Name: Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile antifungal bitki defensinlerinin mantar hücrelerine içselleşme ve hücre içi yerelleşme mekanizmalarını inceleyin. Bu yöntem, Fusarium graminearum'da etkileşimleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. R. Howard Berg, Donald Danforth bitki Bilim Merkezi onun rehberliği için entegre mikroskobu tesis Müdürü teşekkür ediyoruz ve confocal mikroskobu ile yardımcı olur. Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

1. Defensins Fluorophores ile etiketlerine göre
<ol>
	<li>Canlı hücre içinde Antimikrobiyal Özellikleri yanı sıra alımı ve yerelleştirme defensin, üzerinde en az etkisi bir fluorophore seçin. Not: optimum fluorophore seçerek belirli deneysel hedefler üzerinde bağlıdır. Spektral ve kimyasal özellikleri, photostability, boyutu ve fluorophore adet da düşünülmelidir.</li>
	<li>Etiket seti ticari satıcıları tarafından sağlanan etiketleme uygun bir peptid kullanarak seçili fluorophore ile defensin. Alternatif olarak, fluorophore etiketli defensins kimyasal sentez. Bu çalışmada, MtDef5 DyLight550 ile defensin etiket bir ticari etiketleme kullanarak kit üreticinin iletişim kuralı ve tetramethyl rodamine göre (TAMRA)-etiketli MtDef4 defensin kimyasal sentez ticari olarak. Not: Bu fluorophore peptid üzerinde en az etki sağlamak için N veya C terminal kalıntısı eklenebilir beri kimyasal olarak sentezlenmiş fluorophore öğesini peptidler (özellikle için kısa peptidler 50 amino asitler veya daha az) kullanılması tavsiye edilir, Antimikrobiyal aktivite. Üçten fazla disülfür bağları ile uzun peptidler sentezi meydan okuyor. Bu durumda, bu peptid kiti etiketleme uygun bir piyasada bulunan peptit kullanarak en uygun bir fluorophore ile etiketli önerilir.</li>
	<li>Test etiketli defensin in vitro antimikrobiyal etkinliği ve minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) araştırılması için mantarlar karşı belirlemek. Not: Bu çalışmada, DyLight550-MtDef5 ve TMR-MtDef4 mikrofon Neurospora crassa ve Fusarium graminearumkarşı tespit edilmiştir.</li>
</ol>
2. mantar kültürleri ve büyüme orta
<ol>
	<li>Vogel'ın agar orta21 içeren tüp eğim ve ışık altında oda sıcaklığında 5 gün kuluçkaya N. crassa hisse senedi kültüründen conidia aktarın.</li>
	<li>F. graminearum PH-1 baskı plakaları 5 gün için tam orta boy (CM)22 28 ºC de içeren kültür. Conidia üretimi için 5 gün eski kültür F. graminearum PH-1 4 (10 mm çap) fiş 50 mL carboxymethyl Selüloz (CMC) orta (15 g carboxymethyl selüloz, Maya özü, 0.5 g MgSO4.7 H2O, 1 g NH 1 g aşılamak. 4 YOK3ve 1 gr KH2PO4) ve kültür 180 rpm'de döner bir shaker 28 ºC 4-7 gün için.</li>
</ol>
3. hazırlık Conidial süspansiyon 
<ol>
	<li>F. graminearum conidial süspansiyon
	<ol>
		<li>Girdap F. graminearum sıvı kültür ve 2 mL microcentrifuge tüp içine 1,5 mL mantar kültürü filtrasyon malzemesi (örneğin Miracloth) iki kat ile filtreleme tarafından toplamak conidia. Conidial süspansiyon 13,226 x 2 min için bir microcentrifuge g hızı, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atın ve 1 mL Pelet yıkamak için steril su ekleyin.</li>
		<li>13,226 x g hızı 2 dk. atma için bir microcentrifuge içinde conidial süspansiyon süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet 1 mL 2 X SFM (sentetik mantar medya)23resuspend.</li>
		<li>Hafif bir mikroskop altında hemasitometre kullanarak conidia saymak.</li>
