kenarına hizalayacağından ve orta çizgi bariyeri oluşturacağından emin olun ve bakterileri, bakır çözeltisinin besin kaynağıyla temas etmemesi için taşıyın.
OP50 E.Coli olmayan ikinci bir dizi plakayı işaretleyin, negatif kontrol olarak hizmet edecek şekilde. Bakterilerin kurumasını bekleyin, ardından plakları gece boyunca 37 derece Celsius'ta inkübe edin. Bakteri lekelerini nematodları 37 derece Celsius'ta bir inkübatöre taşırken rahatsız etmedikleri konusunda emin olun.
Aşırı rahatsızlık, yiyecek lekesinin konumunu veya şeklini değiştirebilir. Bir gece inkübasyonun ardından, plakları inkübatörden çıkarın ve plakanın işaretli alt tarafını rehber olarak kullanarak, agarın kenarına 100 mikrolitre taze hazırlanmış 0,5 molar bakır(II)sülfat çözeltisi pipetleyin, dış bir bakır bariyeri oluşturmak için. Bakır(II)sülfat çözeltisinin bakteri lekesine temas etmediğinden emin olun ve bakır çözeltisini plakaya kurumasını bekleyin. Çözeltinin kuruluğunu her beş dakika bir, laboratuvar mendil ile hafifçe plakanın kenarına dağlayarak kontrol edin. Deneyden hemen önce, deney organizmalarını bakteri içermeyen bir agar plakasına aktarın ve solucanların fazla bakteriyi çıkarmak için bir dakika boyunca serbestçe hareket etmelerine izin verin.
Daha sonra, genç yetişkinlerin bulunduğu plakaya bir mililitre M9 pipetleyin, daha önce 24 saat önce transfer edilmiş olan solucanları mikrosantrifüj tüpüne yıkamak için. Nematodları bir dakika boyunca 3.000 x G'de santrifüj yapın. Solucanlar tüpün dibinde bir pelet oluşturmalıdır.
Solucan peletini rahatsız etmeden M9 çözeltisini emin olun. Solucan peletine bir mililitre M9 çözeltisi ekleyin. Solucanları çözeltiyle karıştırmak için tüpü ters çevirin.
İlk başta solucanlar ile fazla bakteri taşınmışsa, toplamda beş kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, 100 mikrolitre M9 çözeltisi ve solucan peleti kalana kadar süpernatanı emin olun. Yıkama işlemi tamamlandıktan hemen sonra, laboratuvar mendilindeki solucanları çözeltiden çıkarın.
Tübün dibinden 20 mikrolitre solucan peletini analiz plakasının bakteri içermeyen yarısına pipetleyin, 10 solucanın analiz plakasına transfer edildiğinden ve kirletici yiyeceklerin bulunmadığından emin olun. Bakır yiyecek yarış plakalarına bakteri aktarılmamalıdır. Nematodlardan fazla M9 çözeltisini laboratuvar mendilinde bir dakika içinde çıkarın.
M9 çözeltisini bakır(II)sülfat çözeltisiyle temas etmediğinden ve solucanların ve agar yüzeyinin bütün kaldığından emin olun. Laboratuvar mendilinde yanlışlıkla çıkarılan solucanları atın. M9 çözeltisi kaldırıldıktan ve tüm solucanlar sıvı olmayan lokomotor düzenlere başladıktan sonra, yani çekimsizlik göstermeyi bıraktıklarında.
Deney zamanlayıcısını başlatın, eğer yanlışlıkla fazla solucan dahil edilmişse, halokarbon yağı ile toplayarak onları çıkarın, plakaya bakteri eklememek için. Deney plaklarını her 30 dakika kontrol edin. Bakteri lekeli deney plaklarına sahip organizmaları, dört saatlik bir süre boyunca yiyecek lekesine ulaştıklarında pozitif olarak puanlayın.
