Name: Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Öğrenin astrositlerde hücre-yüzey biyotinleme ve nabız-kovalama yöntemleriyle Aquaporin-4 proteininin ifadesini ve endosit oranını belirlemeyi. Bu teknikler sinirbilim araştırmalarında transmembran protein dinamiklerini incelemek için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu proje, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü PG # 20R47867 tarafından desteklenmiştir.

1. Astrositlerdeki Bağıl Hücre-Yüzey Protein Ekspresyonunun Biyotinleme ile Saptanması NOT: Burada, bu biyotinleme tekniğinin hücre geçirgen matris molekülünün laminin&#39;in su geçirgen kanal aquaporin-4&#39;ün (AQP4) hücre yüzeyi lokalizasyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine uygulanışını göstermektedir. Bu deney için gereken uzmanlık gerektiren materyaller arasında sülfo-NHS-LC-biyotin ve streptavidin-agaroz reçinesi bulunur (bkz . Malzeme Tablosu ). <ol><li> Noel ve ark. 12 , tahlilden yaklaşık 2 hafta önce kortikal astrositler kültürleri hazırlayın ve bunları 75 cm2 havaleli kültür şişeleri içinde büyütün. Astrositler% 80-90 konfluent olduklarında kültür yüzeyinden% 0,05 tripsin kullanarak ayırın ve sonra 1: 3&#39;ü geçirin. </li><li> Deneyden 48 saat önce, hücreler tekrar% 80-90 oranında birleştiğinde, geçiş astrositleri 1: 3&#39;ü (cKültür formatında hange) 60 mm hücre kültürü yemekleri üzerine yerleştirin, böylece deneyin gerçekleştiği gün% 70&#39;e yakın konfluent olurlar. Hücrelerin bulaşıklar arasında eşit olarak dağıldığından emin olun. </li><li> Testten 16 saat önce, 24 nM&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar kültür ortamına pipetleyin ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Analizden hemen önce aşağıdakileri hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin veya soğutun: CM-PBS (1X PBS, pH 7.4 içinde 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve 100 mg / L CaCl2), biotin tamponu (0.5 Yıkama tamponu (CM-PBS&#39;de 50 mM NH4CI), liziz tamponu (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glisin, 150 mM NaCl ve 5 mM) içeren süspanse edildi. EDTA,% 1 triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli), 3X yükleme tamponu (150 mM Tris, pH 6.8,% 6 SDS,% 30 gliserol, 300 mM DTT ve% 0.01 bromofenol mavisi) ve yıkama tamponu Tris (pH 7.4), 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCI,% 1 Triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli). </li><li> remAstrosit kültürlerini kuluçka makinesinden tutan yemekler ve ortamı atın. </li><li> Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile yıkayın ve bulaşıkların üzerine ezilmiş buz koyun. </li><li> Her oyuğa 2 mL biyotin tamponu pipetleyin ve tam kapsama sağlamak için yemekleri birkaç kez öne arkaya doğru yatırın. 30 dakika boyunca buzda bırakın. </li><li> Bir aspiratör kullanarak biyotin tamponunu çıkarın ve 4 mL söndürme tamponu ile değiştirin. 10 dakika boyunca buzda bırakın. </li><li> Söndürme tamponunu aspire edin ve eşdeğer hacim ile değiştirin. Yine buzda 10 dakika bekletin. </li><li> Söndürme tamponunu atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri 1 mL soğutulmuş CM-PBS&#39;ye kazın ve süspansiyonu mikrosantrifüj tüpüne aktarın. </li><li> 3 dakika süreyle 100 xg&#39;de santrifüj ederek pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve hücreleri 500 μL liziz tamponu içinde yeniden süspanse edin. </li><li> Örnekleri buzda 30 dakika bırakın, her 5 dakikada bir vorteksleyin veya plOnları uç uca rotatorda 4 ° C&#39;de sürün. </li><li> Herhangi bir deterjana uygun olmayan maddeleri pelet haline getirmek için lizat 14000 xg&#39;de 10 dakika süreyle 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. <ol><li> Bu lizatın 50 μL&#39;ini kurtarın ve içine yükleme tamponu ekleyin. Sonra kuru bir banyoda 95 ° C&#39;de ısıtarak denatürasyon yapın; Bu, hem biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinlerini hem de biyotinleştirilmemiş sitozolik proteinleri içeren &quot;girdi&quot; fraksiyonudur. </li></ol></li><li> Keskin bir makas kullanarak yaklaşık 0.5 cm malzeme keserek bir pipet ucunun açılmasını genişletin. Bu pipet ucu kullanarak, 75 μL streptavidin-agaroz boncuklar (normalde 4 ° C&#39;de saklanır) lizata aktarın ve 4 ° C&#39;de çalkalayıcı / rocker üzerinde inkübe edin. <ol><li> Streptavidin-agaroz sıklıkla hacim olarak% 50 boncuk içeren bir bulamaç olarak satılmakta, antimikrobiyal bir solüsyon içine asılmaktadır, boncuklarınEşit şekilde süspansiyon haline getirilir ve daha sonra her bir numuneye süspansiyonun 150 uL&#39;si pipetle alınır. </li></ol></li><li> Pelet streptavidin-agaroz boncuklar, 1500 xg&#39;de 30oC&#39;de 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek toplanır. <ol><li> Süpernatanın 50 μL&#39;ini saklayın (yükleme tamponu ekleyin ve 95 ° C&#39;de bir su banyosu veya ısıtma bloğunda denatürasyon yapın); Bu, &quot;hücre içi&quot; fraksiyonu temsil eder ve esasen biyotinile edilmemiş sitozolik proteinlerden oluşur. </li></ol></li><li> 1 mL yıkama tamponunda topak haline getirilmiş boncukları tekrar süspanse edin ve 4 ° C&#39;de 3 dakika boyunca sallayın. Pellet boncukları (1.16&#39;da olduğu gibi) ve süpernatanı atın. Nonbiotinli sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirgemek için bu işlemi 4 kez tekrarlayın. </li><li> Boncukları santrifüjle peletleyin (0 ° C&#39;de 1500 xg, 4 ° C&#39;de) ve üstteki yıkama tamponunu atın. 50 μL 1X yükleme tamponu (liziz tamponu ile seyreltilmiş) ilave edin. 95 ° C&#39;de denatüre ederek boncuklardan biyotin ve streptavidin serbest bırakın; Bu fraksiyon shoUld sadece biyotinlenmiş hücre yüzeyi proteinleri içerir (&quot;hücre yüzeyi&quot; fraksiyonu). <ol><li> Giriş, hücre yüzeyi ve hücre içi fraksiyonları SDS-PAGE 13 ile ayırın ve western blot ile analiz edin 14 . NOT: Denemelerimizde% 4-20 prekast gradyen jel kullanırken,% 4&#39;lük istif tabakası (her biri% 0.1 SDS içeren) ile% 12-14&#39;lük ayırıcı jel, bu çalışmada ilgilenilen proteinler için yeterlidir. Uygun boyut aralığının bir molekül ağırlığı standardı da kullanılmalıdır. Biyotinlenmiş proteinlerin görünür molekül kütlelerinde bazen gözlemlenebilir bir hızlanma olabileceğini unutmayın. </li></ol></li></ol> 2. Astrositlerdeki Hücre-Yüzey Proteinlerinin Biyotinleme ile İnsülasyon Hızının Belirlenmesi NOT: Aşağıda, bu durumda astrositlerdeki AQP4 endositozunu izlemek için kullanılan tipik bir pulse-chase biyotinilasyon deneyini açıkladık. BuYöntemi, Madrid ve ark. Tarafından kullanılana dayanmaktadır . 15 . İhtiyaç duyulan özel malzemeler arasında sülfo-NHS-SS-biyotin, streptavidin-agaroz reçinesi, indirgenmiş glutatyon ve iyodoasetamid yer alır ( Malzeme Tablosuna bakınız). <ol><li> Bir önceki bölümde özetlenen yöntemleri kullanarak fare kortikal astrosit kültürleri 60 mm yemekler halinde hazırlayın. Hücrelerin, analiz gününde yaklaşık% 70 konfluent olduğundan ve her tablanın eşdeğer sayıda hücre içerdiğinden emin olun. </li><li> Analizden hemen önce aşağıdakileri hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin veya buzdolabında saklayın: CM-PBS (1X PBS, pH 7.4&#39;de 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve 100 mg / L CaCl2), biotin tamponu (0.5 (50 mM indirgenmiş glutatyon, 75 mM NaCl ve 75 mM NaOH), söndürme tamponu (50 mM iyodoasetamid,% 1 BSA, CM-PBS içinde) içeren, CM-PBS içinde% 1 mg / mL sülfo-NHS-SS-biyotin) Lizis tamponu (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glisin, 150 mM NaCI ve 5 mM EDTA,% 1 triton X-100,1X protaz inhibitörü kokteyli), 3X yükleme tamponu (150 mM Tris, pH 6.8,% 6 SDS,% 30 gliserol, 300 mM DTT ve% 0.01 bromofenol mavisi) ve yıkama tamponu (10 mM Tris, pH 7.4, 1.5 mM EDTA, 150 mM NaCl,% 1 triton X-100, 1X proteaz inhibitörü kokteyli). </li><li> Taze hücre kültürü ortamı (% 10 Fetal Bbovine Serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş DMEM) hazırlayın ve 37 ° C su banyosu içine yerleştirin. </li><li> Astrosit kültürleri inkübatörden çıkarın ve bir aspiratör kullanarak ortamı aspire edin. </li><li> Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile yıkayın ve bulaşıkların üzerine ezilmiş buz koyun. </li><li> Her yemeğe 3 mL biyotin tamponu pipetleyin, tamponun iyi dağıldığından emin olmak için yemekleri birkaç kez ileri geri eğin ve 30 dakika boyunca buzda bırakın. </li><li> Biyotin tamponunu aspire edin ve 5 mL sıcak ortamla değiştirin. Bir kültür çanağını 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin ve 30 dakika süreyle aynı sıcaklıktaki ikinci bir çanağı inkübe edin. 4&#39;te bir tabak daha bırak6; C 0 dak. </li><li> Kuluçka döneminin sonunda, orta atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın. Pipet 6 mL, hücreler üzerinde tamponu azaltır ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. </li><li> İndirgeyici tamponu çıkarın ve 6 mL taze azaltıcı tamponla değiştirin. 15 dakika daha buzda bırakın. </li><li> İndirgeyen çözeltiyi çıkarın ve 6 mL söndürme tamponuyla değiştirin. 15 dakika boyunca buzda bırakın. </li><li> Söndürme adımını bir kez daha tekrarlayın. </li><li> Söndürme tamponu atın ve hücreleri 4 mL soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri 1 mL soğutulmuş PBS&#39;ye kazın ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. </li><li> 3 dakika süreyle 100 xg&#39;de santrifüj ederek pelet hücreleri. Süpernatantı atın ve hücreleri 500 uL liziz tamponuna tekrar süspanse edin. </li><li> Buz üzerinde 30 dakika bırakın ve her 5 dakikada bir girdap yapın. Alternatif olarak, numuneleri bu süre boyunca 4 ° C&#39;de uçtan uca bir rotasyona yerleştirin. </li><li> Ly&#39;yi santrifüjleyinDeterjana uygun olmayan maddeleri peletlemek için 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 14.000 xg&#39;de sedye haline getirin, sonra süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu lizatın 50 μL&#39;ini kurtarın, üzerine yükleme tamponu ekleyin ve kuru bir banyoda 95 ° C&#39;de denatürasyon yapın; Bu, hem biyotinlenmiş endositlenmiş proteinleri hem de biyotinleştirilmemiş proteinleri içeren &quot;girdi&quot; fraksiyonudur. </li><li> Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, lizata streptavidin-agaroz bulamacından 150 mcL ekleyin ve çalkalayıcı / rocker üzerinde 3 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Bu adım hakkında ek ayrıntılar için 1.15&#39;e bakın. </li><li> Pelet streptavidin-agaroz boncuklar 1,500 xg&#39;de 4 ° C&#39;de 30 saniye süreyle santrifüje edilerek toplanır. </li><li> Boncukları 1 mL yıkama tamponuna tekrar süspansiyon haline getirin ve 3 dakika boyunca 4 ° C&#39;de sallayın. Pellet boncukları (adım 2.18&#39;e göre) ve süpernatanı atın. Nonbiotinli sitozolik proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirgemek için bu işlemi 4 kez tekrarlayın. </li><li> Topak boncuklar, 30 ° C&#39;de 1,500 xg&#39;de, 4 ° C&#39;de santrifüjlenerek ve ove&#39;yi atınYanan yıkama tamponu. 50 μL 1X yükleme tamponu (liziz tamponu ile seyreltilmiş) ilave edin. 95 ° C&#39;de denatüre ederek boncuklardan biyotin ve streptavidin serbest bırakın; Bu fraksiyon sadece içselleştirilmiş hücre yüzeyi proteinleri içermelidir (&quot;endositoz&quot; fraksiyonu). </li><li> Giriş, hücre yüzeyi ve bağlanmamış fraksiyonları SDS-PAGE 13 ile ayırın ve batı lekelemesi ile analiz yapın 14 . NOT: Denemelerimizde% 4-20 prekast gradyen jel kullanırken,% 4&#39;lük istif tabakası (her biri% 0.1 SDS içeren) ile% 12-14&#39;lük ayırıcı jel, bu çalışmada ilgilenilen proteinler için yeterlidir. Uygun boyut aralığının bir molekül ağırlığı standardı da kullanılmalıdır. Biyotinlenmiş proteinlerin görünür molekül kütlelerinde bazen gözlemlenebilir bir hızlanma olabileceğini unutmayın. </li></ol>

