Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Bu yöntemin genel amacı, model organizmayı kullanarak bitki embriyogenezi sırasında embriyoların model oluşumunu karakterize etmektir. Bu yöntem, Arabidopsis'teki embriyogenez gibi bitki maddesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, model bitki Arabidopsis'te embriyo deseni oluşumunun önerilen operasyonla karakterize edilebilmesidir.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Jinlin Feng. Bu işleme başlamak için 1,5 mililitrelik bir tüpe 100 tohum ekleyin. Tohumları sterilize etmek için bir mililitre sodyum hipoklorit ekleyin.

Tohumların ve çözeltinin iyice karıştığından emin olmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Beş dakika sonra, tüpü 30 saniye boyunca 1200 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve kalan sodyum hipokloriti çıkarmak için tohumları dört kez steril suyla yıkayın.

Daha sonra, bir litre ultra saf suya 4.4 gram MS bazal tuz karışımı ve 10 gram sükroz ekleyin. Tuzu ve sakarozu çözmek için karıştırın. Bir mol potasyum hidroksit kullanarak çözeltinin pH'ını 5.8'e ayarlayın.

Daha sonra, üç gram jelleştirici madde ekleyin ve çözeltiyi 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede sterilize edin. Elde edilen MS ortamının 30 mililitresini 12 santimetrelik bir kültür kabına dökün. Sterilize edilmiş tohumları MS tabağına yerleştirin.

Plakayı bir buzdolabına aktarın ve tohumları katmanlaştırmak için üç gün boyunca karanlıkta dört santigrat derece tutun. Daha sonra, plakayı sekiz gün boyunca uzun gün koşullarında bir büyüme odasında tutun. Daha sonra bitkileri bir tepsi içinde toprağa aktarın.

Su kaybını önlemek için tepsiyi şeffaf beyaz bir kapakla kapatın. Bitkilerin vitrifleşmesini önlemek için küçük bir boşluk bırakmak. Beş gün sonra, kapağı çıkarın ve bitkileri uzun gün koşullarında bir gömme odada yetiştirin.

Yaklaşık 20 günlük büyümeden sonra, tohum saplarının konumunda 10 ila 15 çiçek tomurcuğu ve saat 20: 00'de çiçeklenme ile işaretlemek için bir iplik kullanın. İşaretli tomurcuklar çiçek açmaya başladığında yumurtanın tozlaşmasının başlangıcını ertesi sabah saat 8:00 olarak tanımlayın. Hoyer çözeltisini hazırlamaya başlamak için, 50 mililitrelik bir tüpe 24 gram klorhidrat ekleyin. Tüpü tamamen alüminyum folyoya sarın ve folyonun tüm ışığı sızdırmaz hale getirdiğinden emin olun.

Dokuz mililitre ultra saf su ve üç mililitre gliserol ekleyin. Klorhidratı çözmek için tüpü sallayın. Ardından, kabarcıkları gidermek için hazırlanan Hoyer solüsyonunu gece boyunca oda sıcaklığında bekletin.

Başlamak için, bir mikroskop cam slaytına bir parça çift taraflı yapışkan bant yapıştırın. Psödoseptum yüzeye dik olacak şekilde yan tarafa tozlaşmadan sonra istenen sayıda gün boyunca büyütülen bir silikon yerleştirin. Bir şırınga iğnesi kullanarak, psödoseptumun her iki tarafındaki karpalları ayırın.

Daha sonra, iki disseke karpalı slayda tutturun, böylece ovüller ve silique bir stereoskop altında görülebilir. 70 mikrolitre Hoyer solüsyonunu cam slaytın üzerine dağıtın. Ardından, ucu nemlendirmek için bir çift ince uçlu cımbızı solüsyona batırın.

Stereoskop ve cımbız kullanarak, embriyoları temizlemek için ovülleri Hoyer solüsyonuna taşıyın. Bundan sonra, herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek slayta nazikçe bir kapak fişi uygulayın. Bitmiş slaytı oda sıcaklığında iki ila 12 saat boyunca karanlık bir odada bir kutuya yerleştirin.

Gerekli süre geçtikten sonra, temizlenmiş ovülleri incelemek için mikroskobun DIC işlevini kullanın. Embriyoları düşük güçlü bir alan altında bulun ve daha sonra geliştirilen embriyolardaki hücresel modeli gözlemlemek için yüksek güçlü bir alana geçin. Daha sonra embriyoları farklı gelişim aşamalarında inceleyin.

