Name: Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis embriyogenezinde patern oluşumunu DIC mikroskobu ve GFP işaretleyicileri kullanarak karakterize etme yöntemini. Bu teknik, gen fonksiyonlarını ve hücre kimliğini in vivo çalışmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr Jessica Habashi el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Dr. Xianyong Sheng görüntüleme Merkezi, yaşam bilimleri, sermaye Normal Üniversitesi (Pekin, Çin), üniversite DR5-GFP tahlil lokalizasyonu gerçekleştirmek için teşekkür ediyoruz. Bu eser hibe Pekin belediye hükümeti Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (CIT &#38; TCD20150102) ve ulusal doğal Bilim Vakfı, Çin'den (31600248).

Not: Bu protokol üç bölümden oluşur: 1) vahşi tipi Arabidopsis embriyo DIC mikroskobu; kullanarak desen oluşumunda gözlemleyerek 2) embriyo Desen oluşumu ile işaret protein ifade confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak gözlenmesi karakterize; ve 3) ( naa10 mutant örnek olarak kullanarak) embriyogenez olarak belirli bir gen rolünün belirlenmesi.
1. ovule takas
<ol>
	<li>Bitki malzeme hazırlama Not: Burada açıklanan protokol nasıl sağlıklı bitkiler büyümek bir örnektir; sağlıklı bitkiler büyümek için başka yollar da iş.<ol>
		<li>1.5 mL tüp 100 tohum ekleyin ve sonra 5 dk. ters çevir'i tohumları tüp birkaç kez tohum ve çözüm yüzey tohumlar tamamen sterilize etmek için iyi karışık olduğundan emin olmak için sterilize etmek için 1 mL % 1.5 sodyum hipoklorit (mix 85 mL su ile 15 mL % 10 klor) ekleyin.</li>
		<li>Tohumlar tüp altına Santrifüjü 30 tarafından zorla 1200 x g, s süpernatant kaldırmak ve steril su ile tohum kalan sodyum hipoklorit kaldırmak için bir Bank dört kez yıkayın.</li>
		<li>4.4 g Bazal tuz karışımı Murashige ve Skoog (MS) ve 10 g Sükroz 1 litre ultrasaf su ekleyin. Tuzları ve sukroz çözmek için karışımı ilave edin. MS-Sükroz çözüm için eklemek gibi Phytagel, jelleşme Aracısı'nın 3 g çözüm pH 5.8 ile 1 M KOH, için ayarlayın ve belgili tanımlık eriyik vasıl 121 ° C MS orta yapmak 15 dakika sterilize.</li>
		<li>MS orta 30 mL MS orta plakaları oluşturmak için 12 cm kültür çanak içine dökün.</li>
		<li>Steril tohum MS tabağa yerleştirin. Plaka bir büyüme odasına aktarmak ve tohum stratifikasyon (3 gün karanlıkta 4 ° C'de) sonra plaka uzun günlük koşullar (16 h ışık ve karanlık 8 h için 18 ° C 22 ° C) altında tutun.</li>
		<li>8 gün sonra büyüme, bitkiler toprak (karışım besin açısından zengin toprak ve vermikülit 1:1 oranında) içinde bir tepsi, tepsi su kaybını önlemek 5 gün boyunca beyaz, şeffaf kapaklı kapağı takabilir ve Vitrifiye bitkilerin önlemek için bir boşluk bırakmak.</li>
		<li>Tepsiyi kapalı kapağı almak ve gömme Odası (1.1.5 bakınız) uzun günlük koşullar altında bitkilerde yetiştirmek. 6: 00'de ışık açma ve kapatma 10:00 PM. Artış Walk odası yaklaşık 20 gün sonra bitkiler çiçekli ve siliques üretilen.</li>
		<li>Çiçek tomurcukları ile tohum konumunu bir iplik takip ediyor önümüzdeki pm 08:00 işareti (ilk üçüncü çiçek tomurcukları için kullanmayın; Bu çiçek tomurcukları genellikle oluşturulan siliques bir kaç iptal edilen tohumlar geliştirmek ve bu anormal ovules normale oranda değiştirebilir). İşaretli bud ertesi sabah saat 8: 00'de çiçek açtığında ovule tozlaşma başlangıcı tanımlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoyer'ın çözüm hazırlanması
	<ol>
		<li>Kloral hidrat 24 g 50 mL tüp ekleyin ve tüp tamamen (kloral hidrat çözümler ışık altında istikrarlı değildir) alüminyum folyo ile sarın.</li>
