Name: Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Keşfedin kordon kanından elde edilen iPSClerden kondrojenik pellet üretim protokolünü. Bu yöntem kıkırdak onarımı ve rejeneratif tıp araştırmaları için ölçeklenebilir hücre kaynağı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Sağlık Bakanlığı, Refah ve Aile İşleri Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti (HI16C2177) tarafından yapılan Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge projesinin bir hibesi tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, Katolik Üniversitesi&#39;nin kurumsal gözden geçirme kurulu (KC12TISI0861) tarafından onaylandı. Yeniden programlama için kullanılan CBMC&#39;ler doğrudan Seul St. Mary Hastanesi Kordon Kan Bankası&#39;ndan alındı. 1. iPSC&#39;lerden kondrojenik türev <ol><li> CBMC-iPSC üretimi <ol><li> Önceki çalışmamızda gösterilen protokolü kullanarak CBMC-hiPSC&#39;ler üretin 23 . </li><li> 15 mL konik tüp içinde kan hücrelerini toplayın ve bir hemositometre kullanarak sayın. </li><li> 3 x 10 5 hücre hazırlayın ve 515 xg ve RT&#39;de 5 dakika süreyle santrifüjleyin. Süpernatantı emilerek boşaltın ve hücreleri 0.5 mL kan hücresi ortamında tekrar süspanse edin. </li><li> Hücreleri, kaplanmamış 24 delikli bir tabakın bir çukuruna aktarın ve üreticinin tavsiyelerine göre Sendai virüs karışımını ilave edin. </li><li> Plakayı 1150 xg ve 30 ° C&#39;de 30 dakika santrifüjleyin. </li><li> kıçtaEr santrifüjleme, hücreleri gece boyunca (O / N) 37 ° C&#39;de% 5 C02&#39;de inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, transduced hücreleri bir matris kaplı kuyuya aktarın. 30 ° C&#39;de 1150 xg&#39;de plakayı santrifüjleyin. </li><li> Santrifüjden sonra, süpernatantı çıkarın, 1 mL iPSC ortamı ilave edin ve% 5 CO 2&#39;de 37 ° C&#39;de hücre O / N&#39;yi muhafaza edin. </li><li> Ekli hücreleri 37 ° C&#39;de ve% 5 CO 2&#39;de muhafaza edin. Ortamı günlük olarak değiştirin, onu yeni iPSC ortamı ile değiştirin. NOT: Koloniler, transdüksiyon sonrası 14-21. Günde ortaya çıkacaktır. </li></ol></li><li> EB üretimi <ol><li> HiPSC&#39;leri 37 ° C&#39;de ve% 5 CO 2&#39;de muhafaza edin. Ortamı günlük olarak değiştirin ve onu yeni Temel 8 (E8) orta ile değiştirin. </li><li> E8 ortamında, vitronektin kaplı, 100 mm&#39;lik bir çanakta 2 x 10 6 hiPSC hazırlayın. </li><li> Kültür çanak E8 orta çıkarın ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. </li><li> 1 ekleML 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile inkübe edin ve 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de 2 dakika inkübe edin. </li><li> Hücreleri 3 mL E8 ortamı ile hasat edin ve yeni bir 15 mL konik tüp aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 250 xg&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin ve hücreleri 5 mL E8 ortamında tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Hemocytometer kullanarak hücreleri sayın ve her 100 mm Petri kabı için 2 x 10 6 hücre hazırlayın. Hazırlanan hücreleri 10 uM ko-ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü ile E8 ve EB ortamı (1: 1) içeren 10 mL&#39;lik bir karışımda tekrar süspanse edin. </li><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de agregasyon için hücreleri O / N inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, pipetleme yapılarak toplu EB&#39;leri toplayın. Hücreleri 250 xg&#39;de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve 10 mL taze E8 ortamı içinde EB&#39;leri tekrar süspanse edin. </li><li> Oluşturulan EB&#39;leri 5 gün boyunca büyütün, fres ile günlük değişiklikler yapınH E8 orta. Daha fazla olgunlaşma için, kültür ortamını E7 ortamına değiştirin. 