Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Kriyojelasyon kullanılarak elastik 3D makro gözenekli mikrokriyojellerin üretilmesinin genel amacı, enjekte edilebilir rejeneratif tedaviyi ve in vitro yüksek verimli ilaç taramasını kolaylaştırmaktır. Bu video, çok yönlü 3D mikro dokuların üretilmesi ve bunların rejeneratif tedavi ve ilaç taramasına uygulanması için protokolleri sunmaktadır. Rejeneratif tedavi tekniği, bir yara bölgesine enjeksiyondan sonra kök hücre tutma, hayatta kalma ve terapötik işlevleri iyileştirir.

İlaç taraması, kullanım kolaylığı ve yüksek verimli tarama potansiyeli nedeniyle de geliştirilmiştir. Genel olarak, 3D kültürüne yeni başlayan kişiler, karmaşık protokoller nedeniyle mücadele eder. Bu teknik, 3D kültürü basitleştirir ve araştırmacılara ortaya çıkan 3D mikro dokular üzerinde daha fazla kontrol sağlar.

Bu prosedürlerin gösterilmesine yardımcı olmak, laboratuvarımızdan dört yüksek lisans öğrencisi olan Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian ve You Zhifeng olacaktır. Lazer kazımadan kalan kalıntıları temizlemek için PMMA mikroşablon dizisi çiplerini deiyonize suyla yıkayın. Ardından, mikroşablon dizisi çiplerini 60 santigrat derecede kurutun.

Daha sonra, kurutulmuş cipsleri dörtlü gruplar halinde bir plazma temizleyicide işlemden geçirin. İlk olarak, vakum pompasını iki dakika çalıştırın. Ardından, çiplerin hidrofilikliğini artırmak için üç dakika boyunca 18 watt RF gücü kullanın.

Şimdi, her beş cips için bir mililitre jelatin öncü çözeltisi yapın. Jelatini 60 derecelik bir su banyosunda çözün ve çözeltiyi buz üzerinde beş dakika inkübe edin. Hafifçe soğutulduktan ancak yine de sıvı hale geldikten sonra, glutaraldehiti jelatin öncü çözeltisine %0.3'lük bir nihai konsantrasyona kadar iyice karıştırın.

Şimdi, her bir çipin üst yüzeyine 200 mikrolitre hazırlanmış çözelti pipetleyin. Çözeltiyi bükülmüş bir cam çubuk kullanarak talaşların üzerine eşit olarak dağıtın. Ardından, çözelti yüklü dizi çiplerini kriyojelasyon için 20 saat boyunca eksi 16 santigrat derece dondurucuya hemen aktarın.

Ertesi gün, bir liyofilizatörü yaklaşık 30 dakika boyunca eksi 40 santigrat dereceye kadar soğutun. Ardından, dizi çiplerini yükleyin ve bunları bir vakum altında iki saat boyunca liyofilize edin. Buz bu koşullar altında yücelecek ve talaşlar daha sonra kullanıma hazır olacaktır.

Cipslerden tek tek mikrokriyojelleri hasat ederek başlayın. Fabrikasyon mikrokriyojel dizi çipini, fabrikasyon PDMS ejektör pimi dizisinin üzerine yerleştirerek başlayın. Her mikrokriyojeli bir ejektör pimi ile hizalayın.

Ardından, mikrokriyojelleri kuyularından çıkarmak için mikrokriyojel dizi çipini diziye bastırın. Şimdi, çıkarılan mikrokriyojelleri bir su banyosuna toplayın ve bir hücre süzgeci yardımıyla toplayın. Tüm mikrokriyojelleri tek bir çipten toplamak için bir süzgeç kullanın.

Daha sonra, mikrokriyojelleri sodyum borohidrür ile buz üzerinde yıkayın. Çapraz bağlı olmayan aldehit kalıntılarının yaklaşık 20 dakika söndürülmesine izin verin. Daha sonra sodyum borhidrürü atın ve mikrokriyojelleri beş mililitre deiyonize su ile 15 dakika yıkayın.

Devam etmeden önce toplam üç ila beş su yıkama yapın. Mikrokriyojelleri son su yıkamasından çıkardıktan sonra, hücre süzgecinden 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için cımbız kullanın. Her bir mikrokriyojel koleksiyonu bir küme oluşturur.

Şimdi, her bir mikrokriyojel kümesine 50 ila 70 mikrolitre deiyonize su ekleyin ve tabağı kapatın. Ardından, yığılmış mikrokriyojelleri düzleştirmek için tabağa hafifçe vurun. Ardından, mikrokriyojelleri eksi 20 santigrat derecede dört ila 16 saat dondurun.

Daha sonra, onları daha önce olduğu gibi iki saat boyunca liyofilize edin. Bir sonraki adım, 3D mikro dokuları yapmaktır. İlk olarak, mikrokriyojelleri sterilize edin.