<ol><li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li>
<li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li>
<li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li>
<li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+family%3A+endocytosis+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li>
<li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li>
<li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation%3A+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+1.+the+use+of+%5B14-C%5Dbiotin+for+kinetic+studies+and+for+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li>
<li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin%2C+a+high+affinity+biotin-binding+protein%2C+as+a+tool+and+subject+of+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450(2012).</li>
<li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805(2014).</li>
<li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li>
<li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan%2C+Dynamin%2C+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439(2016).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Değişiklikler: Bu yöntemler yapışık hücrelerle birlikte kullanılmak üzere tasarlandığından, 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve Yıkama basamakları için ve hücrelerin kültür yüzeyine yapışmış olmasını ve hücre-hücresi bağlantılarının bozulmamasını sağlamak için belirli tamponların tabanı olarak, 100 mg / L CaCI2 (CM-PBS). Bununla birlikte, protokoller, hücreler prosedürünün her bir adımı arasında pelet yapılıyorsa, yapışkan olmayan hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu gibi duru...

Hücrenin yüzeyindeki proteinler, hücre işlevini sürdürmek için merkezi rol oynarlar. Birçok durumda, bunların aktiviteleri, onları geçici olarak hücre içi bölgede tutan ya da bozunma yolları 1 , 2 , 3 , 4 , 5&#39;e yönlendiren endositik süreçlere bağlıdır veya modüle edilir. Burada, kullanıcıya, plazma zarında eksprese edilen proteinleri ve yeni içselleştirilen proteinleri özel olarak etiketlemek ve izole etmek için tasarlanmış 2 biyotinilasyon temelli yaklaşımları vurguluyoruz. Bu yöntemlerle, ilgili herhangi bir proteinin hücre yüzeyi ekspresyonu ve endositik oranı nicelleştirilebilir, böylece düzenlenmesinin daha net bir şekilde değerlendirilmesi mümkün olur. Bağıl hücre yüzeyi protein ekspresyonunun biyotinleme ile belirlenmesi Eskiden H6 vitamini olarak bilinen biyotin veya vitamin B7, biyolojik moleküllerin reaktif amin, sülfhidril ve karboksil gruplarını kimyasal olarak değiştirmek için kullanılabilen küçük bir suda çözünür moleküldür. Şu anki hücre yüzey biyotinilasyon reaktiflerinin mahsulü, esas itibariyle, eksprese edilen proteinlerin lisin tortularının yan zincirlerinde bulunan aminlerle reaksiyona girmek üzere tasarlanmış biyotinin veya türevlerinin membran geçirmeyen sülfonatlanmış N-hidroksisuksinimid (sülfo-NHS) esterlerini içerir. Bunlar, bazik koşullar altında protonsuz hale geldiğinde, hücre yüzeyi, ikinci durumda, biyotin kısmı 7 ile bir amid bağı oluştururlar. Böylece, modifiye edilmiş hücre yüzeyi proteinleri, daha sonra yaklaşık olarak 10-15&#39;lik bir ayrışma sabitiyle biyoinine bağlanan 66-69 kDa tetramerik bir protein olan avidin&#39;i kullanarak izole edilerek Bilinen en güçlü kovalent olmayan etkileşimler </suP&gt; , 9 . Önceki çalışmalarda, hücre yüzeyinde protein ekspresyonunu nicelendiren bir dizi alternatif yöntem kullanılmıştır. Örneğin, ilgi konusu protein için spesifik olan floresan etiketli antikorları, ardından flüoresan mikroskopisi ile görselleştirmeyi kullanarak, geçirimsiz hale getirilmiş hücrelerin etiketlenmesi yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olmakla birlikte, hücre dışı epitoplara bağlanabilen antikorların bulunabilirliğine büyük ölçüde bağımlıdır. Daha yakın zamanlarda, asidik ortamlara maruz bırakılmaya tepkiyen pH duyarlı florofor taşıyan kimerik proteinlerin kullanılmasını içeren yöntemler de başarılı bir şekilde kullanıldı. Bununla birlikte, bu tür tahliller, genellikle, bu yapıların, ilgi proteininin doğal olarak bulunmadığı hücre çizgilerinde eksojen ifadesini içerir. Bu yaklaşımlar yine de, subselüler lokalizasyon ve ekzositik güzergah ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilmektedirHedef protein içerir ve bu nedenle burada açıklanan biyotinilasyon temelli yaklaşımlarla bağlantılı olarak kullanılmalıdır. Tipik bir biyotinilasyon tahlilinde hücreler ilk olarak 4 ° C PBS&#39;de iyice yıkanır. Bu, kültür ortamı tarafından eklenen serum proteinlerinin izlerini kaldırır ve böylece bir sonraki aşamada bu miktarların fazla miktarda biyotini tüketmesini önler. Daha da önemlisi, sıcaklıktaki düşüş, endositozun