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2&#39;de 5 gün boyunca EB&#39;leri muhafaza edin, taze E7 ortamıyla günlük orta değişimler yapın. NOT: E7 orta FGF2 içermeyen E8 ortamıdır. </li></ol></li><li> EB&#39;lerden büyümekte olan hücre indüksiyonu <ol><li> 100 mm&#39;lik bir tabağa 6 ml% 1 jelatin ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 CO 2&#39;de inkübe edin. </li><li> Jelatı alın ve kullanmadan önce 2-3 saat boyunca tamamen kurutun. </li><li> EB&#39;leri 50 mL&#39;lik bir konik tüpe aktarın. EB&#39;lerin konik borunun altına yerleşmesine izin verin. EB&#39;leri rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın. </li><li> EB&#39;leri 10 mL Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 20 fetal sığır serumu (FBS) ile tekrar süspanse edin. EB&#39;leri jelatin kaplı 100 mm&#39;lik tabağa aktarın. 10 uM ROCK inhibitörü ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de 7 gün boyunca hücreleri inkübe edin ve muhafaza edin. Temayı değiştirDiok her gün ROCK inhibitörü eklemeden. </li></ol></li><li> Kondrojenik pelet oluşumu <ol><li> Çanak kültür ortamı aspire ve PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. </li><li> 1 ml 1 mM EDTA uygulayın ve 37 ° C&#39;de inkübe edin ve 2 dakika süreyle% 5 CO 2 . </li><li> % 20 FBS ile 5 mL DMEM kullanarak hücreleri hasat edin ve yeni bir 15 mL konik tüp aktarın. </li><li> Hücreleri 250 xg ve RT&#39;de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve% 20 FBS ile 10 mL DMEM içinde pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 40 μm hücre süzgeç kullanarak filtre ve hücre kümeleri atın ve tek hücreleri hasat. Hemocytometer kullanarak tekli hücreleri sayın. </li><li> Hücreleri 250 xg ve RT&#39;de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve her pelet için 3 x 10 5 hücre 300 mL&#39;lik kondrojenik diferansiyasyon ortamı (CDM) ile 15 mL&#39;lik konik bir tüp içine alın. </li><li> Pelet oluşumu için, hücreleri 5 dakika süreyle santrifüjleyin.680 xg ve RT. NOT: Peletler, kondrojenik pelletlerin farklılaşması sırasında 15 mL konik tüplerde muhafaza edilir. </li><li> Hücreleri gece boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de inkübe edin. </li><li> CDM&#39;yi 2-3 günde bir değiştirin. Peletler 3 gün içinde düzleştirilmiş sfero morfolojileri sergileyecektir. Pelletleri, 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de 21 gün boyunca muhafaza edin. </li></ol></li></ol> 2. Boyama ile Kondrojenik Pellet Karakterizasyonu <ol><li> Kondrojenik gömme <ol><li> Gömülmeden önce, 58 ° C&#39;de parafin hazırlayın ve eritin. </li><li> 1,5 mL&#39;lik bir tüpte oda sıcaklığında 2 saat boyunca 1 mL&#39;lik% 4&#39;lük paraformaldehit içinde topakları düzeltin. Dikkat: Paraformaldehit oldukça toksiktir. Göz, cilt veya müköz zarlarla temasından kaçının. Pozlamayı en aza indirin ve hazırlarken teneffüs etmeyi önleyin. </li><li> Kasete bir kat tül yerleştirin ve sabit peletleri bir pipet yardımıyla aktarın. Topağı katlayarak örtün.E gazlı bez ve kaset kapağını kapatın. </li><li> 100 mL% 70 etanol (EtOH) içinde iki kez, her biri 10 dakika dehidrasyon başlatın. Peletleri% 80 ve% 95 EtOH içinde sıralı 10 dakikalık yıkamalarla kurutun. </li><li> Pelletleri 10 dakika boyunca% 100 EtOH&#39;a aktarın. Taze EtOH ile üç kez tekrarlayın. </li><li> &quot;Temizleme&quot; için, çözeltiyi 100 mL, 1: 1 EtOH ve ksilen karışımı, ardından her biri 10 dakika süreyle 1: 2 EtOH ve ksilen karışımı ile değiştirin. Kalan EtOH&#39;yı, her biri 10 dakika süreyle% 100&#39;lük ksilen içerisinde iki kez kuluçkalayarak temizleyin. </li><li> Parafin infiltrasyonu için, peletleri sıralı ksilen ve parafin karışımlarında inkübe edin. Bütün parafin sızma işlemini 58 ° C&#39;de gerçekleştirin. Pelletleri 100 mL, 2: 1 oranında ksilen ve parafin karışımı içinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> Çözeltiyi 100 mL 1: 1 ksilen ve parafin karışımıyla değiştirin ve 30 dakika inkübe edin. </li><li> Çözeltiyi 100 mL 1: 2 ksilen ve parafin karışımıyla değiştirin ve 30 dak. </li><li> Nihai sızma için, peletleri ilk% 100 parafin banyosuna aktarın ve 2 saat inkübe