Name: Membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Öğrenin, eksojen antijenlerin çapraz-sunumda endoplazmik retikulum ilişkili bozulması için membran yuvası arıtma yöntemini. Bu teknik, immünoloji araştırmalarında T hücre aktivasyonu mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Takasaki Üniversitesi Sağlık ve refah tarafından desteklenir.

1. büyüyen hücreler ve ayrıca eksojen antijenleri bir biotin proteinli etiketleme kullanarak <ol><li>hazırla bOVA kit üretici takip &#39; s protokolü. 
	Not: Normalde, ortalama 1 M OVA başına 2 M biotin bOVA içerir.</li>
	<li>RPMI-1640 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate, 0,1 mM gerekli olmayan amino asitler, 100 U/mL penisilin-streptomisin, 55 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) ve 5'te 37 ° C'de % 10 fetal buzağı serum (bundan sonra RPMI) ile takıma hücrelerde DC2.4 büyümek % CO 2 oksijen kuluçka (bundan sonra söz, hücreleri bu durum inkübe). DMEM % 10 fetal buzağı serum, 3.7 g/L NaHCO 3 (bundan sonra DMEM) yerine RPMI ile takıma kullanmak mümkündür.</li>
	<li>Bir gün önce arıtma, 1 x 10 5 hücre/ml bir doku kültürü plaka RPMI hücreleri bölün. Konfluent State hücreleri tutarak kaçının. DC2.4 hücreleri son derece eksojen antijenleri yarı Konfluent devlet kadar dahil ama hızla bir aşırı birleşmesi durumunda ulaştıktan sonra yeteneği kaybetmek.</li>
	<li>Daha önce DC2.4 hücreleri yarı Konfluent, 250 µg/mL 1 x 10 6 hücre/mL için bOVA ekleyin ve 2-4 h için kuluçkaya 
	Not: aşağı akım deneyler sırasında tüm arabellekleri ve Kimyasalları 4 ° C'de aksi belirtilmediği sürece tutulur.</li>
</ol> 2. Microsomes hazırlanması <ol><li>DC2.4 hücreler yumuşak doku tabaktan bir yeni 50 mL konik tüp içine pipetting tarafından hasat.</li>
	<li>5 dk, 4 ° C için 1000 x g, santrifüj ve bOVA ile orta aspirasyon tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>DC2.4 hücrelerle iki kez PBS arabelleği (1.37 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4, 2.68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) tarafından Santrifüjü 1000 x g 5 min, 4 ° C için de 40 mL yıkayın ve süpernatant aspirasyon her zaman atın.</li>
	Homojenizasyon orta (0.25 M Sükroz, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) ile 1/1000 hacmi proteaz inhibitörü kokteyller ve transfer resuspended DC2.4 <li>resuspend Pelet adım 2.3 içinde 1 - 2 mL (1/20-1/10 cilt kültür ortamının) hücreleri içine bir buz gibi Dounce homogenizer.</li>
	<li>Bozmaya resuspended DC2.4 hücreleri nazikçe tarafından 10-20 vuruş ile buz gibi Dounce homogenizer. 
	Not: buz üzerinde Dounce homogenizer bozulma adımı sırasında soğutmalı</li>
	<li>Yeni bir 15 mL konik tüp hücre kesintiye süspansiyon transfer.</li>
	<li>10 mL toplam 8-9 mL homojenizasyon orta ekleyin ve konik tüp 2000 g x ve 4 10 dk santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>Süpernatant kırılmamış hücreleri ve hücre çekirdeği kaldırmak için bir yeni 15 mL konik tüp aktarmak ve konik tüp 10 min 2.000 g x ve 4 için tekrar santrifüj kapasitesi ° C.</li>
	<li>İçine a yeni ultrasantrifüj tüp ve 100.000 g x ve 4 45 dk santrifüj süpernatant transfer ° C.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve yukarı ve aşağı microsome kesir aşağı akım deneyler için yapmak için birkaç kez çözüm pipetting tarafından dikkatle içinde homojenizasyon orta 1-2 mL 1/1000 birim proteaz inhibitörü kokteyller ile Pelet resuspend.</li>
	<li>Transfer microsome kesir bir yeni 5 mL yuvarlak alt tüpüne. 
	Not: bu adımdan sonra iodixanol yoğunluk gradient Santrifüjü üreticiye göre tarafından objektif microsomes zenginleştirmek mümkün &#39; s protokolü, non-spesifik microsomes kaldırmak için. Tepe fraksiyonları eksojen antijenleri için toplanan ve sonra arıtma (Adım 3) sonraki adıma tabi.</li>
</ol> 3. Microsomes arıtma bOVA ile geçiren ERAD <ol><li>Ekle 1/100 birim taze SA-manyetik boncuklar 5 mL. adımda 2.11 microsome kısmını yuvarlak alt tüp. 
	Not: bu adımdan önce microsome kesir contaminations belirsiz microsomes azaltmak için denetim manyetik boncuklar tarafından önceden temizlemek mümkün mü.</li>
	<li>Hafifçe karıştırın ve yavaş yavaş 30 dk için yuvarlak alt tüp 4'te döndürmek ° C.</li>
	<li>2-3 mL homojenizasyon orta 4 mL toplam yuvarlak alt tüp içine ekleyin ve hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Yuvarlak alt tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya Veziküller için bağlı boncuk mıknatıs için ilgi vardır beri kahverengi mikro-boncuk mıknatıs için en yakın tüp duvar için yavaş yavaş birikir.</li>
	<li>Tüp ile dikkatli aspirasyon tarafından ilişkisiz veziküller kaldırmak için supernatants atmak kalan manyetik tribünde.</li>
	<li>Yıkama manyetik boncuklar veziküller homojenizasyon orta 5 mL ile iki kez için manyetik tarafından bağlı 4 ° C'de 10 dakika stand ve süpernatant her zaman dikkatli aspirasyon tarafından atın. 
	Not: Manyetik stand, arıtma centrifugations 10 dk, 2.000 x g de tarafından olmadan 4 ° C de mevcuttur.</li>
	<li>Manyetik boncuklar bağlı veziküller dikkatle içinde 100 µL homojenizasyon çevre için yukarı ve aşağı birkaç kez çözüm pipetting resuspend.</li>
	<li>Aşağı akım deneyler için saf microsome olarak yeni bir microtube resuspended veziküller transfer. 
	Not: Genellikle, 5-20 µg proteinler 1 x 10 7 hücreleri içeren 50 µL microsome kesir ayrılmış olabilir.</li>
