Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Bitki defensins patojenlere karşı bitki savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Etkili eylem (MOA) onların mod anlama antifungal ajanları olarak antifungal Bu peptidler kullanımı önemlidir için. Burada, Bu peptidler MOA kritik yönlerini incelemek için canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanmıştır.

Bu canlı hücre görüntüleme yönteminin genel amacı, mantar hücrelerinde antifungal bitki savunmalarının etki mekanizmalarının kritik yönlerini incelemektir. Gelişmiş konfokal mikroskopi tekniklerinin ortaya çıkmasıyla, canlı hücre görüntüleme, antifungal bitki savunmalarının etki modlarını incelemek için güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu teknolojiyi kullanarak, burada antifungal bitki savunmalarının etki modlarını anlamada kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olacak bir yöntem sunuyoruz.

Odak noktamız, bu peptitlerin mantar hücrelerine nasıl içselleştirildiği ve bu peptitlerin hücre organellerine nasıl lokalize olduğu veya sitoplazmada nasıl yayıldığıdır. Fusarium graminearum'un PH-1 suşunun konidiyal bir süspansiyonunu yapmak için, önce suşun kültürlerini tam ortam içeren plakalar üzerine ayarlayın. Onları beş gün boyunca 28 santigrat derecede kültürleyin.

Conidia üretmek için, beş günlük kültürün 10 milimetre çapında dört tapasını 50 mililitre karboksimetil selüloz ortamına aşılayın. Bu tapaları 28 santigrat derecede dört ila yedi gün boyunca 180 rpm'ye ayarlanmış bir döner çalkalayıcıda kültürleyin. Kültürler kırmızı bir renge sahip olduğunda, conidia oluşmuştur.

Conidia'yı bir süspansiyonda toplamak için, sıvı kültürü girdaplayın ve bir mililitresini iki mililitrelik bir filtrasyon malzemesinden iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne süzün. Süspansiyonu iki dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Ardından, peleti bir mililitre steril su ile yıkayın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın.

Ardından, peleti bir mililitre 2x SFM'de yeniden süspanse edin. Ardından, bir hemositometre kullanarak conidia'yı sayın ve süspansiyonun yoğunluğunu mililitre başına 100.000 conidia'ya ayarlayın. Bir Neurospora crassa konidiyal süspansiyon yapmak için, konidia'yı stok kültürlerinden Vogel'in agar ortamını içeren eğimli bir tüpe aktarın ve tüpleri beş gün boyunca sabit ışık altında oda sıcaklığında inkübe edin.

Beş gün sonra, bir aşılama döngüsü kullanarak az miktarda büyüyen kültürü, iki mililitre Vogel'in sıvı ortamını içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Conidia'yı döngüden karıştırdığınızdan emin olun. Ardından, süspansiyonu süzün, santrifüjleyin ve conidia peletini Vogel'in ortamında bir yıkama adımı olmadan yeniden süspanse edin.

Son olarak, son süspansiyonu mililitre başına 100.000 conidia'ya ayarlayın. Konfokal mikroskopi için bir mikrop hazırlığı yapmak için, 50 mikrolitre conidia süspansiyonunu 35 milimetrelik bir kültür kabına pipetleyin ve conidia'nın oda sıcaklığında üç ila altı saat çimlenmesine izin verin. Konfokal mikroskopi için, 50 mikrolitre konidiyal süspansiyonu 10 milimetrelik bir mikro kuyu cam tabanlı tabağa pipetleyin.

Daha sonra, önceden belirlenmiş minimum inhibitör konsantrasyonda, süspansiyona 50 mikrolitre floresan etiketli defensin ekleyin ve conidia'yı etiketli defensinlerle oda sıcaklığında 2,5 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, beş mikromolar nihai konsantrasyon için iki mikrolitre membran seçici boya FM4-64 ekleyin. Ardından, conidia'yı incelemeden önce kültürü oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Konfokal mikroskobu kurmak için beyaz ışık lazerini seçin. Rodamin etiketli defensinleri ve FM4-64 boyasını uyarmak için sırasıyla 488 nanometre ve 550 nanometre lazerleri kullanın. Bu lazerleri %1'lik bir yoğunluğa ayarlayın Ardından, algılama dalga boylarını rodamin etiketli defensin için 580 ila 700 nanometre ve FM4-64 boyası için 690 ila 800 nanometre olarak ayarlayın.

Şimdi görüntüleri toplayın. Hızlandırılmış görüntüleme için, cam tabanlı bir mikro kuyu kabına 50 mikrolitre konidiyal süspansiyon ekleyin. Daha sonra, mikrokuyu çanağını mikroskobun üzerine monte edin ve hücreleri düşük güçte bulun.

Ardından, 100x, 1.44 yağ hedefine geçin. DyLight550 etiketli savunmaları gözlemlemek için, lazer çizgisini uyarma için 550 nanometreye ve algılama için 560 ila 600 nanometreye ayarlayın. Ardından, tarama modunu xyzt olarak ayarlayın.

Ardından, Z konumunu, yakınlaştırmayı, görüntü yakalama sıklığını vb. gerektiği gibi ayarlayın. Şimdi, konidiyal süspansiyona, üç mikromoların minimum inhibitör konsantrasyonunda 50 mikrolitre florofor etiketli defensin ekleyin ve beş mikromolar nihai konsantrasyon için iki mikrolitre membran seçici boya FM4-64 ekleyin. Ardından, gerekirse optiği yeniden odaklayın.

Görüntüleri yakalamadan önce, buharlaşmayı önlemek için mikro kuyu kabına küçük parçalar halinde ıslak filtre kağıdı yerleştirin. Ardından, 2,5 saat boyunca her 3,5 dakikada bir görüntü yakalayarak işlem yapın. Medicago truncatula'dan iki defensin'in içselleştirilmesini ve hücre altı lokalizasyonunu izlemek ve karşılaştırmak için canlı hücre görüntülemesi yapıldı.

Kimyasal olarak sentezlenen rodamin etiketli defensin dört, Neurospora crassa ve Fusarium graminearum'da farklı şekilde kaçakçılığı yapıldı. FM4-64, her iki mantarın plazma zarlarını işaretledi. Bununla birlikte, Fusarium'da, defensin dört sitoplazmada yayılır.

Nörospora'da ise veziküler cisimlere taşınır. Karşılaştırma için, defensin beş, FM4-64 ile plazma membranı etiketlemesi ile birlikte Neurospora crassa'da bir DyLight550 etiketi kullanılarak görselleştirildi. Hızlandırılmış görüntüleme, bu defensinin hücrelere 30 ila 40 dakika içinde girdiğini ve daha sonra sitoplazma boyunca yayıldığını gösterir.

Bu, hücrelere giren ve üç saat sonra bile veziküler cisimler içinde sıkışıp kalan defensin dörtünün kaçakçılığından farklıdır. Özetle, canlı hücre görüntüleme, antifungal bitki farklılıklarının etki modlarına ilişkin anlayışımızı artırmak için güçlü bir araçtır. Diğer hayati floresan boyalar ve hücresel belirteçler ile, diğer antimikrobiyal peptitler için modifiye edilme esnekliğine sahiptir.

Sonuç olarak, bu teknik, antimikrobiyal peptitlerin tarım ve tıpta bir antifungal ajan olarak kullanımı için yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olabilir.