bir

Bu beslenme durumuna dayalı bakır kaçınma testinin genel amacı, dört saatlik bir süre boyunca caydırıcı bir kimyasala ve bir besin kaynağına yanıt veren nematodu değerlendirmektir. Bu, beslenme durumunun eş zamanlı olarak değerlendirilmesine izin verir. Bu yöntem, açlık koşullarına rağmen lokomotor kalıpları modüle edemeyen ve caydırıcı bir kimyasala yanıt vermeyen mutantları tanımlayarak davranışsal sinirbilim alanına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, uzun bir süre boyunca gerçekleştirilebilmesidir, bu da solucanlar dört saat içinde giderek daha fazla aç kaldıkça beslenme durumu analizine izin verir. Deney organizmalarını tahlil için hazırlamak için, organizmaların test edildiğinde genç yetişkinler olduğundan emin olmak için teste başlamadan 24 saat önce akış başına 10 L4 aşama nematodu seçin. Test edilen her mutant veya kontrol nematodu için 10 L4 seçin.

OP50 E.Coli ile tohumlanmış standart agar plakalarında 24 saat boyunca standart yöntemler kullanarak L4 organizmalarını koruyun. Testten 24 saat önce, önceden hazırlanmış bir nematod büyüme ortamının veya dış kenar boyunca NGM plakasının alt tarafına bir çizgi çizmek için bir cetvel ve kalın bir kalıcı işaretleyici kullanın. Plakanın her bir kenarından eşit uzaklıkta bir orta hat bariyeri işaretleyin.

Düzgün bir çim oluşturmak için plakayı bakır bariyerin sadece bir tarafına 50 mikrolitre OP50 E.Coli ile tohumlayın. Bakterilerin bakır solüsyonla temas etmemesini sağlamak için plakanın alt tarafındaki işaretli çizgileri kullanın. Bakır çözeltisinin plakanın kenarını kaplayacağından ve bir orta hat bariyeri oluşturacağından ve bakterileri, bakır çözeltisinin gıda kaynağıyla temas etmeyeceği şekilde aktardığından emin olun.

Negatif kontrol görevi görmesi için OP50 E.Coli içermeyen ikinci bir plaka setini işaretleyin. Bakterilerin kurumasını bekleyin, ardından plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Nematodları 37 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarırken bakteri lekelerinin bozulmadığından emin olun.

Aşırı rahatsızlık, yiyecek yamasının yerini veya şeklini değiştirebilir. Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve plakanın işaretli alt tarafını kılavuz olarak kullanarak, bir dış bakır bariyer oluşturmak için agarın kenarına 100 mikrolitre taze hazırlanmış 0.5 molar bakır (II) sülfat çözeltisi pipetleyin. Bir orta hat bariyeri oluşturmak için 25 mikrolitre bakır(II) sülfat solüsyonu pipetleyin.

Bakır (II) sülfat çözeltisinin bakteri yaması ile temas etmediğinden emin olun ve bakır çözeltisinin plaka üzerinde kurumasına izin verin. Transferden sonra her beş dakikada bir, ayırt etmek için çözeltiyi plakanın kenarına yakın bir yere hafifçe vurarak bir laboratuvar dokusuyla kuruluğu kontrol edin. Tahlilden hemen önce, deney organizmalarını bakteri içermeyen bir agar plakasına aktarın ve fazla bakterileri uzaklaştırmak için nematodların bir dakika boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.

Daha sonra, solucanları bir mikrosantrifüj tüpüne yıkamak için 24 saat önce transfer edilen genç yetişkinlerle birlikte tabağa bir mililitre M9 pipetleyin. Nematodları bir dakika boyunca 3.000 x G'de santrifüjleyin. Solucanlar tüpün dibinde bir pelet oluşturmalıdır.

Solucan peletini bozmadan M9 solüsyonunu aspire edin. Solucan peletine bir mililitre M9 çözeltisi ekleyin. Solucanları çözelti ile karıştırmak için tüpü ters çevirin.

Fazla bakteri başlangıçta solucanlarla birlikte aktarıldıysa, toplam beş kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, süpernatanı 100 mikrolitre M9 çözeltisi ve solucan peleti kalana kadar aspire edin. Yıkanmalar tamamlandıktan sonra solucanları hemen çözeltiden aktarın.

Tüpün altından 20 mikrolitre solucan peletini tahlil plakasının bakteri içermeyen yarısına pipetleyin, 10 solucanın tahlil plakasına aktarıldığından ve kontamine edici yiyecek bulunmadığından emin olun. Bakır gıda yarış plakalarına hiçbir bakteri aktarılmamalıdır. Fazla M9 çözeltisini nematodlardan bir dakika içinde bir laboratuvar dokusu ile çıkarın.

M9 çözeltisinin bakır(II) sülfat çözeltisiyle temas etmediğinden ve solucanların ve agar yüzeyinin sağlam kaldığından emin olun. Laboratuvar dokusu ile yanlışlıkla çıkarılan solucanları atın. M9 çözeltisi çıkarıldıktan ve tüm solucanlar sıvı olmayan lokomotor modellere başladıktan sonra, yani parçalanmayı bıraktıklarında.

Tahlil kronometresini başlatın, yanlışlıkla fazladan solucanlar dahil edilmişse, plakaya bakteri eklenmediğinden emin olmak için halokarbon yağı ile toplayarak bunları çıkarın. Test plakalarını her 30 dakikada bir kontrol edin. Bakteri yamaları olan tahlil plakaları için, dört saatlik bir süre içinde gıda yamasına ulaşırlarsa organizmaları pozitif olarak puanlayın.

Negatif kontrol plakaları için, bariyeri geçtiklerinde organizmaları pozitif olarak puanlayın. Açlık ve bakır isteksizliğine verilen yanıtları değerlendirmek için N2 ve npr-9 fonksiyon kaybı mutantı ve npr-9 bir fonksiyon kazancı olarak adlandırılan bir npr-9 aşırı ekspresyon suşu kullandık. Testin sonunda, yabani tip organizmaların %100'ü besin kaynağına taşınırken, npr-9 aşırı ekspresyon organizmaları, gıdaya yanıt olarak lokomotor kalıpları modüle etmedi ve gıda kaynağıyla temas ettikten sonra bile caydırıcı bariyeri geçmeye devam etti.

Yiyecek içermeyen bir tabakta, n2 veya npr9 fonksiyon kaybı organizmaları nadiren bakır bariyerini geçerken, npr-9 aşırı ekspresyon nematodları tekrar tekrar bariyeri ileri geri geçer. Bu prosedürü denerken, nematodları ve M9'u aktarırken bakır bariyerini bozmaktan kaçınmayı ve ayrıca karıştırıcı faktörlerden kaçınmak için her suş için tutarlı koşulları korumayı unutmamak önemlidir.