Daha sonra, hücreleri tripsin ile hasat edin, yoğunluklarını ölçün ve büyüme ortamında mililitre başına sekiz milyon hücrede yeniden süspanse edin. Daha sonra, her bir mikrokriyojel kümesine 60 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. Bulaşıkları nemlendirilmiş bir odada tutun ve hücrelerin jeller tarafından emilmesi için iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, her yemeğe iki mililitre kültür ortamı ekleyin ve ortamı her gün değiştirerek kültüre devam edin. İki gün içinde 3 boyutlu mikro dokular oluşmuş olacak. 3D mikro dokuları bir fareye enjekte etmek için, önce bunları beş mililitrelik bir pipete aktarın ve ardından kültür ortamını filtrelemek için bir hücre süzgecine yükleyin.

Ardından, 3D mikro dokuları% 15'lik bir jelatin çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Hayvanı implantasyon için hazırladıktan sonra, mikro dokuları intramüsküler olarak gracilis kasının üç yerine enjekte edin. Her enjeksiyon, 150 mikrolitre çözelti içinde 150 mikrokriyojel içermelidir.

23 gauge iğneli bir mililitrelik şırınga kullanın. Çip üzerinde hücre kültürü için mikrokriyojel dizisini monte ettikten sonra, bunları ıslanmadan önceden ısıtılmış bir nem odasına dikkatlice yerleştirin. Daha sonra, üç mikrolitre iyice karıştırılmış hücre süspansiyonunu doğrudan her bir mikrokriyojel kuyucuğuna dikkatlice ayırın.

Solüsyonu çıkarmadan önce pipet ucunun mikrokriyojelin yüzeyine hafifçe temas etmesine izin verin. Periferik kuyuları tohumlamayın. Kuyuları yükledikten sonra, her kuyucuğa 10 mikrolitre seçici ortam ekleyin ve 96 kanallı bir sıvı dağıtıcı kullanarak buharlaşmayı yavaşlatmak için çevresel kuyulara ortam ekleyin.

Ardından, 3D mikro dokular oluşturmak için cipsleri 24 saat boyunca nem odasında kültürleyin. Ertesi gün, 96 kanallı sıvı dağıtıcıyı kullanarak, DMSO kontrolleri de dahil olmak üzere 384 kuyucuğun tümünün eklenmesini tamamlamak için dört kez konsantrasyon gradyanında her bir oyuğa 10 mikrolitre ilaç ekleyin. Ardından, 24 saat boyunca kültüre devam edin.

24 saatlik ilaç tedavisinden sonra, her bir oyuğa dört mikrolitre resazurin stok çözeltisi ekleyin ve plakayı iki saat inkübe ederek hücrelerin resazurini metabolize etmesine izin verin. Hücrelerin resazurin metabolizmasını test etmek için bir plaka okuyucu kullanın. Hasat edilen jelatin mikrokriyojeller önceden tanımlanmış şekil ve boyutlara sahipti.

SEM ile yapılan analiz, mikrokriyojellerin 30 ila 80 mikron aralığında gözenek boyutlarına sahip birbirine bağlı makro gözenekli yapılar içerdiğini gösterdi. Jelatin mikrokriyojellerin enjekte edilebilirliği, enjeksiyon sonrası kültürlenerek kantitatif olarak değerlendirildi. Mililitre başına 1.000, klinik olarak kabul edilebilir 10 newton kuvvetinden altı newton daha az enjekte edildi.

Mikrokriyojellerdeki kök hücreler, beş günlük kültür boyunca enjeksiyondan sonra yüksek canlılık ve büyük proliferatif kapasiteyi korudu. Bu tür hücreler kullanılarak, fare uzuv iskemi modeli terapötik olarak tedavi edildi ve iskemik uzuvların fizyolojik durumu ameliyattan 28 gün sonra incelendi. 100.000 kök hücre ile mikrodoku tedavisi, uzuv kurtarmayı iyileştirdi.

Farelerin sadece% 25'i 28 gün sonra spontan ayak parmağı amputasyonu gösterdi. Farklı bir uygulamada, yüksek verimli ilaç testi için 3D mikrodoku dizisi kullanıldı. Hepatosellüler karsinom hücreleri doksorubisin ile tedavi edildi ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri hücreleri IMMLG-8439 ile tedavi edildi.

Her iki durumda da, 3D kültürleme ile ilaç direnci arttırıldı. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro yüksek verimli ilaç taraması için enjekte edilebilir rejeneratif tedavi veya çip üstü 3D hücre kültürü dizileri kullanılarak çip dışı 3D kültür için elastik 3D mikro gözenekli mikrokriyojellerin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, hücre bazlı rejeneratif tedavi ve ilaç taraması alanındaki araştırmacıların 3D hücre kültüründen yararlanmalarının önünü açtı ve böylece her iki araştırma alanını da ilerletti.

Glutaraldehit ve sodyum borhidrür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu giysiler giymek ve laboratuvar başlığı altında çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.