		<li>Daha sonra 9 mL ultrasaf su ve gliserol 3 mL yukarıdaki ekleyin ve kloral hidrat çözülmeye tüp sallamak. Hoyer'ın çözüm sağlamak için herhangi bir kabarcıkları ortadan kaldırmak için oda sıcaklığında gecede stand tüp ver.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ovule ayrılık ve gümrükleme
	<ol>
		<li>Çift taraflı yapışkan bant bir parça mikroskop cam slayda ekleyin. Bir silique gün sonra tozlaşma (DAP) ile yüzeye dik pseudoseptum slaytta istediğiniz sayıyı yetiştirilen yer; Bu da carpels (şekil 1A ve 1B) bölmek kolay hale getirecek.</li>
		<li>Carpels pseudoseptum her iki tarafında bir şırınga iğnesi bölünmüş ve silique ovules bir stereoscope (rakamlar 1 c ve 1 D) altında görülebilir iki disseke carpels slayda ekleyin.</li>
		<li>Hoyer'ın çözüm cam slayt üzerine 70 µL dağıtmak ve sonra ince uçlu cımbız Hoyer'ın çözüm ile bir çift ucu daldırma nemlendirin. Stereoscope kullanarak, ovules slayt üzerinde embriyo temizlemek için cımbızla Hoyer'ın çözüm taşıyın. Bir coverslip yavaşça herhangi bir kabarcıklar oluşturulmasını engellemek için slayda uygulanır.</li>
		<li>2-12 h için karanlık bir odada bir kutu içine bitmiş slayt (daha olgun bir ovule daha fazla zaman gerektiğini) oda sıcaklığında attın. Embriyo octant ve erken küresel aşamaları (3 DAP) arasında 4 h sonra görülebilir iken, 2/4 hücreli aşamada (1-2 DAP) embriyo mikroskobik 2 h sonra görülebilmektedir. Daha olgun embriyo (4-8 DAP) 12 h sonra görülebilir.</li>
		<li>Mikroskop DIC işlevini kullanarak temizlenen ovules inceleyin. Embriyo bir düşük güç alan (10 X) altında bulun ve sonra geliştirilen embriyolar hücresel desende gözlemlemek için yüksek güç alanına (100 X yağı daldırma objektif) değiştirin.</li>
		<li>Embriyo farklı gelişim aşamalarında inceleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. embriyo desenlendirme ve hücre kimliğini Marker Protein ifade gözlem yolu ile karakterizasyonu
<ol>
	<li>Bitki malzemelerin hazırlanması
	<ol>
		<li>Organizatörü ve marker gen veya hormon yanıt öğe dizisi kodlama klonu ve sonra (gibi GFP); floresan bir protein ile sigorta ardından, yapı (pCambia1300 gibi) ikili vektör içine yerleştirin. Burada, auxin yanıt öğesi bir örnek10 DR5 sunulur.</li>
		<li>İçine vahşi-türü bitkiler Agrobacterium tumefacienstarafından elde edilen DR5-GFP plazmid takdim-dönüşümü11aracılı. Hygromycin içeren MS orta plakaları kullanarak T1 bitkiler seçin (50 mg/mL anne likör, seyreltilmiş 1:1, 000). Transgenik bitkiler uzun kökleri sergi ve büyüme 1.1.5 içinde açıklanan koşullar altında 8 gün sonra iki rozet yaprakları oluşturmak.</li>
		<li>Transgenik bitkiler toprağa aktarabilir ve onları 1.1.6 ve 1.1.7 belirtildiği şekilde yetiştirmek.</li>
		<li>T2 tohum bağımsız T1 hatları toplamak. MS-hygromycin plakaları tohumları ekmek, bir kopya (duyarlı bitkiler için dayanıklı bitkiler oranı kabaca 3:1-ecek var olmak) DR5-GFP ekleme taşıyan bitkiler seçmek ve onları toprağa aktarmak.</li>
		<li>T2 bitkiler 1.1.6 ve 1.1.7 belirtildiği şekilde yetiştirmek.</li>
		<li>T3 tohum T2 bitkilerden toplamak. MS-hygromycin plakaları tohumları ekmek, homozigoz transgenik bitkiler (tüm tek bir satır bitkilerden hygromycin direnç sergileyecek) seçmek ve onları toprağa aktarmak.</li>
		<li>Homozigoz T3 bitkilerin çiçek tomurcukları 1.1.8 içinde belirtildiği şekilde işaretle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP sinyal gözlem
	<ol>
		<li>Gliserol 3 mL 47 mL %6 gliserol çözüm üretmek için ultrasaf su ile karıştırın.</li>
		<li>Çift taraflı yapışkan bant bir parça cam mikroskop slayda ekleyin ve bir silique 1.3.1 içinde belirtildiği şekilde düzeltin.</li>