edin. </li><li> Peletleri% 100 parafinin ikinci banyosuna aktarın ve O / N, 58 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, cımbız kullanarak pelletleri bir kalıba yavaşça aktarın. Parafin dağıtıcıdan kalıba parafin ekleyin. Parafin, 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle katılaştınlır. </li><li> Kesitleri 7 μm&#39;de kesin ve kesitleri slaydın üzerine aktarın. Slaytların bir gece kurumasını bekleyin ve kullanıma hazır oluncaya dek slaytları oda sıcaklığında saklayın. </li></ol></li><li> Slayt hazırlığı <ol><li> Slaytları, 100 mL,% 100,% 90,% 80 ve% 70 EtOH ile sırayla 5 dakika boyunca hareket ettirerek çözünmesini sağlayın. </li><li> Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve musluk suyu ile 5 dakika boyunca durulayın. </li></ol></li><li> Alcian blue lekesi <ol><li> Slaytları 30 dakika boyunca 50 mL% 1 alc blue solüsyonunda inkübe edin. DEĞİLE: Alcian blue,% 3 asetik asit solüsyonunda seyreltilir. Asetik asit kullanarak pH&#39;ı 2.5&#39;e ayarlayın. </li><li> Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve musluk suyu ile 2 dakika boyunca durulayın. </li><li> Slaytları deiyonize suda (DW) durulayın ve 2 dakika nükleer hızlı kırmızı solüsyonla kontrastlayın. </li><li> Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve 1 dakika musluk suyu ile durulayın. </li><li> 2.3.5) Slaytları kurutun ve adımları 2.6&#39;da takın. </li></ol></li><li> Toluidin mavisi boyama <ol><li> Slaytları 4 dakika boyunca 50 mL tolüidin mavisi solüsyonunda inkübe edin. </li><li> Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve musluk suyu ile 5 dakika boyunca durulayın. </li><li> Adım 2.6&#39;da sallamaları gidermek ve takmak için ilerleyin. </li></ol></li><li> İmmunohistokimyasal boyama <ol><li> Slaytları, endojen peroksidaz blokajı için 15 dakika boyunca% 3 H202&#39;de inkübe edin. </li><li> Tris-bu ile 1: 100 oranında seyreltilmiş 200 uL birincil antikor uygulayın (anti-COL1A1 ve -COL2A1)Slaytlara% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 5 normal keçi serumu (TBS) içeren fferled salin (TBS) ve 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve her biri 5 dakika boyunca üç kez% 0.1 polisorbat 20 (TBST) içeren 50 mL TBS ile yıkayın. </li><li> Slaytlara, 200 mcL sekonder antikor (keçi anti-tavşan IgG antikoru, 1: 200 oranında TBS içinde seyreltilmiş TBS ve% 5 NGS) uygulayın ve oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. </li><li> Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve 50 mL, her biri 5 dakika ile üç kez yıkayın. </li><li> Sinyal amplifikasyonu için, HRP-konjuge streptavidin solüsyonunu slaytlara uygulayın ve 10 dakika inkübe edin. </li><li> Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve 50 mL, her biri 5 dakika ile üç kez yıkayın. </li><li> DAB-peroksidaz substrat solüsyonunu karıştırın, her slayta 200 μL solüsyon uygulayın ve 1 dakika inkübe edin. </li><li> Slaytları bir cam kavanoz içine yerleştirin ve musluk suyu ile 5 dakika boyunca durulayın. </li><li> Counterstain1 dakika boyunca Mayer&#39;in hematoksilen ile. </li><li> Slaytları DW ile yıkayın. </li><li> Adım 2.6&#39;da sallamaları gidermek ve takmak için ilerleyin. </li></ol></li><li> Dehidrasyon ve montaj <ol><li> Slaytları 100 mL% 70,% 80,% 90 ve% 100 EtOH, 30 saniye boyunca sırayla hareket ettirerek suyunu alın. </li><li> Slaytları her biri 1 dakika süreyle iki değişik ksilende daldırın. </li><li> Lamelleri 50 mcL montaj solüsyonu ekleyin ve slaytlar üstüne koyun. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol CBMC&#39;lerden başarıyla hiPSC üretti. Yamanaka faktörleri 24 içeren bir Sendai viral vektörü kullanarak CBMC&#39;leri hiPSC&#39;ye yeniden programladık. Farklılaşmada üç vaka kullanıldı ve tüm deneyler bu protokolü kullanarak kondrojenik pelletleri başarıyla üretti. HiPSC&#39;lerin kondrositlere 25 , 26 , 27 , 28 farklılaşması için protokoller çok sayıda ç...

