Bitki / Mikrop Moleküler Etkileşimlerinin ve Sinyalizasyonunun Eşzamanlı ve Sistematik Analizi için Hidroponik Birlikte Yetiştirme Sistemi
22 Temmuz 2017
Tarif edilen hidrofobik kokültivasyon sistemi, metal örgülü elekler ile bozulmamış bitkileri destekler ve bunları bakteriler ile birlikte yetiştirir. Bitki dokuları, bakteriler ve salgılanan moleküller daha sonra aşağı akış analizleri için ayrıca hasat edilebilmekte, aynı anda her iki bitki barınağının ve etkileşen mikropların veya mikrobiyolojilerin moleküler tepkileri araştırılabilmektedir.
Bu sistemin genel amacı, doğal çevreyi yakından taklit eden basit bir deney düzeneğinde, bitki ve mikro ortaklar arasındaki karşılıklı sinyalleşme etkileşimini ve tepkilerini veya bitkilerin kimyasallara veya abiyotik faktörlere verdiği tepkileri incelemektir. Bu video, bitkilerin Agrobacterium tumefaciens bakterisi ile birlikte yetiştirilmesini göstermektedir. Bu yöntem, bitkilerin mikrobiyal etkileşimleri, mikrobiyal veya bitki stres tepkisi ve bir bitkinin mikrobiyal etkileşimlerinin ilk aşamasında bile karmaşık sinyalizasyon dahil olmak üzere moleküler sinyalizasyondaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Bu tekniğin temel avantajı, doğal ortamın taklidini içeren basit bir kurulumda, bir bitkinin mikrobiyal etkileşimlerinin doğa sinyalini ve tepkisini anlamaya yardımcı olmasıdır. Bu yöntem, tek bir mikrobiyal türle bitki etkileşimleri hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, birden fazla mikrobiyal türle veya abiyotik faktörlerle bitki etkileşimlerini incelemek için de kullanılabilir. Doğal durumları yakından taklit eden bitki mikrop etkileşimleri sırasında hücre sinyalleme homeostazını ararken bu yöntem için fikir sahibi olduk.
Deneye başlamak için tohumların sterilize edilmesi gerekir. Arabidopsis thaliana için, yaklaşık 200 tohumu 500 mikrolitre deiyonize su ile bir mikro santrifüj tüpünde birleştirin ve tüpü yüksek hızda girdaplayın. Tüpü bir masa üstü mikro santrifüjde 30 saniye boyunca 9000 x g'da santrifüjleyin.
Bir pipet kullanarak su süpernatantını çıkarın. Daha sonra, tohumlara 300 mikrolitre% 2 sodyum hipoklorit ekleyin ve girdaplayın. Karışımın oda sıcaklığında çökmesine izin verin.
Bir dakika sonra tohumları santrifüjleyin. Pipet ile sodyum hipoklorit çözeltisini çıkarın. Daha sonra tohumlara 500 mikrolitre steril, deiyonize su ekleyin ve karışımı girdaplayın.
Tüpü santrifüjledikten sonra suyu çıkarın. Tohumlara 500 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve karışımı girdaplayın. Tohumların bir dakika oturmasına izin verdikten sonra tüpü santrifüjleyin.
Bir pipet kullanarak% 70 etanolü çıkarın. Tohumları 500 mikrolitre steril, deiyonize su ile beş kez yıkayın. Ardından, sterilize edilmiş tohumları 500 mikrolitre steril, ultra saf suda tekrar süspanse edin.
Her steril, derin Petri kabına 25 mililitre yarı güçte Murashige ve Skoog veya %04 fito agar içeren MS ortamı dökün. Her Petri kabı için 90 milimetre x 90 milimetre kare paslanmaz çelik ağ kesin. Her kare ağın köşelerini, ağın Petri plakasının içine sığacak kadar bükün.
Ağın köşeler tarafından desteklenmesine izin vermek için köşeleri ağın kütlesine 90 derecelik bir açıyla bükün ve kök gelişimi için aşağıda yeterli alan bırakın. Kesilen örgü kareleri bir behere koyun ve üzerlerini alüminyum folyo ile kaplayın. 30 dakikalık bir kuru döngü kullanarak otoklavlama yaparak ağ karelerini sterilize edin.
Ortam Petri kaplarında katılaştıktan ve ağ steril hale geldikten sonra, her bir ağ karesini, bükülmüş köşeleri aşağı bakacak şekilde katı ortamın üzerine yerleştirin. Ağı, köşeler ortama nüfuz edecek ve ağın büyük kısmı ortamın üst yüzeyine değecek şekilde itin. Daha sonra, yüzeyi sterilize edilmiş A thaliana tohumlarını tek tek çıkarmak için steril bir 200 mikrolitrelik pipet kullanın ve her bir tohumu ağın üzerine nazikçe aktarın.
Tohumları, bitki türlerine ve deneysel ihtiyaçlara göre aralıklı olacak şekilde yerleştirin. Petri kaplarını kapaklarla kapatın ve plakaların kenarlarına gözenekli cerrahi bant yerleştirin. Tohumları alüminyum folyoya sarın.