		<li>Conidial süspansiyon 105 conidia/ml 2 X SFM ile ayarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N. crassa conidial süspansiyon
	<ol>
		<li>Büyüyen kültür (5 gün eski) N. crassa Vogel'ın sıvı orta 2 mL içeren bir microcentrifuge tüp için bir aşı döngü kullanarak küçük bir miktar aktarın.</li>
		<li>Girdap conidial süspansiyon ve filtrasyon malzemesi yeni bir microcentrifuge tüp içine filtreden.</li>
		<li>Bir microcentrifuge 2 dk. atma için maksimum hızda conidial süspansiyon süpernatant santrifüj kapasitesi ve conidial Pelet 1 mL Vogel'ın sıvı orta resuspend.</li>
		<li>Hafif bir mikroskop altında hemasitometre kullanarak conidia saymak.</li>
		<li>Conidial süspansiyon 105 conidia/ml Vogel'ın sıvı orta ile ayarlayın.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. örnek hazırlama ve Confocal mikroskobu
<ol>
	<li>MtDef4 mantar hücrelere defensin, hücre altı yerelleştirme
	<ol>
		<li>Her conidial süspansiyon (105 conidia/mL), 50 µL 35 mm cam alt microwell yemekleri 10 mm microwell pipet. Conidia gözlenmesi için doğrudan bir sonraki adıma veya germlings hazırlık, pipet 50 µL N. crassa ve F. graminearum için conidia 35 mm kültür yemekleri devam etmek ve 3-6 h, oda sıcaklığında çimlenme izin.</li>
		<li>Her microwell yemeğin için Mik fluorescently etiketli defensin 50 µL ekleyin ve 2,5 h için kuluçkaya. Burada kullanılan fluorophore etiketli defensins (Adım 1.3) mikrofon N. crassa ve F. graminearum için 3 µM ve TMR-MtDef4 N. crassa ve F. graminearum MIC 1 µM ve 12 µM, anılan sıraya göre.</li>
		<li>Membran-seçici, 2 µL boya FM4-64 ekleyin (son konsantrasyonu: 5 mikron) kültür çanağı ve 30 dk için kuluçkaya ve hemen üzerinde görüntüleme için confocal mikroskop bağlamak.</li>
		<li>Beyaz ışık lazer (WLL) seçin. İki lazer kaynakları 488 nm ve 550 nm TMR-MtDef4 ve FM4-64 boya, sırasıyla heyecanlandırmak için. TMR-MtDef4 floresan 580-700 nm, algılamak ve FM4-64 boya 690-800 nm, algılamak. Not: confocal mikroskobu karanlık odada gerçekleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaman atlamalı görüntüleme MtDef5 defensin içselleştirilmesi
	<ol>
		<li>50 µL N. crassa ve F. graminearum conidial süspansiyon (105 conidia/mL), 35 mm cam alt microwell yemekleri 10 mm microwell pipet. 10 mm microwell kaplanmamış ve alt kısmında bir No 1.5 cam vardır. Conidia gözlem için doğrudan bir sonraki adıma geçin. Germlings gözlem için conidia 3-6 h mikroskobu ile devam etmeden önce oda sıcaklığında için kuluçkaya.</li>
		<li>WLL üzerinde açın. 550 lazer satırında seçin nm fluorophore etiketli defensins (Adım 1.3) burada kullanılan ve FM4-64 %1.00 yoğunluğu ile heyecanlandırmak ve karşılık gelen dedektörleri etkinleştirmek için. Burada kullanılan fluorophore etiketli defensins (Adım 1.3) 560-600 nm algılandı ve FM4 64dye 690-800 nm algılandı. Not: düşük lazer yoğunluğu yüksek lazer yoğunluğu canlı mantar hücreleri zarar verebilir gibi canlı hücre görüntüleme için kullanın.</li>
		<li>Microwell çanak mikroskobunun bağlayın. 10 x hedefleri başlangıçta kullanarak hücreleri bulmak, o zaman geçiş yapmak için 100 x / 1,44 petrol amaç için daha yüksek büyütme. Not: Tarama moduna xyzt (Z-yığın ve hızlandırılmış modları kombinasyonu), Z konumunu, Zoom, frekans görüntü yakalama, vs.</li></ol></li></ol>bir sonraki adıma devam etmeden önce.
