Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Bu videoda, hücre yüzeyi biyotinilasyonu ve nabız takibi biyotinilasyonu olmak üzere iki yöntem sunulacaktır. Aşağıdaki gösteride astrositleri kullanacağız. Bunlar beyinde en bol bulunan glial hücre tipleridir ve ilgilendiğimiz protein olan Aquaporin-4'ü ifade ederler.

Bu yazıda kullandığımız yöntemler birçok farklı hücre tipine uygulanabilir ve bunlar süspansiyondaki hücreleri veya yapışık hücreleri içerebilir. Bu teknikler, biotin için erişilebilir bir hücre dışı alana sahip olduğu sürece, hemen hemen her transmembran proteinin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve içselleştirilmesini incelemek için kullanılabilir. Bu hücre yüzeyi biyotinilasyon testinin genel amacı, lamininin astrositlerin plazma zarındaki su geçirgen kanal Aquaporin-4'ün ekspresyonu üzerindeki etkilerini belirlemektir.

Bu işleme başlamak için, astrosit kültürlerini inkübatörden çıkarın ve ortamı aspirasyon ile atın. Hücreleri dört mililitre soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın ve bulaşıkları kırılmış buzun üzerine yerleştirin. CM-PBS'yi aspirasyonla çıkarın ve ardından her bir oyuğa iki mililitre biyotin tamponu pipetleyin.

Kültürleri 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirmeden önce tam kaplamayı sağlamak için bulaşıkları birkaç kez hafifçe ileri geri eğin. Daha sonra biyotin tamponunu çıkarın, dört mililitre söndürme tamponu ile değiştirin ve kültürleri 10 dakika buz üzerinde tutun. Daha sonra, kültürleri 10 dakika buz üzerinde bırakmadan önce aspire edin ve aynı miktarda söndürme tamponu ile değiştirin.

Ardından, söndürme tamponunu atın ve hücreleri dört mililitre soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. Bunu takiben, hücreleri bir mililitre soğutulmuş CM-PBS'ye kazıyın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, hücreleri dört santigrat dereceye ayarlanmış soğutulmuş bir mikrosantrifüjde üç dakika boyunca 100 g'da santrifüjleme ile peletleyin.

Bundan sonra, süpernatanı atın ve hücreleri 500 mikrolitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, numuneleri her beş dakikada bir girdap yaparak 30 dakika buz üzerinde bırakın. Bunu takiben, herhangi bir deterjan ve çözünür maddeyi peletlemek için lizatı 14.000 g'da 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Lizattan 50 mikrolitre tasarruf edin ve üzerine 25 mikrolitre üç X yükleme tamponu ekleyin. Daha sonra, kuru bir banyoda 95 santigrat derecede ısıtarak denatüre edin.

Bu, hem biyotinile hücre yüzeyi proteinlerini hem de biyotinile edilmemiş sitozolik proteinleri içeren giriş fraksiyonudur. Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, 75 mikrolitre streptavidin agaroz boncuğu lizata aktarın ve bir çalkalayıcı üzerinde üç saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, streptavidin agaroz boncuklarını dört santigrat derecede 30 saniye boyunca 1.500 g'da santrifüjleme ile peletleyin.

Süpernatanı 50 mikrolitre tasarruf edin ve 25 mikrolitre üç X yükleme tamponu ekleyin. Ardından, bir su banyosunda veya bir ısıtma bloğunda 95 santigrat derecede denatüre edin. Bu, hücre içi fraksiyonu temsil eder ve esas olarak biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerden oluşur.

Daha sonra, peletlenmiş boncukları bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve dört santigrat derecede üç dakika boyunca sallayın. Boncukları peletleyin ve süpernatanı atın. Biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için bu işlemi dört kez daha tekrarlayın.

Lizis tamponu kullanılarak bir X'e seyreltilmiş 50 mikrolitre yükleme tamponu ekleyin. Boncuklardan biyotin ve streptavidini 95 santigrat derecede denatüre ederek serbest bırakın. Bu fraksiyon sadece biyotinile hücre yüzeyi proteinleri içermelidir.

Daha sonra, girişi, hücre yüzeyini ve hücre içi fraksiyonları SDS-PAGE ile ayırın ve batı blotlama ile analiz edin. Nabız kovalama biyotinilasyon deneyinin genel amacı, astrositlerde Aquaporin-4'ün yaklaşık içselleştirme oranını belirlemektir. İlk olarak, astrosit kültürlerini inkübatörden çıkarın ve ortamı aspire edin.

Daha sonra, hücreleri dört mililitre soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın ve bulaşıkları kırılmış buzun üzerine yerleştirin. CM-PBS'yi aspire edin ve ardından her tabağa üç mililitre biyotin tamponu pipetleyin. Tamponun iyi dağıldığından emin olmak için bulaşıkları birkaç kez ileri geri eğin ve 30 dakika buz üzerinde bırakın.