</ol> 4. Saf Microsomes analizini veziküller bağlı <ol><li>Resuspend manyetik boncuklar adım 3.8 TNE arabellek 100-200 µL tarafından (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, %1 Nonidet P-40) 1/1000 birim proteaz inhibitörü kokteyller ile homojenizasyon orta yerine.</li>
	<li>Lysate 4.1 adımından yeni bir 1.5 mL microtube transfer.</li>
	<li>Üretici başına BCA tahlil kit kullanarak adım 4.2 protein konsantrasyonu belirlemek &#39; s protokolü. 
	Not: Genellikle 5-10 µL 4.2 adımından lysate protein konsantrasyonu belirlemek için yeterlidir.</li>
	<li>Lysate adım 4.2 (2 µg gümüş boyama için protein ve protein Western Blot için 10 µg) yeni mikrotüpler transfer.</li>
	<li>1 SDS jel-yükleme arabellek x 95 ° C ve kaynatın proteinleri ısı bloğunda mikrotüpler koymak (100 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM dithiothreitol, % 4 SDS, %0,2 bromophenol mavi, % 20 gliserol) 5 dakika süreyle</li>
	<li>Mikrotüpler 21,500 g x ve 4 10 dk santrifüj kapasitesi ° C. toplamak supernatants yeni mikrotüpler çözünmez kesirler kaldırmak için.</li>
	<li>Adım 4.6 (2 µg) standart SD-sayfa tarafından çözümlenen proteinleri analiz.</li>
	<li>Protein bantları gümüş boyama kullanarak boyama gümüş tarafından kit üreticinin görselleştir &#39; s protokolü.</li>
	<li>Adım 4.6 (10 µg) standart SD-sayfa ve Western Blot tarafından çözümlenen proteinleri analiz. Üreticinin reaktif (SA-HRP) kullanmak &#39; s protokol ve fluorography tarafından görselleştirmek.</li>
</ol> 5. Vitro Sulandırma bOVA kullanarak saf Microsomes ERAD Ubiquitination <ol><li>Transfer saf microsomes (5-10 µg protein) adım 3.8 Retikülosit lysate (RL), % 50 hacmi ile reaksiyon arabellek (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl x 1 2) ve 0 pM 2 bayrak öğesini Ubikuitin yeni bir microtube içinde. 20-40 µL bu deneyin son birimdir.</li>
	<li>Incubate microtube 2 h 37 ° c 
	Not: ubiquitinated bOVA 5.12 adımda miktarı Western Blot tarafından tespit etmek için çok küçük ise, MG132 10 µM veya lactacystin proteasomes tarafından ubiquitinated bOVA işlenmesini engellemek için 2 µM ekleyin.</li>
	<li>Buz üzerinde microtube yerleştirerek reaksiyonu durdurmak</li>
	<li>Microsomes 500 µL TNE arabellek proteaz inhibitörü kokteyller hacmi 1/1.000 ile ekleyerek çözümlemek.</li>
	<li>Microtube 21,50, 10 dk santrifüj kapasitesig ve 4 x 0 ° c ubiquitinated bOVA DC2.4 in vitro ubiquitination tahlil önce içeren çözünmez kesirler kaldırmak için yeni bir microtube içine supernatants toplamak.</li>
	<li>Süpernatant için yeni bir microtube transfer ve yeni SA-manyetik boncuklar (genellikle 5 µL supernatants 500 µL için) 1/100 birim ekleme.</li>
	<li>Hafifçe karıştırın ve 4'te microtube 30 dk için yavaş yavaş döndürmek ° C.</li>
	<li>Microtube 21,500 g x ve 4 10 dk santrifüj kapasitesi ° C. atma süpernatant bOVA ve ubiquitinated bOVA kurtarmak için aspirasyon tarafından bağlı SA-manyetik boncuklar ile.</li>
	<li>21,500 g x ve 4 10 dk aralıklarla tarafından iki kez toplanan SA-manyetik boncuklar TNE arabelleği 1 mL ile yıkayın ° C. atma süpernatant her zaman aspirasyon.</li>
	<li>Arabellek arıtılmış proteinler tarafından SA-manyetik boncuklar gidermek için bir ısı blokta 95 ° C'de 5 min için yükleme SDS jel x 1 SA-manyetik boncuklar kaynatın.</li>
	<li>Microtube 21,500 g x ve 4 10 dk santrifüj kapasitesi ° C. çözünmez kesirler kaldırmak için yeni bir microtube supernatants toplamak.</li>
	<li>Standart SD-sayfa ve Western Blot proteinler için bağlı SA-manyetik boncuklar analiz. Antikorlar (Anti-bayrak, anti-multi-Ub ve anti-fare IgG-HRP) ve reaktif (SA-HRP) üreticisidir &#39; s Protokolü ve fluorography tarafından görüntülenmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Providing+ligands+for+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Providing ligands for MHC class I molecules.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).</li>
<li>Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+C+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).</li>
<li>McDevitt, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+the+role+of+the+major+histocompatibility+complex+in+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response.</a> Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).</li>
<li>Bedoui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+viral+and+self+antigens+by+skin-derived+CD103%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells.</a> Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).</li>
<li>Segura, E., Villadangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by dendritic cells in vivo.</a> Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).</li>
<li>Cheong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+stimulation+fully+differentiates+monocytes+to+DC-SIGN%2FCD209%28%2B%29+dendritic+cells+for+immune+T+cell+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas.</a> Cell. 143 (3), 416-429 (2010).</li>
<li>Henri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).</li>
<li>Shortman, K., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD8%2B+dendritic+cell+subset%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The CD8+ dendritic cell subset.</a> Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).</li>
<li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation%3A+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li>
<li>Nair-Gupta, P., Blander, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+view+of+the+intracellular+mechanisms+regulating+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation.</a> Front Immunol. , (2013).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Kurts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).</li>
<li>Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cross-presentation+of+exogenous+self-antigens+leads+to+deletion+of+autoreactive+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells.</a> J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).</li>
<li>Bonifaz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+protein+antigen+to+the+dendritic+cell+receptor+DEC-205+in+the+steady+state+leads+to+antigen+presentation+on+major+histocompatibility+complex+class+I+products+and+peripheral+CD8%2B+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance.</a> J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).</li>
<li>Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+in+viral+immunity+and+self-tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance.</a> Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).</li>
<li>Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+antigens+are+processed+through+the+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+%28ERAD%29+in+cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells.</a> Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).</li>
<li>Houde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+are+competent+organelles+for+antigen+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation.</a> Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).</li>
<li>Guermonprez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-phagosome+fusion+defines+an+MHC+class+I+cross-presentation+compartment+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells.</a> Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).</li>
<li>Lizée, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+cell+cross-presentation+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+cytoplasmic+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain.</a> Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).</li>
<li>Basha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD74-dependent+MHC+class+I+endolysosomal+cross-presentation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway.</a> Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).</li>
<li>Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity%2C+contradictions%2C+and+conundrums%3A+studying+post-proteasomal+proteolysis+in+HLA+class+I+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation.</a> Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).</li>
<li>Wiertz, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec61-mediated+transfer+of+a+membrane+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+proteasome+for+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction.</a> Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).</li>
<li>Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+degradation+in+protein+quality+control+and+cellular+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).</li>
<li>Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-translocation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum+into+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).</li>
<li>Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+targeting+and+translocation+of+proteins+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).</li>
<li>Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein homeostasis.</a> IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).</li>
<li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li>
<li>Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+subcellular+compartment+in+which+exogenous+antigens+undergo+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+from+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells.</a> Heliyon. , (2016).</li>
<li>Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phagosome-to-cytosol+pathway+for+exogenous+antigens+presented+on+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules.</a> Science. 267 (5195), 243-246 (1995).</li>
<li>Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761306004262">A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells.</a> Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).</li>
<li>Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li>
<li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li>
<li>Zehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translocon+protein+Sec61+mediates+antigen+transport+from+endosomes+in+the+cytosol+for+cross-presentation+to+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells.</a> Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CP önceki çalışmalarda, immünfloresan mikroskobu16,30,31,32tarafından geç endosome veya ER kısıtlı alana eklenen eksojen antijenleri birikmiş. Hücresel yuvası Sükroz veya iodixanol yoğunluk gradient Santrifüjü kullanarak tanımlandığı gibi bu ERAD benzeri taşıma ve işleme eksojen antijenleri ER veya geç endosome, bu özel alanlarda yapılmaktadır olduğunu tahmin edilmektedir ubiquitinated bOVA ERA...