önemli ölçüde yavaşlamasına neden olur. Daha sonra biyotinleme reaktifi eklenir. Daha sonra, hücreler yeniden yıkanır ve daha sonra geri kalan tüm biyotin izlerini inaktive etmek amacı olan ya glisin ya da NH4Cl içeren bir söndürme tamponu ile inkübe edilir. Daha sonra hücreler ayrıştırılır ve ardından biyotinlenmiş proteinlerin çökeltilmesi için agaroz-hareketsiz streptavidin ilave edilir. Analiz, yaygın olarak çeşitli prin bağıl hücre yüzeyi ekspresyonuna izin vererek, western blotting yoluyla gerçekleştirilirSayısallaştırılacak oteinler. Bu tahlilin temeli nedeniyle, sadece hücre dışı çevreye maruz kalan kısımlara sahip olan proteinler ile kullanım için uygundur. Muhtemelen döngü bölgelerinde bir takım reaktif lizinlere sahip olan çok katlı transmembran proteinleri, bu yöntem için en uygun yöntemdir; tek geçişli proteinler ise biyotinilasyona daha az duyarlı olma eğilimindedir. Bu durumlarda dahi, yapısal değişiklikler veya moleküller arası etkileşimlerin belirli reaktif bölgeleri tıkayarak beklenenden düşük bir biyotinilasyon verimi oluşturması olasılığı söz konusudur. Biyotinleme ile hücre yüzey proteinlerinin içselleştirme oranının belirlenmesi Bu tahlilin prensipleri, bir takım istisna dışında, hücre yüzeyinde biyotinilasyon ile büyük oranda benzerdir; bunların en önemlisi, tersinir biyotinilasyon reaktiflerinin kullanılmasıdır. Biyotin grupları (bunların) disuYapılarında, indirgeyici ajanlara duyarlı bağlar bağlanır; Bu, tahlil süresi boyunca hücre içi sitelere alınan sadece hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinile bırakılmasını sağlamak için kullanılır. Bir analiz genel olarak aşağıdaki şekilde gerçekleşir. Hücreler önce yıkanır ve soğuk reaktiflerle biyotinlenir, daha sonra 37 ° C&#39;de hücre kültürü ortamı yeniden verilir ve hücreler kuluçka makinesine geri gönderilir; Bu etiketli hücre yüzeyi proteinlerinin endositozuna uğramasına neden olur. Zara nüfuz etmeyen indirgeyici madde glutatyon daha sonra hücre yüzeyi üzerinde kalan proteinlere bağlı olan biyotin parçalarının disülfid bağlarını kırmak için eklenir. Sonunda, bozulmuş disülfür bağları, iyodoasetamid ile reaksiyona girerek, labil tiol gruplarını tüketir ve bağların reformasyonunu önler. Daha önce olduğu gibi, hücreler daha sonra lizlenir ve etiketli proteinler streptavidin-agaroz kullanılarak çöktürülür. Disk sınırlamalarıYöntemler arasında paylaşılan benzerlikler nedeniyle burada da geçerlidir. Buna ek olarak, bu tahlilde yer alan sıcaklık değişimlerinin, özellikle hızlı içselleştirilen veya hızla geri dönüşümlü proteinlerin olması durumunda, her zaman artışı için ne kadar proteinin sitoplazma edildiğinin tam olarak belirlenmesini engellemesi akılda tutulmalıdır. Bu nedenle tahlil, sadece endositik hızların semikantitatif bir kestirimini sağlar. Toplam iç yansıma flüoresan mikroskopisi, yüklü veziküllerin alımını izlemek ve endositoz kinetiğini daha kesin bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, ilgilenilen proteinin floresan etiketli kimerik yapısı bulunduğunu farz ederek, bu tahlil için çok faydalı bir tamamlayıcı madde sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>Amonyum klorür (NH < alt > 4 < / alt > Cl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Bio-Rad</td> <td># 1610404</td><td></td></tr><tr><td>tam proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Disodyum Etilendiamintetraasetat dihidrat ( EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Gibco / Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Bio-Rad</td> <td># 163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm murin sarkomu bazal membrandan</td><td>laminin Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Buz üzerinde çözülme.</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco / Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-&beta;-aktin antikoru (AC-15)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Fare monoklonal anti-&beta;-distroglikan antikoru (43DAG1 / 8D5)</td> <td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Gibco / Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniSaf Eşek anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz AffiniSaf Keçi anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson İmmünoAraştırma Laboratuvarları</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Gibco / Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Azaltılmış glutatyon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>862010 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agaroz reçinesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-AQP4 antikoru</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı (Trizma tabanı)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