		<li>Burada kullanılan fluorophore etiketli defensins (Adım 1.3) 50 µL 3 µM mikrofon ve membran-seçici boya FM4-64 (son konsantrasyonu 5 µM) 2 µL her microwell yemek için eklemek ve hızlandırılmış görüntüleme başlatın. Küçük ıslak filtreyi bildiri buharlaşma önlemek için microwell yemekleri alin. Görüntü yakalama sıklığı 3 dk 30 sn ve toplam süresi 2 saat 30 dk oldu. Not: Ekleme defensin ve montaj microwell tabak içinde mikroskop bölgenin ilgi bulanıklık sonra fluorophore. Bu nedenle, defensin ve fluorophore için microwell ekledikten sonra bölge ilgi refocused gecikme resim alma neden olabilir gerekir.</li>
		<li>Confocal mikroskop için tüm confocal görüntüsü kullanmak ve karanlık bir odada oda sıcaklığında mikroskobu yürütmek.</li>

<ol><li>Jones, J. D. G., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v444/n7117/full/nature05286.html">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).</li>
<li>Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plant+Peptidome%3A+An+expanding+repertoire+of+structural+features+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions.</a> Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+mechanisms+of+action+of+naturally+occurring+antifungal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+and+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides.</a> Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).</li>
<li>Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Marilyn_Anderson/publication/257691605_Plant_defensins_Common_fold_multiple_functions/links/02e7e5269aee227c27000000.pdf">Plant defensins: Common fold, multiple functions.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).</li>
<li>De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1749461312000346">Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).</li>
<li>Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S174946131100042X">Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?</a> Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).</li>
<li>Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+plant+defensins%3A+Mechanisms+of+action+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production.</a> Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).</li>
<li>Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2012-1095.ch015">Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications.</a> ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).</li>
<li>Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+sphingolipids+as+targets+for+the+development+of+selective+antifungal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics.</a> Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).</li>
<li>Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+antifungal+plant+and+insect+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins.</a> Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).</li>
<li>Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+antifungal+action+of+plant%2C+insect+and+human+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+defensin%2C+NaD1%2C+enters+the+cytoplasm+of+Fusarium+oxysporum+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae.</a> J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).</li>
<li>Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+Pisum+sativum+Defensin+1+Interacts+with+Neurospora+crassa+Cyclin+F+Related+to+the+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle.</a> Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).</li>
<li>El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+mechanisms+of+a+plant+defensin+MtDef4+are+not+conserved+between+the+ascomycete+fungi+Neurospora+crassa+and+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum.</a> Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).</li>
<li>Baxter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tomato+Defensin+TPP3+Binds+Phosphatidylinositol+%284%2C5%29-Bisphosphate+via+a+Conserved+Dimeric+Cationic+Grip+Conformation+To+Mediate+Cell+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+and+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis.</a> Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).</li>
<li>Kvansakul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+phosphatidic+acid+by+NsD7+mediates+the+formation+of+helical+defensin-lipid+oligomeric+assemblies+and+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).</li>
<li>Poon, I. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+oligomerization+of+a+defensin+induces+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis.</a> eLife. 3, e01808(2014).</li>
<li>Muñoz, A., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+analysis+shed+light+on+the+complexity+and+dynamics+of+antimicrobial+Peptide+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action.</a> Front. Immunol. 3, 248(2012).</li>