Ardından, biyotin tamponunu aspire edin ve beş mililitre ılık ortamla değiştirin. Bir kültür kabını 37 santigrat derecede 15 dakika ve ikinci bir yemeği aynı sıcaklıkta 30 dakika inkübe edin. Sıfır dakika örneği olarak dört santigrat derecede başka bir tabak bırakın.

Kuluçka süresinin sonunda, ortamı atın ve hücreleri dört mililitre soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, CM-PBS'yi aspire edin ve ardından hücrelerin üzerine altı mililitre indirgeyici tampon pipetleyin ve numuneyi 15 dakika buz üzerinde bırakın. Ardından, ortamı altı mililitre taze indirgeyici tamponla değiştirin ve numuneyi 15 dakika daha buzun üzerine koyun.

İndirgeyici tampon içinde bulunan glutatyon, hücre yüzeyinde kalan biyotin vahasını parçalayacağından bu adım kritiktir. Bu, yalnızca içselleştirilmiş proteinlerin biyotin olarak etiketlenmesini sağlar. Bunu takiben, indirgeyici çözeltiyi çıkarın ve altı mililitre söndürme tamponu ile değiştirin.

Numuneyi 15 dakika daha buz üzerinde bırakın ve su verme adımını bir kez daha tekrarlayın. Ardından, söndürme tamponunu atın ve hücreleri dört mililitre soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. CM-PBS'yi aspire edin ve daha sonra hücreleri bir hücre kaldırıcı kullanarak bir mililitre soğutulmuş PBS'ye kazıyın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Hücreleri üç dakika boyunca 100 g'da santrifüjleme ile peletleyin. Üç dakika sonra, süpernatanı atın ve hücreleri 500 mikrolitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneyi 30 dakika buz üzerinde bırakın ve her beş dakikada bir girdap yapın.

Deterjanı ve çözünür malzemeleri peletlemek için lizatı 14.000 g'da, dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu lizattan 50 mikrolitre tasarruf edin ve yükleme tamponu ekleyin.

Daha sonra, hücreleri kuru bir banyoda 95 santigrat derecede denatüre edin. Bu, hem biyotinile endositozlu proteinleri hem de biyotinile edilmemiş proteinleri içeren giriş fraksiyonudur. Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, lizata 150 mikrolitre streptavidin agaroz bulamacı ekleyin ve bir çalkalayıcı üzerinde üç saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Üç saat sonra, streptavidin agaroz boncuklarını santrifüjleme yoluyla, 1.500 g'da 30 saniye boyunca, dört santigrat derecede peletleyin. Boncukları bir mililitre yıkama tamponunda tekrar süspanse edin ve dört santigrat derecede üç dakika boyunca sallayın. Boncukları peletleyin ve süpernatanı atın.

Biyotinile olmayan sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için bu işlemi dört kez daha tekrarlayın. Daha sonra, boncukları 1.500 g'da 30 saniye boyunca dört santigrat derecede santrifüjleme ile peletleyin. Üstteki yıkama tamponunu atın ve 50 mikrolitre bir x yükleme tamponu ekleyin.

95 santigrat derecede denatüre ederek boncuklardan biyotin ve streptavidin salın. Bu fraksiyon sadece içselleştirilmiş hücre yüzey proteinlerini içermelidir. Ardından, girişi, hücre yüzeyini ve bağlanmamış fraksiyonları SDS-PAGE ile ayırın ve Western blotting ile analiz edin.

Burada gösterilenler, tedavi edilmemiş astrositlerden hücre yüzeyi, hücre içi ve toplam fraksiyonlar ve Aquaporin-4 için araştırılan 24 nanomolar laminin ve beta-distroglikan ile muamele edilen astrositlerdir. Bu histogram, beta-dytroglikan'a karşı normalize edilmiş, işlenmemiş ve laminin ile muamele edilmiş astrositlerde Aquaporin-4'ün hücre yüzey seviyelerindeki farklılıkları göstermektedir. Bu şekilde, sıfır, 15 ve 30 dakikada toplanan içselleştirilmiş protein fraksiyonları Aquaporin-4 için incelendi.

Ve bu histogram, dört bağımsız deney için Aquaporin-4'ün içselleştirilmesini özetliyor, sıfır dakika zaman noktası için değerlere göre normalleştirilmiş. Yıldız işareti, 15 ila 30 dakika arasında endositoz edilen Aquaporin-4 miktarında istatistiksel olarak anlamlı bir artışı gösterir. Bölünebilir biyotin analogundaki disülfid bağını kırmak için glutatyon kullanıldığında, hücre yüzeyi Aquaporin-4'ün biyotinile fraksiyona katkısı keskin bir şekilde azalır.

Sıfır dakika ve 15 dakikalık örnekler arasında net bir fark ile sonuçlanır. Adım atlandığında, hücre yüzeyi havuzundan kaynaklanan sinyal, iki zaman noktası arasındaki değişikliği algılanamaz hale getirir. Bu prosedürü takiben, kargonun fiziksel kaçakçılığı da dahil olmak üzere ek soruları yanıtlamak için immünofloresan ve TIRF Mikroskobu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.