Tüm Petri kabını yerleştirerek tohumları katmanlandırın. İki gün sonra, Petri kabındaki tohumları 10 ila 14 gün boyunca 16 saatlik bir fotoğraf periyodu ile 22 ila 24 santigrat derecede yetiştirin. Sterilize edilmiş bir akış davlumbazında, 18 mililitre otoklavlanmış sıvı MS ortamını steril kapaklı steril silindirik cam tanklara dökün.
Daha sonra, 10 ila 14 günlük fidelerle her bir ağ karesini yarı katı ortamın Petri kabından hidroponik silindirik bir tanka nazikçe aktarmak için steril forseps kullanın. Burada gösterilen fideler yoncadır. Gözenekli cerrahi bant kullanarak kapakları tankların üzerine kapatın.
Ardından, fideleri 22 ila 24 santigrat derecede, 16 saatlik bir fotoğraf periyodu ile ve 50 rpm'de sallayarak yetiştirin. Aşılamadan önce, herhangi bir olası kontaminasyon için fidelerle birlikte tankı dikkatlice inceleyin. Kirlenmemiş tanklardaki ortam berrak ve şeffaf olmalıdır.
Tanklar kirlilikle bulanıksa, onları atın ve geri kalan tankları numaralandırın. Her numaralı tanktan 20 mikrolitre hidroponik ortam örnekleyin ve Luria suyu veya LB agar içeren bir Petri kabına yerleştirin. Çanağı 28 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.
Her numaralı hidroponik tankı, 50 mikrolitre agrobacterium tumefacians süspansiyonu ile hemen her numaralı hidroponik tanka aşılayın. Fideleri ve A tumefacians bakterisini 22 ila 24 santigrat derecede, 16 saatlik bir fotoğraf periyodu ile ve 50 rpm'de çalkalayarak birlikte yetiştirin. Hidroponik büyüme ortamının sterilitesini doğrulamak için 12 ve 28 saatlik inkübasyondan sonra benekli LB plakasını inceleyin.
Herhangi bir kontaminasyon varsa, daha sonraki aşağı akış tahlilleri için bakterilerle aşılanmış ilgili numaralı tankı kullanmayın. Daha sonra, ağ plakasını kaldırarak kökleri bakteri süspansiyonundan ayırın. Sonraki analizler için kök kullanıyorsanız, kökleri kesin, çift damıtılmış suda hızlıca durulayın ve sterilize edilmiş filtre kağıdı üzerinde kurutun.
Yaprak veya başka bir doku kullanıyorsanız, dokuyu kesin. Bitki transkript analizi için, kökler veya sürgünler hemen sıvı nitrojen içine bırakılmalıdır. Bakteriyel transkript analizi için, 1.5 mililitre kültürü birlikte yetiştirme tankından aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.
Uygun bir birlikte yetiştirmenin ardından, ana kökün yan dalları olan tek tek ikincil kökleri ayırmak için steril makas kullanın. Daha sonra, gevşek bir şekilde bağlanmış malzemeyi çıkarmak için kökleri çift damıtılmış suda durulayın. Her kökü bir mikroskop lamı üzerine 30 mikrolitre suya batırın ve bir cam örtü ile örtün.
Kökleri dehidrasyondan korumak için lamel kenarlarını oje ile kapatın. Daha sonra floresan mikroskobu ile A tumefacians'ın A thaliana köklerine bağlanmasını görselleştirin. Uygun bir birlikte yetiştirmeden sonra, bitkileri hidroponik ortamdan ayırın.
18 mililitre hidroponik ortamı 0,2 mikronluk gözenekli bir filtreden 50 mililitrelik konik tüplere geçirerek sterilize edin. Numuneleri gece boyunca 80 santigrat derecede dondurun. Ertesi gün, 50 mililitrelik konik boruların kapaklarını gevşetin ve 36 saat boyunca dondurarak kurutma makinesinde bekletin.
Son olarak, HPLC analizi ve bileşik tespiti için numuneleri saklamaya veya işlemeye devam edin. Yapay olarak sağlanan besinler olmadan, A tumefacians c58 birlikte yetiştirme sisteminde büyüdü. Buna karşılık, A thaliana olmadan kontrol kültüründe esasen hiçbir bakteri üremesi gözlenmemiştir.
Hidroponik birlikte yetiştirme sistemleri, PCherry kırmızı floresan etiketli bakterilerin tipik bir kaya benzeri veya filamenta şekli ile bitki kök yapısına lokalize edildiği bu mikroskobik görselleştirmede görüldüğü gibi, bakterilerin kök yapısına bağlanmasını incelemek için kullanılabilir. Hem bitki direklerinin hem de etkileşen mikropların gen ekspresyon profilleri QRTPCR ile tespit edilebilir. Sekiz saatlik birlikte yetiştirmeden sonra, sekiz tumefacian hücresi, virülans genlerinin ekspresyonunun düzenlenmesini ortaya çıkardı.