HİPSC&#39;lerin kullanımı, çeşitli hastalıkların uyuşturucu taraması ve mekanik çalışmaları için yeni bir stratejiyi temsil etmektedir. Rejeneratif bir perspektiften hiPSC&#39;ler, eklem kıkırdağı 1 , 2 gibi sınırlı iyileştirme kabiliyetine sahip hasarlı dokuların değiştirilmesi için potansiyel bir kaynaktır. Doğal eklem kıkırdağının rejenerasyonu birkaç on yıl için zor olmuştur. Artiküler kıkırdak, yumuşak beyaz bir dokudur ve kemiklerin ucunu sürtünmeden korur. Bununla birlikte, zarar gördüğünde kendini yenilemek neredeyse imkansız kılan sınırlı rejeneratif kabiliyete sahiptir. Bu nedenle, kıkırdak yenilenmesine odaklanan araştırma, onlarca yıldır devam etmektedir. Daha önce, in vitro olarak kondrojenik soya diferansiyasyon, genellikle diz eklemi 3&#39;ten izole edilen BMSC&#39;ler veya doğal kondrositler ile gerçekleştirildi. BitmişKondrojenik potansiyelleri, BMSC&#39;ler ve doğal kondrositler, kondrojenezde kullanımlarını destekleyen çok sayıda avantaja sahiptir. Bununla birlikte, sınırlı genişleme ve kararsız fenotip yüzünden, bu hücreler eklem kıkırdak defekti rekonstrüksiyonu konusunda çeşitli sınırlamalarla karşı karşıya kalmaktadır. In vitro kültür koşulları altında, bu hücreler 3-4 geçitten sonra kendi özelliklerini kaybetme eğilimindedir ve bu da sonuçta onların farklılaşma yeteneklerini etkiler 4 . Ayrıca, doğal kondrositler durumunda, bu hücreleri elde ederken diz ekleminde ek hasar kaçınılmazdır. BMSC&#39;lerin veya doğal kondrositlerden farklı olarak, hiPSC&#39;ler in vitro olarak sınırsız olarak genişleyebilir. Uygun kültür koşullarıyla, hiPSC&#39;lerin kondrojenik farklılaşma için yedek bir kaynak olarak büyük potansiyeli vardır. Bununla birlikte, hiPSC&#39;lerin içsel özelliklerini değiştirmek zordur 5 . Dahası, birkaç karmaşık in vitro süreç gerektirirPs hiPSCs&#39;in kaderini belirli bir hücre türüne yönlendirmek için. Bu komplikasyonlara rağmen, yüksek kendiliğinden yenilenme kabiliyetleri ve kondrositleri de içeren hedeflenen hücrelere ayırma kapasiteleri nedeniyle hiPSC&#39;lerin kullanımı hala önerilmektedir. Kondrojenik farklılaşma, genellikle MSC benzeri progenitör hücreler kullanılarak pelet kültürü veya mikromüzk kültürü gibi üç boyutlu kültür sistemleri ile yapılır. HiPSC kullanıyorsa, MSC benzeri öncü hücreler üretmek için protokol mevcut protokollerden farklıdır. Bazı gruplar, fenotipi doğrudan MSC benzeri hücrelere dönüştürmek için hiPSC&#39;lerin tek katmanlı kültürü kullanır 7 . Ancak, çoğu çalışma MSC 8 , 9 , 10 , 11&#39;e benzeyen hücre büyümesi üretmek için EB&#39;ler kullanır. Kondrojayı indüklemek için çeşitli büyüme faktörleri kullanılır.Nesis. Genellikle, BMP ve TGFβ ailesi proteinleri tek başına veya kombinasyon halinde kullanılır. Farklılaşma, GDF5, FGF2 ve IGF1 12 , 13 , 14 , 15 gibi diğer faktörlerle de indüklenmiştir. TGFβ1&#39;in MSC 16&#39;da doza bağımlı bir tarzda kondrojenez uyarısı yaptığı gösterilmiştir. Diğer izotip ile karşılaştırıldığında, TGFβ3, TGFβ1, kıkırdak öncesi mezenşimal hücre yoğunlaşmasını arttırarak kondrojeneze neden olur. TGFβ3, mezenkimal hücre çoğalmasını önemli ölçüde arttırarak kondrojeneze neden olur17. Bununla birlikte, TGFβ3 araştırmacılar tarafından TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19&#39;dan daha sık kullanılır. BMP2, insan kondrojenik matris bileşenleri ile ilgili genlerin ekspresyonunu arttırırEklem kondrositlerinde in vitro koşullar altında 20 . BMP2, TGFβ proteinleri 21 ile kombinasyon halinde MSC&#39;lerde kıkırdak oluşumu için kritik olan genlerin ekspresyonunu arttırır. Ayrıca, BMP2&#39;nin Smad ve MAPK yolakları yoluyla TGFβ3&#39;ün etkisini sinerjik olarak arttırdığı gösterilmiştir 22 . Bu çalışmada CBMC-hiPSC&#39;ler düşük ekli bir Petri kabında EB ortamı kullanılarak EB&#39;lere toplandı. Gelişen hücreler, EB&#39;leri jelatin kaplı bir çanağa tutturarak indüklenmiştir. Hücreleri kullanarak kondrojenik farklılaşma pelet kültürü ile gerçekleştirildi. Hem BMP2 hem de TGFβ3 ile yapılan muamele, hücreleri yoğun bir şekilde yoğunlaştırdı ve kondrojenik pelet oluşumu için hücre dışı matris (ECM) protein birikimine yol açtı. Bu çalışma, CBMC-hiPSC&#39;leri kullanarak basit fakat etkin kondrojenik bir farklılaşma protokolünü önermektedir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Plastik</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Çanak</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Plaka</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Kornik Tüp</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Kornik Tüp</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Tek Kullanımlık Pipet</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tek Kullanımlık Pipet</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu Plaka</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü</td> <td>> < güçlü > Şirket < / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Açıklama< / güçlü</td></tr> <tr><td>> < güçlü > E8 Orta Malzemeler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DMEM / F12, HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11330-057</td><td>E8 Orta (500 mL)</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25080-094</td><td>E8 Orta (Konsantrasyon: 543 &mu; g / mL)</td></tr> <tr><td>Sodyum Selenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Orta&nbsp; (Konsantrasyon: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>İnsan Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 Ortamı (Kapanış: 10.7 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Temel FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Orta&nbsp; (Konsantrasyon: 100 ng/mL)</td></tr><tr><td>İnsan İnsülin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12585-014</td><td>E8 Ortamı (Konsantrasyon: 20 &mu; g / mL)</td></tr> <tr><td>İnsan TGF ve beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Orta (Konsantre: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Ortam&nbsp; (Devamı: 64 &mu; g / mL)</td></tr> <tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronektin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK İnhibitörü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Adı< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Açıklama< / güçlü></td></tr><tr><td><> Kalite Kontrol Malzemeleri< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Kapak Camı</td><td>Üstün</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>%4 Paraformaldihit</td><td>Tech & Yenilik</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Vektör Laboratuvarı</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Antikor</td><td>Milipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Antikor</td><td>Milipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Anti-TRA-1-81 Antikor Millipore MAB4381 630801 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4 Antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG (H + L) antikoru</td><td>Moleküler Prob</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan IgG (H + L) antikoru</td><td>Moleküler Prob</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Moleküler Prob</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Uzun süreli altın antifade reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>%4 Paraformaldihit</td><td>Tech & Yenilik</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Vektör</td><td>Laboratuvarı</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kollajen II antikoru</td><td>abcam ve nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Alcian mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil FCF