Negatif kontrol plaklarına sahip organizmaları, bariyeri geçtiğinde pozitif olarak puanlayın. Çekimsizlik ve bakır çekimsizliğine karşı tepkileri değerlendirmek için N2 ve npr-9 işlev kaybı mutantını ve npr-9 aşırı ifadede bulunma suşunu, npr-9 kazanç işlevi olarak adlandırılanını kullandık. Deneyin sonunda, yabani tip organizmaların %100'ü yiyecek kaynağına yerleşmişken, npr-
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, Caenorhabditis elegans için özel olarak bakırdan kaçınma davranışını ve organizmanın tokluktan açlığa geçiş yaptığı dönemde besin kaynağının yerini değerlendirmek için bir analiz sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Davranışsal sinirbilim
- Nematod biyolojisi
Arka Plan
- Analizler, nematodların hoşnutsuz kimyasallara ve besin kaynaklarına verdikleri tepkileri değerlendirir.
- Dört saatlik bir süre boyunca davranışsal değişiklikleri değerlendirir.
- Bu yöntem, açlık altında lokomotor davranış kalıplarını ayarlamayan mutantları tanımlar.
- Kurtlar giderek açlıklı hale geldikçe besin durumunun analizini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- C. elegans'ta bakırdan kaçınma davranışındaki değişiklikleri değerlendirmek.
- Farklı besin durumlarında besin kaynaklarını bulma yetisini değerlendirmek.
- Açlık koşullarındaki davranışsal tepkelere yönelik anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Dört saatlik bir süre boyunca yapılan analiz.
- Testler için L4 evresindeki nematodların kullanımı.
- Besin durumu ve davranışın eş zamanlı değerlendirilmesi.
- Deneyler için her akımda 10 L4 evresindeki nematod seçimi.
Ana Sonuçlar
- Bakırdan kaçınma tepkisine yanıt olarak davranışsal değişikliklerin tanımlanması.
- Nematodların açlıkta bile besin kaynaklarını bulma yetisinin gösterilmesi.
- Davranışsal sinirbilim araştırmalarında analiz kullanımının etkinliğinin vurgulanması.
- Analizin kapsamlı analiz için zaman içerisinde uzatılabilirliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Analizin C. elegans'ta davranışsal tepkileri incelemek için değerli bir araç olduğu.
- Altere olmuş hoşnutsuz tepkilere sahip mutantların tanımlanmasına yardımcı olur.
- Bu yöntem, besin durumunun davranış üzerindeki etkilerini anlamamızı geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This assay enables behavioral neuroscience researchers to evaluate how nutritional status modulates aversive responses in a genetically tractable model. By tracking copper aversion and food-seeking behavior over time, it supports mechanistic de-risking of targets involved in sensory integration and feeding regulation. The method provides predictive confidence for target validation in pathways linking metabolic state to behavioral output.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses about how nutritional status gates aversive chemical responses.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring locomotory pattern modulation in response to combined sensory cues.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying mutants that fail to integrate starvation signals with aversion behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening of compounds affecting sensory integration.
- Operational Value: Standardizes quantitative behavioral readouts over extended time courses to improve assay reproducibility.
- Scalability: Permits increased sample size for simultaneous evaluation of large populations, enhancing screening throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage behavioral phenotypes to preclinical models of feeding regulation and sensory processing.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing whether targets affect adaptive behavior under changing metabolic conditions.
- Mechanistic De-risking: Focuses on targets that modulate behavioral flexibility rather than static aversion or attraction.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for pathways linking nutritional state to behavioral output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how metabolic cues modulate aversive responses in neural circuits.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible quantification of barrier-crossing behavior over four hours.
- Analytics: Generates time-dependent behavioral measurements that enable comparison of genetic or pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling how nutritional status affects decision-making in simple nervous systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple targets in sensory integration and feeding behavior pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by revealing dynamic behavioral responses to combined aversive and appetitive cues.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through timed scoring and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose modulation fails to adapt behavior under metabolic stress.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by distinguishing between static sensory defects and dynamic integration deficits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode handling, behavioral observation, and timed assay execution.
- Depends on standardized agar plates, copper sulfate solution preparation, and bacterial lawn control.
- Necessitates cross-team standardization of scoring criteria for food-patch arrival and barrier-crossing events.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different genetic backgrounds or environmental stressors.
- Includes practical limitations such as avoiding physical disruption of copper barriers during worm transfers and maintaining consistent incubation conditions.