primer astrosit kültürlerinde proteinlerin hücre-yüzey İfadesi ve endosit oranının biyotinleme yöntemiyle belirlenmesi

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Hücre yüzey proteinleri çok çeşitli fonksiyonlara aracılık eder. Çoğu durumda, faaliyetleri plazma membranındaki seviyelerini modüle eden endositik işlemlerle düzenlenir. Burada, bu süreçlerin çalışmasını kolaylaştıran 2 yöntem için ayrıntılı protokoller sunuyoruz, her ikisi de hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinleştirilmesi ilkesine dayanmaktadır. İlki hücre yüzeyinde belirli bir proteinin göreli düzeylerinin yarı niceliksel olarak belirlenmesine izin vermek için tasarlanmıştır. İçinde hücrelerin plazma membran proteinlerinin lisin artıkları önce bir biotin kısmı ile etiketlenir. Hücreler ayrıldıktan sonra, bu proteinler daha sonra agarozla hareketsiz hale getirilen streptavidin kullanımı ile biyotin için ikinci afinitenin doğal afinitesini istifade ederek spesifik olarak çöktürülebilir. Böyle bir şekilde izole edilen proteinler daha sonra standart bir western blotlama yaklaşımı ile analiz edilebilir. İkinci yöntem, bir partikülün endositik hızını belirleme aracı sağlarAr hücre yüzeyi hedefinin belirli bir zaman süresi boyunca. Hücre yüzey proteinleri, ilk olarak, bölünebilir bir disülfid bağı içeren bir biyotin türevi ile modifiye edilir. Hücreler daha sonra biyotinlenmiş proteinlerin bir kısmının endositik alımına neden olan normal kültür koşullarına geri kaydırılır. Daha sonra, içe geçmemiş biyotin gruplarının disülfür bağları, membrana geçirimsiz redüksiyon maddesi glutatyon kullanılarak indirgenir. Bu yaklaşım vasıtasıyla, endositize proteinler izole edilebilir ve yüksek bir özgüllük derecesi ile nicelleştirilebilir.