Sigma</td><td>Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer hızlı kırmızı</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ksilen</td><td>Duksan</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Mayer'in hematoksilen çözeltisi</td><td>wako saf kimya endüstrileri</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VEKTÖR LABORATUVARLARI</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü Cam, Kaplamalı</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>İzoprilalkol</td><td>Milipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Dükkan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Sentez kiti</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td> Açıklama< / güçlü ></td></tr> <tr><td>< güçlü > Kondrojenik Farklılaşma Malzemeleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11885</td><td>Kondrojenik ortam bileşeni (500 mL)</td></tr> <tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P4333</td><td>Kondrojenik ortam bileşeni (Konsantre:% 1)</td></tr> <tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Kondrojenik medya bileşeni (Conc.: 64 &mu; g/mL)&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Kondrojenik ortam bileşeni (Konsantrasyon: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D</td><td>355-BM-050</td><td>Kondrojenik ortam bileşeni (Konsantrasyon: 100 ng / ml)</td></tr> <tr><td>Rekombinant Hman TGF-beta3</td><td>R& D</td><td>243-B3-002</td><td>Kondrojenik medya bileşeni (Konsantre: 10 ng / ml)</td></tr> <tr><td>KnockOut Serum Replasman Ömrü Teknolojileri</td><td></td><td>10828-028</td><td>Kondrojenik medya bileşeni (Konsantre:% 1)</td></tr> <tr><td>ITS + Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Kondrojenik medya bileşeni (Konsantre: %1)</td></tr> <tr><td>Deksametazon-Suda Çözünür &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Kondrojenik medya bileşeni (Konsantrasyon: 10 -7 M)</td></tr> <tr><td>GlutaMAX Ek Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>35050-061</td><td>Kondrojenik medya bileşeni (Konsantre:% 1)</td></tr> <tr><td>Sodyum piruvat çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>Kondrojenik medya bileşeni (Konsantre:% 1)</td></tr> <tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Kondrojenik medya Bileşen (40 & mu; g/ml)</td></tr></tbody></table>

kordon kanından oluşan İndüklü pluripotent kök hücrelerden kondrojenik pellet oluşumu

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan eklem kıkırdağı kendini tamir etme becerisine sahip değildir. Kıkırdak dejenerasyonu bu nedenle tedavi edici değil, konservatif tedaviler ile tedavi edilir. Halen hasar görmüş kıkırdağı ex vivo genişletilmiş kondrositler veya kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (BMSC) ile yenilemek için çaba sarf edilmektedir. Bununla birlikte, bu hücrelerin kısıtlı canlılığı ve istikrarsızlığı, kıkırdak yeniden yapılandırma alanındaki uygulamalarını sınırlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC&#39;ler), rejeneratif uygulamalar için yeni bir alternatif olarak bilimsel bir ilgi görmüştür. Sınırsız kendi kendini yenileme kabiliyeti ve çok potansiyeli ile hiPSC&#39;ler, kıkırdak onarımı için yeni bir yedek hücre kaynağı olarak vurgulanmıştır. Bununla birlikte, yüksek miktarda yüksek kaliteli kondrojenik pelet elde edilmesi, klinik uygulamaları için büyük bir zorluk oluşturmaktadır. Bu çalışmada, kondrojenik diferansiyasyon için embriyo gövdesi (EB) ile üretilmiş büyüme hücreleri kullanılmıştır. Başarılı kondrojenez PCR ile veD lekelenmesi alsi mavisi, toluidin mavisi ve kolajen tip I ve II&#39;ye karşı antikorlar (sırasıyla COL1A1 ve COL2A1). Kordon kanı mononükleer hücre kaynaklı iPSC&#39;lerin (CBMC-hiPSC&#39;lerin) kondrojenik peletlere diferansiyelleştirilmesi için ayrıntılı bir yöntem sunmaktayız.

