En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

Bu deneyin genel amacı, transpozon aracılı rastgele yerleştirme, rekabet deneyleri ve tüm genom dizilimi kullanarak herhangi bir DNA elementinin optimal kromozomal konumunu belirlemektir. Bu yöntem, bir genetik elementin kromozomal konumunun önemi gibi DNA replikasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, büyüme avantajı ile en uygun klonun seçimi ile çiftlerin transpozon tabanlı rastgele yerleştirme olmasıdır.

Burada, E.coli DARS2 bölgesi tarafından basitleştirilmiştir. Bu yöntem Escherichia coli'nin kromozomal organizasyonu hakkında fikir verebilse de, diğer bakterilere de uygulanabilir. Metin protokolüne göre MG1655 delta DARS2 gibi elektrokompatan hücreleri hazırladıktan sonra, 40 mikrolitre hücreye bir mikrogram pNKBOR DARS2 ekleyin ve karışımı önceden soğutulmuş steril 0.2 santimetre aralıklı bir küvete aktarın.

Küveti elektroporasyon odasına yerleştirin. Daha sonra, hücreleri 18 kilovolt, 500 ohm ve 25 mikrofarad'da elektropore edin. Zaman sabiti yaklaşık beş milisaniye olmalı ve ark oluşmamalıdır.

Bakteri süspansiyonunu bir mililitre önceden ısıtılmış LB suyunda yeniden süspanse ederek hızlı bir şekilde geri kazanın ve 15 mililitrelik bir test tüpüne aktarın. Hücreleri, antibiyotik seçimi olmadan 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede havalandırılmış büyüme koşulları altında inkübe edin. Daha sonra, bakterileri mililitre başına 50 mikrogram kanamisin ile takviye edilmiş LB agar plakalarına yerleştirin ve plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, elektroporasyondan kolonileri sayın. Bir koloni, bir kromozomal transpozon yerleştirilmesine eşit kabul edilir. Her tabağa bir mililitre LB suyu ekleyin ve tüm kolonileri yıkayın.

Bakteri konsantrasyonunu artırmak için aynı bir mililitre LB suyunu tekrar kullanın. Ardından, tüm kolonileri aynı 50 mililitrelik tüpte toplayın. Başlangıç malzemesini dondurmak için tüpü girdaplayın ve bir mililitre hücre süspansiyonunu bir mililitre %50 gliserol ile buz üzerinde karıştırın.

Tüpleri 10 dakika kuru buza aktarın. Kültürler dondurulduktan sonra, onları eksi 80 derecelik bir dondurucuya aktarın. Transpozon kütüphanesini buz üzerinde eksi 80 santigrat dereceden çözün.

Pipetleme ile karıştırın, ardından 100 mikrolitre transpozon kitaplığını 15 mililitrelik bir test tüpünde 10 mililitre LB'ye aktarın. Hücreleri sekiz saat boyunca 37 santigrat derecede sürekli çalkalayarak sabit faza kadar büyütün. Parametreleri istediğiniz gibi farklı büyüme koşullarına ayarlayın.

Bakteri popülasyonunu yaklaşık olarak her 10 nesilde bir çoğaltmak için, daha önce sabit olan fazın 10 mikrolitresini 10 mililitre taze önceden ısıtılmış ortama aktarın ve kültürü sekiz saat daha sabit faza kadar büyütün. Her 100 nesil rekabetten sonra, beş adet bir mililitrelik numuneyi kaydedin ve bunları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Burada listelendiği gibi belirli primerleri kullanarak PCR amplifikasyonu ile NZBOR'un bir kilobaytlık bir bölümüne karşı Güney lekesi için probu hazırlayın.

Aşağıdaki programı kullanarak örnekleri çalıştırın. Smith'e göre rastgele primer sistemini kullanarak elde edilen PCR fragmanını P32 etiketli dATP ile etiketleyin ve metin protokolüne göre toplam hücresel DNA'yı hazırlayın. Probun kapsadığı bir bölgenin dışında ilgilenilen bölgeyi içeren NAKBOR'u kesen Pvul ile toplam hücresel DNA'yı sindirin.

Loebner-Olsen ve von Freiesleben'e göre% 0.7 agaroz jeli kullanarak bir Güney lekesi yapın. Tek klonlardan DARS2 yerleştirme bölgelerini tanımlamak için kolay gen yürüyüşünü kullanmak için, tahmini 700 nesil rekabetten sonra, önce bakterileri bir LB agar plakasına yayarak ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe ederek PCR şablonu için genomik DNA'yı izole edin. LB suyunu tek kolonilerle aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün.