Astrositlerdeki AQP4&#39;ün plazma membran ekspresyonunu değerlendirmek için hücre yüzeyi biotinilasyonunun kullanılması Laminin ile muamele edilmiş astrosit kültürleri ve muamele edilmemiş kontrol hücreleri tarif edilen yöntemler kullanılarak hücre yüzeyi biotinilasyonuna tabi tutuldu. Biyotinlenmiş proteinler, agaroz-konjuge streptavidin ile çöktürüldü ve daha sonra SDS-PAGE vasıtasıyla ayrıldı. Hücre yüzeyi fraksiyonları AQP4 ve β-distroglikan (β-DG) için bir h...

Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Bu videoda, hücre yüzeyi biyotinilasyonu ve pulse-chase biyotinilasyonu olmak üzere iki yöntem sunulacaktır. İzleyen demonstrasyonda astrositler kullanılacaktır. Bunlar, beyindeki en bol bulunan glial hücre tipleridir ve ilgilendiğimiz protein olan Aquaporin-4'ü eksprese ederler.Bu makalede kullandığımız yöntemler, süspansiyon halindeki hücreler veya adheran hücreler dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipine uygulanabilir. Bu teknikler, biyotine erişilebilir bir hücre dışı domaine sahip olduğu sürece, hemen hemen her transmembran proteinin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve internalizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Bu hücre yüzeyi biyotinilasyon deneyinin genel amacı, lamininin astrositlerin plazma membranındaki su geçirgen kanalı Aquaporin-4'ün ekspresyonu üzerindeki etkilerini belirlemektir.Bu prosedüre başlamak için, astrosit kültürlerini inkübatörden çıkarın ve medyumu aspirasyonla uzaklaştırın. Hücreleri 4 mL soğutulmuş CM-PBS ile üç kez yıkayın ve kapları kırılmış buz üzerine yerleştirin. CM-PBS'yi aspirasyonla uzaklaştırın ve ardından her bir kuyucuğa 2 mL biotin tamponu pipetleyin.Kültürleri 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletmeden önce, tam kaplamayı sağlamak için