MHC ı molekülleri ile kısa antijenik peptidler sitozol1Ubikuitin-proteasome sistemi tarafından işlenen endojen antijenleri türetilen tüm çekirdekli hücrelerin yüzeyinde ifade. İşlendikten sonra antijenik peptidler endoplazmik retikulum (ER) Lümen DOKUNUN peptid taşıyıcı tarafından taşınmaktadır. ER Lümen peptid yükleme ve doğru katlanır MHC ben karmaşık bir dizi belirli chaperones yardım. Molekülleri bu dizi acil servis merkezi a bölme için yükleme MHC ben2peptid olduğunu belirten peptid-yükleme karmaşık (PLC) denir. Yükleme, peptid MHC sonra ben moleküller hücre yüzeyine taşınır ve bir anahtar edinilmiş bağışıklık sistemi olarak kendini işaretleri ve etkinleştirir CD8+ sitotoksik T lenfositler (CTL) kanser hücreleri veya enfeksiyöz ajanlar algılamaya tarafından antijenik rolü peptidler olmayan kendine proteinler3.
Hücreleri (APC) sunulması antijen, eksojen antijenleri üzerinden antijenik peptidler de sunulan MHC ben esas olarak yapılan4,5,6,7,8 üzerinden CP, dışarı DCs9,10,11tarafından. CP esastır saf CD8+ T aktivasyonu için hem de hücreleri ve bellek CD8+ T hücreleri içine CTL'ler12,13Anti-bulaşıcı ve anti-tumoral ve immün tolerans bakım ihracı, kendi kendine oyunculuk saf T hücreleri14,15. CP moleküler mekanizmaları henüz ayrıntılı olarak tarif edilebilir ancak CP edinilmiş bağışıklık sisteminde birçok önemli rol oynar. Eksojen antijenleri ve acil servis ve endosome hem de lokalize ERAD, eksojen antijenleri ERAD benzeri işleme ve16 yükleme peptid acil servise endosome taşınmaktadır düşündüren tarafından işlenmiş olan CP önceki çalışmaların ortaya . Ancak, CP peptid yüklenmesini serviste değil ama da Ayrıca ER (şekil 1)17,18 farklı özelliklere sahip çok klasik olmayan endositik bölmeleri, gerçekleştirilir biriken kanıtlar gösteriyor ,19,20,21. Antijenik peptid öncüleri bozulma aminopeptidaz yüksek faaliyet tarafından önlemek için bu klasik olmayan endositik bölmeleri (şekil 1) proksimal bölgede22 sitozol, işleme ve peptid CP içinde yükleme oluşur. Endositik bu bölmeleri karakterizasyonu tartışmalı olmasına rağmen bu yerde eksojen antijenlere başka hiçbir varolan belirli moleküller vardır.
ERAD özellikle misfolded proteinler ER kaldırır hücresel bir yoludur. ERAD yolu misfolded proteinler retrogradely sitoplazma için ER membran aracılığıyla taşınır ve ubiquitin-proteasome sistemi23,24,25tarafından işlenen. Proteinler gibi büyük moleküllerin lipid bilayer ile taşınmaktadır zaman, bu moleküller Derlin ER26ve Tom karmaşık içinde karmaşık ve Tim ve Sec61 karmaşık gibi bir translocon kompleksi olarak adlandırılan bir moleküler aparatı ile başarılı mitokondri27. Ne zaman exogenously eklendi antijenleri ER membran taşınır, lipid bilayer ile translocons, Sec61 kompleksi gibi kompleks içinde nüfuz gerekir. Burada açıklanan yöntemi endositik salonlar için işaretleyici olarak bu zarı delici moleküller kullanarak hedeflenen vezikül saf.
Burada açıklanan yöntemi eksojen bir antijen DC benzeri hücre satırı DC2.428 ve biotinylated ovalbumin (bOVA) kullanarak yeni bir vezikül arıtma protokoldür. Endositik bölmeleri streptavidin (SA) tarafından saf-membran-Penetran bOVA bir üreticisi kullanarak manyetik boncuklar. Bu saf microsome, bazı exogenously bOVA hala membran kesirler korundu ama dışında microsome ve sonra ubiquitinated taşınan ve işlenen ekledi vitro29. Bu saf microsome ERAD ve karmaşık yükleme peptid için hem de ER yerleşik proteinler endositik yuvası özel proteinler yer alan; hücresel yuvası CP29potansiyel endositik yuvası olduğunu düşündüren. Bu iletişim kuralı eksojen antijenleri türüne bağlı değildir ve ayrıca diğer DC alt kümeleri ve DCs hassas moleküler mekanizması için yeterli CP netleştirmek için diğer hücre tipleri, endotel hücreleri, makrofajlar ve B hücreleri gibi için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>yaşam teknolojileri tarafından gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr>Yaşam teknolojileri tarafından sodyum<td>piruvat</td><td>gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler</td><td>yaşam teknolojileri tarafından gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HEPES yaşam teknolojileri tarafından gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr>Yaşam Teknolojileri tarafından <td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr>Yaşam Teknolojileri tarafından<td>L-glutamin</td><td>gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr>Yaşam Teknolojileri tarafından<td>Penisicillin-Sreptomisin</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr>Yaşam Teknolojileri tarafından<td>DMEM</td><td>gibco</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Biyotin-protein etiketleme kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F6347</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>laktacystin</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör</td><td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>proteaz inhibitörü kokteylleri</td><td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>iyodiksanol</td><td>Cosmo bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>SA-manyetik boncuklar</td><td>New England Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>kontrol manyetik boncuklar</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>manyetik stand</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein tahlil kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>gümüş boyama kitleri</td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Retikülosit Lizat</td><td>Promega</td><td></td><td></td>1730714</tr><tr><td>Bayrak etiketli ubikitin</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td></tr><tr><td>anti-ovalbümin (OVA, fare)</td> <td>Antikor Dükkanı</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>karınca-çoklu ubikitin (fare)</td> <td>MBL</td><td>D058 & eksi; </td><td></td>3</tr><tr><td>anti-Bayrak (fare)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>tripsin</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritik hücreler (DC) işleme ve MHC sınıf (MHC) üzerine içselleştirilmiş eksojen antijen sunan son derece yetenekli ben moleküller olarak da bilinen çapraz-sunum (CP). CP çalış önemli bir rol sadece saf CD8 uyarılması+ T hücreleri ve bellek CD8+ T hücreleri için bulaşıcı ve tümör bağışıklığı ama aynı zamanda kendiliğinden hareket inactivation saf T hücreleri tarafından T hücre anerji veya T hücre silme. Her ne kadar aydınlatılmamıştır için CP kritik moleküler mekanizması kalır, biriken kanıtlar eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulması ile (ERAD) klasik olmayan ihracat sonra endositik işlenir gösterir bölmeleri. Çünkü eksojen antijenlere başka hiçbir belirli moleküler işaretleri vardı yakın zamana kadar bu endositik bölmeleri karakterizasyonu sınırlıydı. Burada açıklanan endositik bu bölmeleri arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir. Bu saf microsome kullanarak, biz ERAD benzeri taşıma, ubiquitination ve eksojen antijen vitro, işlenmesi Ubikuitin-proteasome sistemi ihracat bundan sonra eksojen antijen işleme düşündüren yeniden düzenlendi hücresel bölme. Bu iletişim kuralı daha fazla CP moleküler mekanizması netleştirmek için diğer hücre tipleri için uygulanabilir.

CP moleküler mekanizması aydınlatmak için nerede eksojen antijenleri ERAD benzeri taşıma ve işleme tabi hücresel kompartmanlarda tanımlamak gereklidir. Gözlemler immünfloresan mikroskopi veya elektron mikroskobu nerede eksojen antijenleri16,17,18,19birikmiş hücresel yuvası tespit ederken, 30,...

Burada açıklanan nerede eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili düşmesine çapraz-sunum tarafından işlenen hücresel kompartmanlarda arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir.

Membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Bu deneyin genel amacı, çapraz sunumda ekzojen antijenlerin ERAD benzeri yıkımının gerçekleştirildiği membranöz kompartmanı saflaştırmaktır. Bu yöntem, çapraz sunumdaki hücresel kompartmanın veya ERAD benzeri yıkımın aydınlatılması gibi immünite dönemindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, saflaştırılmış veziküllerin tüm moleküler işlemleri içermesidir. Bu durum, tüm ekzojen antijenlerin ERAD benzeri yıkımına olanak tanır. Dolayısıyla bu yöntem, dendritik hücreler tarafından gerçekleştirilen çapraz sunuma dair içgörü sağlayabilir; ayrıca çapraz sunum yeteneği gösteren diğer antijen sunan hücre türlerine de uygulanabilir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, tüm non-spesifik arka planı dışlamak imkansız olduğu için zorluk yaşayacaklardır. Saflaştırmadan bir gün önce, DC2.4 hücrelerini RPMI tamponu içerisindeki bir doku kültür plağında mL başına 0,1 milyon hücre olacak şekilde ayırın. Ekzojen antijen inklüzyon olasılığını artırmak için hücrelerin konfluens durumuna gelmesinden kaçının. DC2.4 hücreleri yarı konfluens olmadan önce, ekzojen antijen olarak biyotinillenmiş ovalbumin veya bOVA ekleyin. Ardından, iki ila dört saat boyunca i

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Burada bir IS oluşumu sırasında B lenfositlerinde hücre kutuplaşma olaylarını karakterize etmek için iki yaklaşım açıklanmaktadır. İlk olarak, sinaptik membranda organel işe alma ve sitroiskelet yeniden düzenlemelerinin ölçülmesini içerir. İkinci bir biyokimyasal yaklaşım, sentez bileşiminde değişiklikleri karakterize etmek, hangi bağışıklık sinaps için polarizasyon uğrar.

Immün SYNAPSE oluşumu sırasında B hücrelerinde organelle dinamikleri eğitimi

Burada, tanımlanmış proteolipozomlarda tamamen saflaştırılmış bileşenlerle Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden uzlaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Bu protokol, son santrifüjleme adımında disakkarit trehalozu içeren geliştirilmiş bir SERCA saflaştırma yöntemini tanımlar. Bu karbonhidrat, zorlu koşullar altında proteinleri stabilize eder. Saflaştırılmış SERCA, katalitik olarak aktifti ve yüksek saflık sergiledi, bu da onu yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için uygun hale getirdi.

Sarko-Endoplazmik Retikulum Ca2+-ATPazın Tavşan Kasından Saflaştırılması

Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Hyperbranched poligliserol (HPG) ile kırmızı kan hücrelerinin hücre zarı modifikasyonu (eritrositler) sunulmuştur. Modifiye RBCs sulu iki faz bölümleme, osmotik frajilitesi ve kompleman aracılı lizis ile karakterize edildi. Yüzey proteinleri ve antijenlerin kamuflaj akım sitometri ve Mikro Yazma Sistemi (MTS) kan fenotipleme kartları kullanılarak değerlendirilmiştir.

Antijenler Kompakt Hyperbranched Polyglycerols Of Aşılama Membran By Fonksiyonel Kırmızı Kan Hücreleri Korumalı

Ökaryotlar için görülenden farklı olarak, esas olarak, küçük boyutu olarak bakterilerde ayrıntılı membran depolarizasyon ve iyon konsantrasyonu değişiklikleri, ölçüm zor geleneksel yöntemler yapan çok az çalışma vardır. Burada, biz floresan teknikleri kullanılarak anlamlı Gram-pozitif bir patojen Streptococcus pneumoniae tür olayları izlemek için detay protokolleri.

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

Burada, murin makrofajları içinde büyüyen Listeria monocytogenes bakterilerinden bakteriyel RNA izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, diğer hücre içi patojenler ve memeli konak hücreleri ile birlikte kullanılabilir.

RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Öğrenin, eksojen antijenlerin çapraz-sunumda endoplazmik retikulum ilişkili bozulması için membran yuvası arıtma yöntemini. Bu teknik, immünoloji araştırmalarında T hücre aktivasyonu mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma

Daha fazla video keşfet