		<li>Carpels pseudoseptum her iki tarafında bir şırınga iğnesi bölünmüş ve iki disseke carpels 1.3.2 içinde belirtildiği gibi bir stereoscope altında slayt ekleyin.</li>
		<li>% 6 gliserol cam slayt üzerine 30 µL dağıtmak ve tüm ovules disseke carpels dan ince uçlu cımbız kullanarak çözüm yerleştirin. Bir coverslip slayt üzerinde yavaşça yerleştirin.</li>
		<li>Tohum ceket ve her ovule endosperm embriyo GFP sinyalleri gözlenmesi engelleyebilir gibi embriyo ovule ayıklamak. Slayt hızlı ve hafifçe dokunun (daha olgun bir ovule olan, daha az güç slayt için uygulanan) embriyo ovule üzerinden yükseltme için.</li>
		<li>GFP Floresans mikroskobu tarama confocal lazer kullanarak slayt inceleyin. Düşük güç alan (10 X) altında izole embriyo bulmak ve konumlarını kaydetmek sonra embriyo ifadede DR5-GFP 488 için uyarma ışık kaynağı ayarlayarak gözlemlemek için yüksek güç alanına (100 X yağı daldırma objektif) değiştirmek nm GFP sinyal tespiti.</li>
		<li>GFP ifade daha fazla çözümleme için uygun T3 hattı seçmek için embriyo tespit edebilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. embriyo Desen oluşumu Ovule temizlik ve Marker Protein gözlem yolu ile embriyo öldürücü bir Mutant karakterizasyonu: Naa10 örnek olarak
<ol>
	<li>Embriyo desenlendirme naa10 mutant tesislerinde
	<ol>
		<li>Bitki malzemeleri 1.1.1-1.1.7 içinde belirtildiği şekilde hazırlayın.</li>
		<li>Naa10tespit+/ − gene özgü astar5ve sonra işareti kullanan PCR tarafından naa10 çiçek tomurcukları bitkiler+/ − bitkiler 1.1.8 içinde belirtildiği gibi.</li>
		<li>Ovule temizlik ve naa10 mikroskobik incelenmesi gerçekleştirmek+/ − 1.2 ve 1.3 belirtildiği gibi embriyo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naa10 embriyo marker protein analizi
	<ol>
		<li>2.1-2.2 içinde özetlenen yordamı kullanarak uygun DR5-GFP transgenik satırları elde edilir.</li>
		<li>Homozigoz DR5-GFP transgenik bir naa10 ile çizgiyi+/ − naa10 elde etmek için bitki+/ − (gene özgü PCR tarafından tanımlanan) F2 üretimi, naa10karakterize etmek için GFP Floresans marker için homozigoz bitkiler+/ −5 ve GFP sinyal homozigoz DR5-GFP satırını kullanarak bir mikroskop altında gözlemlemek.</li>
		<li>Naa10 çiçek tomurcukları mark+/ − 2.1.7 içinde belirtildiği gibi DR5-GFP için homozigoz bitkiler.</li>
		<li>2.2 içinde belirtildiği gibi DR5-GFP için homozigoz naa10 embriyo GFP sinyalin arayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li>
<li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+flowering+plants%3A+setting+up+the+basic+body+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li>
<li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li>
<li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+plant%3A+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li>
<li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/genetics/abstract/0168-9525(93)90246-E">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li>
<li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aux%2FIAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li>
<li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li>
<li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li>
<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Ovule izni hücre bölünmesi tespit ve Morfoloji Arabidopsisembriyogenez sırasında değerlendirilmesi için kullanışlı bir yöntemdir; Bu tekniği kullanarak, embriyo doğrudan DIC mikroskobu5,12altında görülebilir. Kritik ovule izni için adım 1.3.4 adımdır. Adım 1.3.4 ovule izni için gereken süreyi değişkendir. 12 h sonra belli belirsiz görünüyorlar ise 2/4 hücreli aşamada embriyo Hoyer'ın çözümünde, 2 h sonra açıkça görülebilmektedir. Böylece, daha olgun bir ...

Embriyogenez daha yüksek bitki gelişiminde ilk olaydır. Olgun embriyo formlarının dışında bir zigot hücre bölünmesi ve farklılaşma altında sıkı genetik kontrol1,2. Arabidopsis embriyoların hücre bölünmeler embriyogenez sırasında dizi beklenen desen3,4takip çünkü morfogenez kontrolünü çalışmaya uzun bir faydalı model vardır. Ancak, bir birkaç hücreyi içeren bir Arabidopsis embriyo gözlenen ve analiz için çok küçük. Buna ek olarak, bazı genler mutasyon embriyo ölümcül5embriyo bu genlerin rol gösteren, neden olabilir. Embriyo ölümcül mutantlar Desen oluşumu karakterizasyonu sayede embriyo gelişimi temel genler düzenleyen moleküler mekanizması anlamak için bir temel sağlar.
Detaylı bir yöntem burada embriyo Desen oluşumu model bitki Arabidopsis karakterizasyonu için doğrudan mikroskobik gözlem tarafından açıklanmıştır. Yöntem ovule izni bir embriyo mikroskobik gözlem tarafından takip içerir. Embriyo öldürücü bir mutant karakterizasyonu ayrıca açıklanmıştır.
Embriyo farklı gelişim aşamalarında morfolojisi Hoyer'ın çözüm6,7ile temizlenmiş ovules kullanarak doğrudan mikroskobu tarafından belirlenebilir. Böyle ovules bir yüksek Kırılma indisi sergi; Böylece, bu ovule yöntemi temizlenmesi özellikle fark girişim kontrast (DIC) mikroskopi tarafından uyulmalıdır numuneler için avantajlıdır.
Buna ek olarak, belirli bir hücre veya hücreler sınırlı sayıda embriyo sırasında ifade edilir genler imleyicileri bir embriyo hücreleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu nedenle, hücre Kimlik belirtimi embriyogenez sırasında ifade confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak GFP öğesini işaret proteinlerin izleyerek açıklamalı. Tersine, bir bilinmeyen işlev gen -GFP füzyon embriyogenez sırasında ifade desenini gözlemleyerek embriyo desenlendirme ve o gen ifade arasında bir bağlantı sağlamak ve Arabidopsisembriyo için gerekli olan yeni genlerin tanımlaması kolaylaştırmak.
Burada açıklanan yöntemi de embriyo öldürücü bir mutant fenotip karakterize ve etkilenen gen embriyogenez hücresel düzeyde üzerinde etkisini belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, marker gen ifade deseninin ile birlikte bir karşılaştırma sırasında embriyogenez vahşi tipi ve mutant bitkiler arasında moleküler mekanizmaları ve sinyal yollar embriyogenez8,9' ilgili hakkında ipuçları yöntemi yol açabilir. Gerçekten de, naa10 bitkiler için yöntem uygulandı ve mutant hypophysis anormal bölünmesi sırasında embriyo5auxin dağıtım bir değişiklik nedeni olabilir bulundu.

<table><tbody><tr><td>Kloral</td><td>Hidrat Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog Bazal Orta</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme odası</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Görüntü M2</td><td>kamera: AxioCam 506 renkli</td></tr><tr><td>Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss LSM 5</td><td>filtreler: BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>kamera: AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>besin açısından zengin toprak</td><td>KLASMANN, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüp</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tüp</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 10 sodyum hipoklorit çözeltisi</td><td></td><td></td><td>Yerli analitik reaktif</td></tr><tr><td>sükroz</td><td></td><td></td><td>Yerli analitik reaktif</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Yerli analitik reaktif</td></tr><tr><td>gliserol</td><td></td><td></td><td>Yerli analitik reaktif</td></tr><tr><td>kültür kabı</td><td></td><td></td><td>Yurtiçi malzemeler</td></tr><tr><td>vermikülit</td><td></td><td></td><td>Yerli malzemeler</td></tr><tr><td>cam kaydırak</td><td></td><td></td><td>Yerli malzemeler</td></tr><tr><td>şırınga iğnesi</td><td></td><td></td><td>Yerli malzemeler</td></tr><tr><td>ince uçlu cımbız</td><td></td><td></td><td>Yerli malzemeler</td></tr><tr><td>süper temiz tezgah</td><td></td><td></td><td>Yerli ekipman</td></tr></tbody></table>

embriyogenez arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Gelişimleri çok öngörülebilir doğası göz önüne alındığında, Arabidopsis embriyo bir model olarak morfogenez tesislerinde çalışmaları için kullanılmaktadır. Ancak, erken aşamada bitki embriyo küçük ve onları gözlemlemek ve çözümlemek zor hale birkaç hücre içeriyor. Bir yöntemi Desen oluşumu bitki embriyo model organizma Arabidopsiskullanma mikroskop altında karakterize için burada kullanılmıştır. Taze ovules Hoyer'ın solution'ı kullanma izni, cep telefonu numarasını ve Morfoloji embriyo gözlenen ve onların gelişim aşamasında fark girişim kontrast mikroskobu bir 100 X yağı daldırma objektifi kullanarak tarafından tespit edilemedi. Buna ek olarak, belirli işaret proteinlerin yeşil flüoresan Protein (GFP ile) öğesini ifade mikroskobu tarama confocal lazerle hücre Kimlik belirtimi embriyo desenlendirme sırasında ek açıklama eklemek için takip. Böylece, bu yöntem vahşi-türü bitki embriyolar, hücresel ve moleküler düzeyde oluşumunda desen gözlemlemek ve embriyo vahşi-türü bitkiler ve embriyo ölümcül mutantlar Desen oluşumu karşılaştırarak embriyo desenlendirme belirli genlerin rol tanımlamak için kullanılabilir. Bu nedenle, yöntem Arabidopsisembriyogenez karakterize etmek için kullanılabilir.

Bu makalede açıklanan yöntemi embriyogenez doğrudan bir mikroskop altında gözlemlemek, belirli işaretleri ile hücre Kimlik belirtimi embriyogenez sırasında ek açıklama eklemek ve belirli bir gen rolü embriyogenez sırasında karakterize için kullanılabilir.
Temsilcisi sonuçları analiz (olgun yürüyüş-stick sahneye uzun zigot sahneden) içinde vahşi tipi Arabidopsis biçimlenme embriyo Şekil 2' d...