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Bu video, bir astrosit kültüründen hücre yüzeyi ve hücre içi proteinlerin izolasyonunu göstermektedir. Astrosit kültürü, endositozu inhibe etmek için buz üzerine yerleştirilir ve daha sonra hücre yüzeyi proteinleri bir biyotinilasyon reaktifi ile etiketlenir. Hücreler, biyotinile hücre yüzeyi proteinlerini ve biyotinile edilmemiş hücre içi proteinleri serbest bırakmak için parçalanır. Son olarak, streptavidin kaplı boncuklar, biyotinile hücre yüzeyi proteinlerini hücre içi proteinlerden ayırmak...

Bir Astrosit Kültüründen Hücre Yüzeyi ve Hücre İçi Proteinlerin İzolasyonu

Bu video, başarılı içselleştirmeyi doğrulamak için biyotinilasyon ve ardından hücre lizisi, streptavidin bazlı protein ekstraksiyonu, denatürasyon ve Western blot analizi kullanarak fare kortikal astrositlerinde hedef protein içselleştirmesini değerlendirmek için bir yöntem gösterir.

Bir Biyotin Türevi Kullanılarak Hedef Yüzey Proteinlerinin İçselleştirilmesinin Değerlendirilmesi

Kaynak: Creighton, BA, et al. Astrositlerde organellerin ve diğer kargoların hücre içi taşınımını görselleştirmek ve analiz etmek. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, asidik endolizozomal vezikülleri seçici olarak etiketleyen bir floresan asidotropik prob kullanılarak kültürlenmiş astrositlerde hücre içi kargo taşımacılığının görselleştirilmesini göstermektedir. Hızlandırılmış görüntüleme ve konfokal mikroskop ile Z-yığını alımı, floresan etiketli kargonun üç boyutlu hücre hacmi boyunca izlenmesine...

Kültürlü Astrositlerde Yükün Hücre İçi Taşınımının Görselleştirilmesi

Membran kaçakçılığı, proteinlerin plazma zarından hücre içine taşınmasını (yani endositoz) ve ardından bozunma için lizozomlara veya geri dönüşüm için plazma zarına kaçakçılığı içerir. Bu makalede açıklanan yöntemler, endositoz ve plazma zarı proteinlerinin geri dönüşümünü incelemek için tasarlanmıştır.

Plazma Zarı Proteinlerinin Endositozu ve Geri Dönüşümünü İncelemek için Hücre Bazlı L-Glutatyon Koruma Testleri

Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Bu makalede, ayrılmış primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptörü (GluR) kaçakçılığı çalışması için bir yöntem sunulur. Endojen veya aşırı ifade reseptörlerinin farmakolojik yaklaşımlar ile birlikte etiketlenmesi için antikor beslemeli bir yaklaşım kullanarak, bu yöntem, GluR yüzey ifadesini düzenleyen moleküler mekanizmaların belirlenmesi için izin verir veya geri dönüşüm süreçleri.

Disanated primer hipokampal kültürlerde glutamat reseptör kaçakçılığı çalışması için antikor beslenme yaklaşımı

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Öğrenin astrositlerde hücre-yüzey biyotinleme ve nabız-kovalama yöntemleriyle Aquaporin-4 proteininin ifadesini ve endosit oranını belirlemeyi. Bu teknikler sinirbilim araştırmalarında transmembran protein dinamiklerini incelemek için uygulanabilir.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet