Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Bu prosedürün genel amacı, kordon kanı kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden kondrojenik peletler üretmektir. Bu protokolle, nispeten büyük miktarda kondrojenik pelet üretebiliriz. Üretilen kondrojenik peletler, kıkırdağın doğasını daha iyi anlamamızı sağlamak için çalışmalar veya hastalık modellemesi, ilaç taraması ve tıp araştırmacısı için kullanılabilir.

Geçen yıl insan kıkırdağı tamir etmekte gecikti. Bu nedenle kıkırdak dejenerasyonu mutlaka konservatif tedavi ile tedavi edilmelidir. Sınırsız kendini yenileme yeteneği ve çoklu etki ile insan iPSC'leri, kıkırdak onarımı için yeni yedek hücre kaynağı olarak vurgulanmıştır.

Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri olan Eugene Nam ve Arie Alice Ream olacak. Protokole başlamak için, kan hücrelerini 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın ve bir hemositometre kullanarak sayın. Beşinci hücrelere üç kez 10 tane hazırlayın ve oda sıcaklığında 515 kez G'de beş dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı emme yoluyla atın ve hücreleri 0.5 mililitre kan hücresi ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, hücreleri kaplanmamış, 24 oyuklu bir plaka üzerindeki bir kuyuya aktarın ve üreticinin tavsiyelerine uyarak Sendai virüsü karışımını ekleyin. Plakayı 1, 150 kez G ve 30 santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, hücreleri gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, transüde hücrelerini iyi kodlanmış bir matrise aktarın. Plakayı santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, bir mililitre iPSC ortamı ekleyin ve hücreleri koruyun. Ortamı günlük olarak değiştirin ve yeni iPSC ortamıyla değiştirin. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri veya HIPSC'leri koruyun.

Ortamı günlük olarak değiştirin, taze temel sekiz veya E8 ortamı ile değiştirin. 100 mililitre ve E8 ortamında vitronektin kodlu bir vitronektin ila 6. HIPSC'ye iki kez 10 hazırlayın. Daha sonra, E8 ortamını kültür kabından çıkarın ve hücreleri steril fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın.

Bir milimoloz EDTA'nın bir mililitresini ekleyin ve tabağı iki dakika inkübe edin. Daha sonra hücreleri üç mililitre E8 ortamı ile toplayın ve bunları yeni bir 15 mililitre konik tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 250 kez G'de iki dakika santrifüjleyin.

Hücre damağını bozmadan süpernatanı aspire edin ve hücreleri beş mililitre E8 ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri bir hemositometre ile saydıktan sonra, her 100 milimetrelik Petri kabı için iki kez 10 kez 6. hücreleri hazırlayın. Hazırlanan hücreleri, 10 mikromolar sıra ilişkili karnaz veya kaya inhibitörü ile 10 mililitrelik bire bir E8 ve EB ortamı karışımında yeniden askıya alın.

Toplama için hücreleri gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, toplanan EB'leri pipetleme ile hasat edin. Süpernatanı çıkarın ve EB'leri 10 mililitre taze E8 ortamında yeniden askıya alın.

Oluşturulan EB'leri beş gün boyunca büyütün ve yeni E8 ortamıyla günlük değişiklikler yapın. Daha fazla olgunlaşma için kültür ortamını E7 ortamına değiştirin. EB'leri beş gün daha 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutun ve taze E7 ortamı ile günlük ortam değişiklikleri yapın.

100 milimetrelik bir tabağa altı mililitre% 1 jelatin ekleyin ve tabağı 30 dakika inkübe edin. Jelatini çıkarın ve kullanmadan önce bu kabı iki ila üç saat tamamen kurulayın. EB'leri 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.

EB'lerin konik borunun dibine çökmesine izin verin. EB'leri rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın. Daha sonra, EB'leri 10 mililitre önceden ısıtılmış shilbecco'nun modifiye edilmiş eşit ortamı veya DMEM'de% 20 fetal bulbing serumu veya FBS ile yeniden askıya alın.

EB'leri jelatin kaplama 100 milimetrelik tabağa aktarın. 10 mikromolar kaya inhibitörü ekleyin. Hücreleri yedi gün boyunca inkübe edin ve koruyun.

Kaya inhibitörü eklemeden ortamı her gün değiştirin. Kültür ortamını tabaktan aspire edin. Hemen tabağa bir mililitre bir milimolar EDTA uygulayın ve hücreleri iki dakika inkübe edin.

Daha sonra,% 20 FBS ile beş mililitre DMEM kullanarak hücreleri hasat edin ve bunları yeni bir 15 mililitre konik tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 250 kez G'de iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti% 20 FBS ile 10 mililitre DMEM'de yeniden süspanse edin.

40 mikrometrelik bir hücre süzgeci kullanarak hücre kümelerini filtreleyin ve atın ve tek hücreleri hasat edin. Bir hemositometre kullanarak tek hücreleri sayın. Hücreleri santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve 300 mikrolitre kondrojenik farklılaşma ortamı veya CDM ile 15 mililitrelik konik bir tüpte pelet başına 10 ila beşinci hücreye üç kez tohumlayın. Pelet oluşumu için, hücreleri santrifüjleyin, ardından hücreleri gece boyunca kuluçkaya yatırın. Üç gün içinde, peletler düzleştirilmiş küresel morfolojiler sergileyecektir.

Peletleri 21 gün boyunca koruyun. Gömmeden önce parafini 58 santigrat derecede hazırlayın ve eritin. Peletleri 1,5 mililitrelik bir tüpte oda sıcaklığında iki saat boyunca bir mililitre% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.

Kasetin üzerine bir kat gazlı bez yerleştirin ve sabit peletleri bir pipet kullanarak aktarın. Gazlı bezi katlayarak ve kaset kapağını kapatarak peletin üzerini örtün. 100 mililitre% 70 etanolde dehidrasyonu başlatın.

Peletleri %80 ve %95 etanol içinde sıralı sonlandırma yıkamaları yoluyla kurutun. Peletlere 10 dakika boyunca% 100 etanole aktarın. Temizlemek için, çözeltiyi 10 dakika boyunca 100 mililitrelik bire bir etanol ve ksilen karışımı ile değiştirin.

Daha sonra, bire bir çözeltiyi 10 dakika boyunca bir ila iki etanol ve ksilen karışımı ile değiştirin. Peletleri %100 ksilen içinde inkübe ederek kalan etanolü temizleyin. Parafin infiltrasyonu için, peletleri sıralı ksilen ve parafin karışımlarında inkübe edin.

Tüm parafin sızma işlemini 58 santigrat derecede gerçekleştirin. Peletleri 100 mililitre iki ila bir ksilen ve parafin karışımında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, çözeltiyi 100 mililitre bire bir ksilen ve parafin karışımı ile değiştirin ve 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra çözeltiyi 100 mililitre bir ila iki ksilen ve parafin karışımı ile değiştirin ve 30 dakika inkübe edin. Son sızma için, peletleri %100 parafinin ilk banyosuna aktarın ve peleti iki saat inkübe edin. Peletleri %100 parafinin ikinci banyosuna aktarın ve gece boyunca 58 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, peletleri nazikçe bir kalıba aktarmak için cımbız kullanın. Parafin dağıtıcısından kalıba parafin ekleyin. Parafini dört santigrat derecede 30 dakika katılaştırın.

Bölümleri yedi mikrometrede dilimleyin ve bölümleri slaydın üzerine aktarın. Slaytların gece boyunca kurumasını bekleyin ve slaytları kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın. Farklılaşmadan önce, iPSC kolonileri genişletildi.

Genişletilmiş iPSC'ler, farklılaşmayı başlatmak için EB'ler olarak birleştirildi. Üretilen EB'ler, büyüme hücrelerini indüklemek için jelatin kaplı kaplara bağlandı. 21 günlük farklılaşmadan sonra, küçük boncuk benzeri kondrojenik peletler elde edildi ve daha fazla karakterizasyon için kullanıldı.

Kondrojenik peletlerin kalitesi 21. günde histolojik olarak değerlendirildi ve pozitif kontrol olarak BMSC kondrojenik peletler kullanıldı. Farklılaşmış krondrositler tarafından salgılanan ECM proteinlerinin birikimi, Toluiyot mavisi boyamasında Alcian mavisi ile doğrulandı. CDMC HIPSC'lerden üretilen kondrojenik peletler, CBMSC HIPC'lerden türetilen peletlerden daha yüksek COL2A1 eksprese etti.

Fibrotik kıkırdak için bir belirteç olan kollajen tip birin ekspresyonu, CBMC HIPSC türevi peletlerde COL2A1 ekspresyonuna kıyasla daha düşüktü. 21. gün kondrojenik peletlerde kıkırdak hücre dışı matriks proteinlerinin gen ekspresyonu gerçek zamanlı PCR ile doğrulandı. CBMC HIPSC'den türetilen peletlerin aggracan ekspresyonu, BMSC'den türetilen peletlere benzerdi.

Kordon kanı mononükleer hücreden türetilmiş iPSC'lerin krondrojenik peletlere farklılaşması için ayrıntılı bir yöntem sağladık. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki ay içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, iPSC'lerden kondrojenik peletlerin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.