Bu iletişim kuralı Arabidopsis içinde embriyogenez embriyo Desen oluşumu bir mikroskop altında incelenmesi ve ardından ovule izni ile gözlemlemek için bir yöntem özetliyor.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Bu yöntemin genel amacı, model organizma kullanarak bitki embriyogenezi sırasında embriyoların örüntü oluşumunu karakterize etmektir. Bu yöntem, Arabidopsis'teki embriyogenez gibi bitki materyali alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, model bitki Arabidopsis'teki embriyo örüntü oluşumunun önerilen işlemle karakterize edilebilmesidir.Prosedürü uygulayan kişi, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Jinlin Feng'dir. Bu prosedüre başlamak için, 1,5 mililitrelik bir tüpe 100 tohum ekleyin. Tohumları sterilize etmek için bir mililitre sodyum hipoklorit ekleyin.Tohumların ve solüsyonun iyi karıştığından emin olmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Beş dakika sonra, tüpü 1200 Gs hızında 30 saniye boyunca santrifüj edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve kalan sodyum hipokloriti temizlemek için tohumları steril su ile dört kez yıkayın.Ardından, bir litre ultra saf suya 4,4 gram MS bazal tuz karışımı ve 10 gram sükroz ekleyin. Tuz ve sükroz çözünene kadar karıştırın. Bir mol potasyum hidroksit kullanarak çözeltinin pH değerini 5,8'e ayarlayın.Ardından, üç gram jelleştirme maddesi ekleyin ve çözeltiyi 121 °C'de 15 dakika boyunca sterilize edin. Elde edilen MS besiyerinin 30 mL'sini 12 cm'lik bir kültür kabına dökün. Sterilize edilmiş tohumları MS plakasına yerleştirin.Tohumları katlandırmak için plakayı bir buzdolabına aktarın ve üç gün boyunca karanlıkta 4 °C'de tutun. Ardından, plakayı sekiz gün boyunca uzun gün koşullarında bir büyüme odasında bekletin. Daha sonra, bitkileri bir tepsideki toprağa aktarın.Su kaybını önlemek için tepsiyi şeffaf beyaz bir kapakla kapatın. Bitkilerin vitrifikasyonunu önlemek için küçük bir boşluk bırakın. Beş gün sonra kapağı kaldırın ve bitkileri bir yürüyerek girilebilir oda içinde uzun gün koşullarında yetiştirin.Yaklaşık 20 günlük büyümeden sonra, saat 20:00'de tohum saplarının ve çiçeğimin konumundaki 10 ila 15 çiçek tomurcuğunu işaretlemek için bir ip kullanın. İşaretli tomurcukların çiçek açtığı anı, ertesi sabah saat 08:00 olarak belirleyerek ovülün tozlaşmasının başlangıcı olarak tanımlayın. Hoyer çözeltisini hazırlamaya başlamak için, 50 mililitrelik bir tüpe 24 gram klorhidrat ekleyin. Tüpü, folyonun tüm ışığı engellediğinden emin olarak tamamen alüminyum folyo ile sarın.Dokuz mililitre ultra saf su ve üç mililitre gliserol ekleyin. Klorhidratı çözmek için tüpü çalkalayın. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için hazırlanan Hoyer çözeltisini oda sıcaklığında gece boyunca bekletin.Başlamak için, bir mikroskop cam lamına çift taraflı yapışkan bant bir parça yapıştırın. Tozlaşmadan sonra istenen gün sayısı boyunca büyütülmüş bir silikuyu, pseudoseptum tarafı yüzeye dik olacak şekilde yerleştirin. Bir şırınga iğnesi kullanarak, pseudoseptumun her iki tarafındaki karpelleri ayırın.Ardından, ovüllerin ve silikin stereoskop altında görünecek şekilde iki diseke karpalı lama sabitleyin. Lam üzerine 70 µL Hoyer çözeltisi damlatın. Daha sonra, ucunu nemlendirmek için ince uçlu bir cımbızın ucunu çözeltiye batırın.Stereoskop ve pens kullanarak, embriyoları temizlemek için ovülleri Hoyer çözeltisine taşıyın. Bundan sonra, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek lam üzerine nazikçe bir kapatma camı yerleştirin. Hazırlanan lamı, oda sıcaklığında iki ila 12 saat boyunca karanlık bir odadaki kutuya yerleştirin.Gerekli süre geçtikten sonra, şeffaflaştırılmış ovülleri incelemek için mikroskobun DIC fonksiyonunu kullanın. Düşük büyütmeli bir alanda embriyoları bulun ve ardından gelişmiş embriyolardaki hücresel örüntüyü gözlemlemek için yüksek büyütmeli bir alana geçin. Daha sonra, farklı gelişim aşamalarındaki embriyoları inceleyin.Başlamak için, DR5 GFP plazmidini hazırlayın ve metin protokolünde belirtildiği şekilde agrobacterium aracılı transformasyon yoluyla bunu yabani tip bitkilere aktarın. Hidrolisin içeren MS ortamı plakalarını kullanarak T1 bitkilerini seçin. Ardından, T3 bitkilerini elde etmek için bitkileri metin protokolünde belirtildiği şekilde aktarın ve kültüre alın.Saat 20:00'de, bir ip kullanarak homozigot T3 bitkisinin çiçek tomurcuklarını çiçek salkımındaki tohum saplarının konumundan işaretleyin. Bundan sonra, %6'lık bir gliserol çözeltisi hazırlamak için 3 ml gliserolü 47 ml ultra saf su ile karıştırın. Ardından, bir mikroskop lamına bir parça çift taraflı yapışkan bant yapıştırın. Bir T3 bitkisinin siligini, psödoseptum yüzeye dik olacak şekilde lamın üzerine yerleştirin.Bir şırınga iğnesi kullanarak, pseudoseptumun her iki yanındaki karpelleri ayırın. İki diseke edilmiş karpeli, ovüller ve silik bir stereoskop altında görünür olacak şekilde lam üzerine sabitleyin. Ardından, lamın üzerine 30 µL %6 gliserol damlatın.Uçlarını nemlendirmek için ince uçlu bir cımbızı çözeltiye batırın. Stereoskop ve cımbız kullanarak, ovülleri gliserol çözeltisine taşıyın. Lamın üzerine nazikçe bir lamel yerleştirin.Ardından, embriyoyu tohuma çıkarmak için lam üzerine hızlıca ve nazikçe vurun. Bundan sonra, lamdaki yeşil floresan protein floresansını incelemek için konfokal lazer tarama mikroskobunu kullanın. İzole edilmiş embriyoları düşük büyütmeli bir alanda bulun ve konumlarını kaydedin.Embriyolardaki GR5 GFP ekspresyonunu gözlemlemek için yüksek büyütmeli bir alana geçin ve eksitasyon ışık kaynağını 488 nanometreye ayarlayın. Ardından, GFP ekspresyonunu tespit edin ve metin protokolünde belirtildiği şekilde embriyo desen oluşumunu karakterize edin. Bu çalışmada, görüldüğü üzere, Arabidopsis embriyogenezi ovül şeffaflaştırma yoluyla gözlemlenmektedir.Ovül temizleme işleminden sonra, farklı gelişim evrelerindeki embriyolar diferansiyel kontrast mikroskobu kullanılarak ayırt edilebilmektedir. Embriyogenez sırasında GR5 GFP'nin ekspresyon paterni daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu altında kaydedilir. DR5'in, yabani tip küresel ve kalp şeklindeki embriyoların kök kutbunda eksprese olduğu görülür.DR5'in embriyonik kotiledon uçlarında ve olgun yaban tipi embriyoların vasküler sisteminde eksprese olduğu görülmektedir. Bunun ardından, embriyogenez sırasında Arabidopsis'te naa10'un rolü incelenmektedir. Yaban tipi bitkilerdeki transvers asimetrik bölünmeye kıyasla, naa10'da bölünmelerin eğik ve dikey olduğu, anormal şekilde bölündüğü hipotezi gözlemlenmiştir.Burada görüldüğü üzere, oxen, globular evresindeki çoğu naa10 embriyosunda neredeyse tekdüze bir dağılım sergiler ve wild-type embriyolarla karşılaştırıldığında hipokotillerde daha geniş bir sinyal korur. Bu sonuçlar, naa10'un embriyogenez için gerekli olduğunu ve Arabidopsis'te oxen sinyal yolu aracılığıyla rol oynayabileceğini göstermektedir. Bu prosedürü uygularken, bitki materyali olarak Arabidopsis'in nasıl yetiştirileceğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, hücreye özgü genlerin ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla in-situ hibridizasyon gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, embriyogenez alanındaki araştırmacıların, Arabidopsis'te belirli genlerin embriyogenezi hangi moleküler mekanizmalarla yönlendirdiğini keşfetmelerine olanak sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, Arabidopsis'te embriyogenezin nasıl karakterize edileceği konusunda yetkin bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-method-for-characterizing-embryogenesis-in-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem...

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Biz İmmunosteyn, floresan in situ hibridizasyon, tüm montaj Arabidopsis thaliana ovüllerindeki kantitatif, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile takip DNA boyama için burada etkin ve güvenilir bir protokol sağlar. Bu yöntem başarıyla kromatin modifikasyonları ve nükleer mimarisi kullanılarak analiz edildi.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

Amaç, baklagil Medicago truncatula modelinin, baklagil olmayan Arabidopsis modelini tamamlamak için erken bitki embriyogenezinin düzenlenmesini araştırmak için kolayca kullanılabileceğini göstermektir. Pod morfolojisi, zigotik embriyogenez aşamaları ile bağlantılıdır ve doku kültürü kullanılarak embriyoların toplanması için bir protokol de sağlanır.

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri<em&gt; Medicago truncatula</em

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Bu el yazması Arabidopsis zigotları ve embriyo canlı hücre görüntüleme sağlar bir vitro ovule yetiştirme yöntemini açıklar. Bu yöntem sırasında zigot polarizasyon hücre içi dinamikleri ve gelişmekte olan embriyo hücre kader belirtimi görselleştirmek için kullanılmaktadır.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

Arabidopsis çift döllenmede sperm nükleer morfolojisi temelinde epifloresan mikroskobu kullanılarak başarılı veya başarısız döllenmeyi belirlemek için bir yöntem gösterilmektedir.

Arabidopsis Çift Döllenmede Sperm Nükleer Morfolojisinin İzlenmesi ile Döllenme Durumunun Değerlendirilmesi

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Bu yazıda stoma gelişimini kontrol eden genleri karakterize etmek için epidermal peeling kullanılmadan iki fenotipleme yöntemi anlatılmaktadır. İlk yöntem, toluidin mavisi O-boyalı bitki epidermisi kullanılarak stoma fenotipinin nasıl analiz edileceğini göstermektedir. İkinci yöntem, stoma ligandlarının nasıl tanımlanacağını ve biyolojik aktivitelerinin nasıl izleneceğini açıklar.

Stomatal Gelişimde Rol Oynayan Genlerin Epidermal Fenotip Skorlaması ile Tanımlanması

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Öğrenin, Arabidopsis embriyogenezinde patern oluşumunu DIC mikroskobu ve GFP işaretleyicileri kullanarak karakterize etme yöntemini. Bu teknik, gen fonksiyonlarını ve hücre kimliğini in vivo çalışmanıza olanak tanır.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Daha fazla video keşfet