Aynı zamanda, A thaliana'nın kökleri, birlikte yetiştirmeye yanıt olarak diferansiyel gen ekspresyonu ortaya çıkardı. 72 saatlik birlikte yetiştirmeden sonra, kontrole kıyasla aşılanmış bitkilerin salgısında 35 bileşik arttırıldı ve 76 bileşik azaltıldı. Bu teknik, araştırmacıların bitki-mikrop etkileşimlerini incelemeleri ve bitki ile mikrop veya mikrop biyom ortakları arasındaki karşılıklı tepkileri veya doğal çevreyi yakından taklit eden basit bir kurulumda abiyotik faktörlere bitki tepkilerini keşfetmelerinin yolunu açar.
Bunu sizinle birlikte izledikten sonra, moleküler bitkileri, mikrobiyal etkileşimleri ve sinyal tepkilerini daha doğal ve yönetilebilir bir ortamda incelemek için hidroponikte bir bitki mikrobiyal birlikte yetiştirme sistemi kurabileceğinizi umuyoruz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, bitki ve mikrobiyal etkileşimlerin eşzamanlı çalışmasını sağlayan bir hidroponik eşkültivasyon sistemi sunmaktadır. Kurulum, doğal ortamları taklit ederek karşılıklı sinyal iletimi ve moleküler tepkilerin araştırılmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki-Mikrobiyal Etkileşimler
- Mikrobiyal Ekoloji
- Sinyal İletimi
Arka Plan
- Sistem, metal kafes ekranları kullanarak sağlam bitkileri destekler.
- Bakteri, analiz için bitkilerle birlikte eşkültivasyona alınabilir.
- Toplanan malzemeler arasında bitki dokusu, bakteri ve salgılanan moleküller bulunur.
- Bu yaklaşım, hem bitki hem de mikrobiyal tepkilerin çalışılmasına olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Bitkiler ve mikroplar arasındaki sinyal etkileşimlerini keşfetmek.
- Bitkilerin abiyotik faktörlere verdikleri tepkileri anlamak.
- Kontrollü bir ortamda mikrobiyal etkileşimleri araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hidroponik eşkültivasyon sistemi.
- Mikrobiyal etkileşim çalışmaları için Agrobacterium tumefaciens kullanımı.
- Bitki ve mikrobiyal örneklerin eşzamanlı olarak toplanması.
- Moleküler sinyal iletimi ve stres tepkilerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Bitki-mikrob sinyal iletimi dinamiklerine ilişkin görüşler.
- Bitkilerin mikrobiyal strese verdikleri tepkilerin anlaşılması.
- Çoklu mikrobiyal türlerle etkileşimler çalışma yeteneği.
- Doğal koşulları taklit eden basit bir deneysel kurulumun gösterimi.
Sonuçlar
- Yöntem, bitki-mikrob etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirir.
- Karmaşık sinyal yollarının çalışılması için bir çerçeve sağlar.
- Bu yaklaşım çeşitli deneysel koşullar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This hydroponic co-cultivation system enables simultaneous and systematic analysis of plant-microbe molecular interactions under near-natural conditions, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By preserving spatial and temporal signaling homeostasis without synthetic inducers, it provides predictive confidence for target validation in plant-associated pathways. The approach facilitates translational biomarker discovery and preclinical model development for agrochemical and biostimulant R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of reciprocal signaling between plant hosts and microbial partners to clarify functional target pathways.
- Operational Value: Supports hypothesis testing through simultaneous harvesting of plant and microbial tissues for multi-omics profiling.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by mimicking in planta signaling dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening of compounds affecting plant-microbe interactions.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled hydroponic conditions and sterile mesh support.
- Strategic Value: Enhances screening readiness for evaluating microbial consortia or abiotic factor impacts on plant health.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling how microbes contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation via quantifiable secretome and gene expression changes.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking microbial virulence gene upregulation to host response profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven analysis of plant-microbe signaling before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through systematic analysis of virulence and defense gene expression.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs for compound screening in plant health applications.
- Analytics: Generates multi-omics readouts (transcriptome, secretome) that allow cross-condition comparison of signaling responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling microbial contributions to plant stress tolerance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying diverse plant-microbe consortia and environmental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through observation of natural signaling reciprocity.
- Operational Value: Standardization and scalability via hydroponic tanks and sterile mesh-supported plant cultivation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in agrobiotic development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on dual-host response profiling and secretome modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant sterile technique, hydroponic systems, and microbial co-culture handling.
- Needs instrumentation for fluorescence microscopy, qRT-PCR, and metabolite analysis (e.g., HPLC).
- Demands cross-team standardization for consistent sampling timing and tissue separation protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to non-Arabidopsis plant systems or alternative microbial partners.
- Limited by the need for aseptic maintenance and potential variability in root exudate collection efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Plant Seed Surface Sterilization
3:03
Seed Germination and Semi-solid Cultivation of Plants
4:51
Hydroponic Co-cultivation System
7:39
Fluorescence Microscopy
8:24
Secretome Profiling
9:10
Results: Co-cltivation System Mimics Natural Environment
10:28
Conclusion