Daha sonra 20 mikrolitreyi 200 mikrolitre otoklavlanmış damıtılmış suya aktarın. Kolonileri çözeltiye girdaplayın, ardından karışımı 100 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Numuneleri beş dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin, ardından hücre lizatını ileride kullanmak üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Ardından, burada gösterildiği gibi tercih edilen transpozon içinde tavlamak için iç içe geçmiş üç astar tasarlayın. 20 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu hazırlamak için 200 nanogram genomik DNA, iç içe geçmiş bir primer ve rastgele bir primer kullanın. Ardından, aşağıdaki programı kullanarak örnekleri çalıştırın.

İkinci amplifikasyon için, şablon olarak ilk reaksiyonun bir mikrolitresini kullanın ve iç içe geçmiş primer iki ve aynı rastgele primer kullanın. İç içe geçmiş astar üç, aynı rastgele astar ve şablonla birlikte ikinci reaksiyondan bir mikrolitre kullanarak benzer şekilde üçüncü bir reaksiyon gerçekleştirin. Ürünleri, son PCR reaksiyonundan itibaren %1.5'lik bir agaroz jel ve etidyum bromür içeren statin üzerinde çalıştırın.

100 ila 800 baz çifti aralığında bir bant kesin ve üreticinin talimatlarına göre herhangi bir ticari DNA jel çıkarma kitini kullanarak DNA'yı izole edin. Akış sitometrisini gerçekleştirmek için, her bakteri kültürünü en az 10 nesil boyunca üstel büyüme aşamasında tutarak dengeleyin. OD600'ü ölçün ve asla 0.3'ü geçmediğinden emin olun.

Metin protokolüne göre rifampisin salgısını gerçekleştirmek için, bir mililitre kültürü 30 mikrolitre RIF-CEF içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü en az dört saat çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. EXP numunesi için, bir mililitre üstel olarak büyüyen kültürü buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, hücreleri beş dakika boyunca 15.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile hasat edin. Peletleri 100 mikrolitre buz gibi soğuk 10 milimolar tris pH 7.5'te tekrar süspanse edin ve bir mililitre buz gibi soğuk %77 etanol ekleyin. Numuneleri kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın.

15 dakika boyunca 15.000 kez G'de santrifüjleme ile 100 ila 300 mikrolitre sabit hücre hasat ederek hücreleri boyayın. Süpernatanı çıkarın ve peleti yeniden süspanse etmek için 130 mikrolitre DNA boyama solüsyonu kullanın. Daha sonra numuneleri buz üzerinde ve karanlıkta 10 dakika inkübe edin.

Son olarak, hücre başına kökeni, bağıl hücre kütlesini ve bağıl DNA içeriğini belirlemek için akış sitometrisi kullanın. DNA'nın ilk transpozon havuzundan ekstraksiyonunu ve 700 yarışma neslinin her tahmini 100'ünde bir takiben, DNA, prob tarafından kapsanmayan bir bölgede transpozon NKBOR DARS2'yi bir kez kestiği bilinen Pvul ile kesildi ve bir Southern lekesi yapıldı. Burada gösterildiği gibi, ilk DARS2 havuzu, DARS2'nin kromozom boyunca rastgele yerleştirildiğini gösteren farklı bantlardan yoksundu.

Zamanla, ilk büyük DARS2 klon havuzunun yalnızca bir veya birkaç kalıcı DARS2 klonuna dönüştüğü bir model ortaya çıktı. Başlangıç havuzundan DARS2 yerleştirme bölgelerini tanımlamak için tüm genom dizilimi kullanıldı. Ve 400, 500 ve 700 nesil rekabetten sonra, temsili bir yerleştirme dizisi alt kümesinde, tüm DARS2 eklemelerinin% 98'i, vahşi tip DARS2 kromozomal konumuna yakın bulundu.

Ve% 2'si kromozomun başka bir yerinde bulundu. DARS2 eksikliği olan hücrelerin daha önce bir senkronizasyonda replikasyonu başlattığı ve vahşi tip hücrelere göre orijin konsantrasyonunda bir azalmaya sahip olduğu gösterilmişti. Burada, terminalde bir DARS2 elemanının varlığı, senkronizasyonu veya hücresel kaynak içeriğini vahşi tip seviyelere geri yüklemezken, seçilen DARS2 klonları IR ve RPPH senkronize olarak replikasyonu başlatır.

Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir DNA elementinin optimal kromozomal pozisyonunu nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu, transpozon tabanlı rastgele eklemeler, ardından rekabet deneyleri ve son olarak tüm genom dizilimi ile yapılır.