Bu çalışmada, EB&#39;lerden büyümekte olan hücreleri indükleyerek CBMC-hiPSC&#39;lerden kondrojenik peletler oluşturduk. Kondrojenik farklılaşma, doğrulanmış yüksek pluripotensiteli CBMC-hiPSC&#39;ler kullanılarak indüklendi. Protokolümüzün basit bir şeması Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir . Farklılaştırmadan önce, iPSC kolonileri genişletildi ( Şekil 1B ). Genişletilmiş iPSC&#39;ler, farklılaşmayı başlatmak için EB&#39;ler olarak...

Burada, kordon kanı mononükleer hücre kaynaklı insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden kondrojenik farklılaşma için bir protokol önermekteyiz.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Bu prosedürün genel amacı, kordon kanı kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden kondrojenik peletler üretmektir. Bu protokol ile nispeten yüksek miktarda kondrojenik pelet üretebiliriz. Üretilen kondrojenik peletler; kıkırdağın doğasına ilişkin anlayışımızı geliştirmek için çalışmalarda, hastalık modellemede, ilaç taramasında ve tıp araştırmalarında kullanılabilir.İnsan kıkırdağının geçtiğimiz yıl onarımı gecikmiştir. Bu nedenle, kıkırdak dejenerasyonu konservatif tedavi ile tedavi edilmelidir. Sınırsız kendini yenileme özelliği ve multipotens ile insan iPSC'leri, kıkırdak onarımı için yeni bir hücre kaynağı olarak öne çıkmıştır.Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrenciler olan Eugene Nam ve Arie Alice Ream uygulamalı olarak gösterecekler. Protokole başlamak için, 15 mililitrelik konik bir tüpe kan hücreleri toplayın ve bunları bir hemositometre kullanarak sayın. 3 × 10⁵ hücre hazırlayın ve oda sıcaklığında 515 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatanı vakumla uzaklaştırın ve hücreleri 0,5 mililitre kan hücresi ortamında tekrar süspanse edin. Ardından, hücreleri kaplanmamış, 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna aktarın ve üretici önerilerini takip ederek Send

chondrogenic-pellet-formation-from-cord-blood-derived-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Mekanik stres, kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını indükleyebilir ve bozulmuş kıkırdağın onarımı için potansiyel bir terapötik yaklaşım sağlar. Merkezkaç gravitesi (CG) kullanarak adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) kondrojenik farklılaşmasını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. SOX9'un CG kaynaklı yukarı regülasyonu, kondrojenik fenotiplerin gelişmesine neden olur.

Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

Biz İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı lenfositi ve fibroblastlar ayırt etmek ve bir 3B cilt organoid oluşturmak gösterilmiştir bir protokol bu lenfositi ve fibroblastlar kullanarak öneriyoruz. Bu iletişim kuralı insanlaşmış fareler model oluşturma ek bir adım içerir. Burada sunulan teknik dermatolojik araştırma artıracaktır.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Mezenkimal kök hücrelerden üretilen yapay kıkırdak dokusunun implante edilmesiyle endokondral kemikleşme yoluyla kemik tedavisi, geleneksel tedavilerin dezavantajlarını aşma potansiyeline sahiptir. Hyaluronik asit hidrojelleri, in vivo kaynaşmış greftler arasında vaskülarizasyon ile entegre kemik oluşturmanın yanı sıra homojen olarak farklılaşmış kıkırdak greftlerinin ölçeklendirilmesinde etkilidir.

Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

Bu protokol, insan eklem kıkırdağından kondrositlerin, Fibronektin Adezyon Testinden türetilmiş Kondroprojenitörlerin (FAA-CP'ler) ve Göçmen Kondroprojenitörlerin (MCP'ler) izolasyonunu detaylandırır. Bu hücreleri izole etmek ve karakterize etmek için enzimatik sindirim, fibronektin yapışması ve migrasyon bazlı testleri kapsar.

Fibronektin Adezyonu ve Migrasyon Testi Kullanılarak Kondrosit ve Kondroprojenitörlerin İzolasyonu

Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Keşfedin kordon kanından elde edilen iPSClerden kondrojenik pellet üretim protokolünü. Bu yöntem kıkırdak onarımı ve rejeneratif tıp araştırmaları için ölçeklenebilir hücre kaynağı sağlar.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Daha fazla video keşfet