Başlamak için, DR5 GFP plazmidini hazırlayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi agrobakteriden metaszianlara aracılı dönüşüme kadar vahşi tip bitkilere sokun. Hidrolizin içeren MS orta plakaları kullanarak T1 bitkilerini seçin. Ardından, T3 bitkilerini elde etmek için bitkileri metin protokolünde belirtildiği gibi aktarın ve yetiştirin.

Bir iplik kullanarak, homozigot T3 bitkisinin çiçek tomurcuklarını, saat 2: 00'de çiçeklenme sırasında tohum saplarının konumunda işaretleyin. Bundan sonra,% 6'lık bir gliserol çözeltisi oluşturmak için üç mililitre gliserolü 47 mililitre ultra saf su ile karıştırın. Ardından bir mikroskop cam slaytına bir parça çift taraflı yapışkan bant yapıştırın. Bir T3 bitkisinin silikasını, psödoseptum yüzeye dik olacak şekilde slaydın üzerine yerleştirin.

Bir şırınga iğnesi kullanarak, psödoseptumun her iki tarafındaki karpalları ayırın. Kesilmiş iki karpalı, ovüller ve silique bir stereoskop altında görünecek şekilde slayta takın. Ardından, slayta 30 mikrolitre% 6 gliserol dağıtın.

Ucu nemlendirmek için bir çift ince uçlu cımbızı solüsyona batırın. Stereoskop ve cımbız kullanarak, ovülleri gliserol çözeltisine taşıyın. Kızağın üzerine yavaşça bir kapak fişi yerleştirin.

Ardından, embriyoyu ovülden çıkarmak için slayta hızlı ve nazikçe dokunun. Bundan sonra, yeşil floresan protein floresansı için slaydı incelemek için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. İzole edilmiş embriyoları düşük güçlü bir alanın altında bulun ve konumlarını kaydedin.

Embriyolarda GR5 GFP ekspresyonunu gözlemlemek için yüksek güçlü bir alana geçin ve uyarma ışık kaynağını 488 nanometreye ayarlayın. Ardından, GFP ekspresyonunu tespit edin ve metin protokolünde belirtildiği gibi embriyo paterni oluşumunu karakterize edin. Bu çalışmada Arabidopsis'te embriyogenez, görüldüğü gibi ovül klirensi ile gözlenmiştir.

Ovül klirensinden sonra, farklı gelişim aşamalarındaki embriyolar, diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak ayırt edilebilir. Embriyogenez sırasında GR5 GFP'nin ekspresyon paterni daha sonra konfokal lazer tarama mikroskobu altında kaydedilir. DR5'in yabani tip küresel ve kalp şeklindeki embriyoların kök kutbunda eksprese edildiği görülmektedir.

DR5, embriyonik kotiledon uçlarında ve olgun vahşi tip embriyoların vaskülatüründe eksprese edilir. Bundan sonra naa10'un Arabidopsis'te embriyogenez sırasındaki rolü incelenmektedir. Hipotez, yabani tip bitkilerde enine asimetrik bölünmeye kıyasla naa10'da çarpık ve dikey bölünme ile anormal şekilde bölündüğü gözlenmiştir.

Burada görüldüğü gibi, öküzler, küresel aşamada çoğu naa10 embriyosunda neredeyse eşit bir dağılıma sahiptir ve vahşi tip embriyolara kıyasla hipotezlerde daha geniş bir sinyal tutar. Bu sonuçlar, naa10'un embriyogenez için gerekli olduğunu ve Arabidopsis'teki öküz sinyal yolu yoluyla çağrılabileceğini göstermektedir. Bu prosedürü denerken, Arabidopsis'in bitki materyali olarak nasıl yetiştirileceğini hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, hücreye özgü genlerin ekspresyonu gibi ek soruları yanıtlamak için yerinde hibridizasyon gibi diğer önlemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, embriyogenez alanındaki araştırmacıların, Arabidopsis'te belirli genlerin embriyogeneze aracılık ettiği moleküler mekanizmayı keşfetmelerinin yolunu açar. Bu videoyu izledikten sonra, Arabidopsis'te embriyogenezi nasıl karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.