<li>Hayes, B. M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+mechanism+of+action+of+the+plant+defensin+NaD1+as+a+new+member+of+the+antifungal+drug+arsenal+against+candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).</li>
<li>Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+mechanisms+of+cell+penetration+and+killing+by+the+de+novo+designed+antifungal+hexapeptide+PAF26%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26.</a> Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).</li>
<li>Eaton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+guanine+nucleotide+exchange+factor+RIC8+regulates+conidial+germination+through+G%CE%B1+proteins+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa.</a> PLoS One. 7 (10), e48026(2012).</li>
<li>Leslie, J. F., Summerell, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeslie%2C+JF+%22The+Fusarium.+laboratory+manual%22">The Fusarium. laboratory manual</a>. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).</li>
<li>Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.1990.tb04174.x/abstract">An automated quantitative assay for fungal growth inhibition.</a> FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).</li>
<li>Sagaram, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+studies+of+a+phosphatidic+acid-binding+antifungal+plant+defensin+MtDef4%3A+Identification+of+an+RGFRRR+motif+governing+fungal+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry.</a> PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).</li>
<li>Nair, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+prediction+of+sub-cellular+localization+by+combining+evolutionary+and+structural+information%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins+Struct.+Funct.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information.</a> Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).</li>
<li>Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.0010066">Refining protein subcellular localization.</a> PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66(2005).</li>
<li>Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+sequence+of+interactions+of+PuroA+peptide+with+Candida+albicans+cells+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging.</a> Sci. Rep. 7, 43542(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada, bir güvenilir canlı hücre görüntüleme metodoloji fluorescently etiketli antifungal defensins kullanımı ile Bu peptidler içselleştirilmesi mantar hücreleri içine Kinetik çalışmaya ve hücre altı hedefleri belirlemek için tanımlanmıştır. Bu yöntem defensins ve mantar hücreleri arasındaki etkileşimi dinamikleri geçici ve dağınık şekilde görselleştirmek için güçlü bir araçtır.
İçselleştirilmesi ve bitki defensins mantar hücrelerinde hücre içi yerelleştirme çalışmaya çeşitli yöntemler ...

Bitkiler mikrobiyal bitki patojenleri1karşı savunma için sofistike bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi gelişmiştir. Onlar çok sayıda gen kodlanmış konak savunma peptidler sözde antimikrobiyal aktivite2hızlı. Gerçekten de, birçok Bu peptidler antimikrobiyal aktivitesi vitro3görüntüler. Defensins konak savunma peptidler bitki Krallık4en büyük gruplarından birini oluşturmaktadır. Bu sistein-zengin, Katyonik peptidler mantar karşı güçlü büyüme inhibitör etkinliği sergi ve oomycete patojenleri micromolar konsantrasyonları ve bu patojenler5,6karşı savunma ilk satırlardan birini temsil eder. Onların güçlü antifungal etkinlik nedeniyle, defensins hastalığı dayanıklı bitkiler üretmek için agribiotechnological uygulamalarında yararlanılabilir. Birkaç bitki defensins kurucu overexpression transgenik6sera ve alan testlerinde hastalık direnci artırmak için gösterilmiştir. Eylem bu antifungal peptidler (MOA) mekanizmaları tam olarak bitki koruma için etkili araçlar olarak potansiyellerini koşum için çözmek önemlidir. Ancak, bu bitki defensins MOA kötü anlaşılır. Geçerli kanıtlar onlar farklı MOA5,6,7,8sergi gösteriyor. Bazı defensins extracellularly mantarlar hareket ve belirli hücre duvarı/plazma membran ikamet organizmalardandır hedef, membran bütünlüğü bozabilir ve hücresel toksisite yolları9,10,11etkinleştirme. Son zamanlarda, ancak, mantar hücrelere translocate antifungal defensins bulunan12,13,14olmuştur. Bu defensins bazıları membran yerleşik biyoaktif fosfolipitler bağlamak oligomeric kompleksler oluşturur ve plazma membran15,16,17permeabilize. Böylece, bitki defensins MOA bazı yönlerini aydınlatılmamıştır. Ancak, bitki defensins büyük olasılıkla MOA henüz tespit edilmiş ve kapsamlı bir modeli olarak entegre olaylar karmaşık bir dizi içerir. Özellikle, anlayışımız Bu peptidler hücresel hedefler büyük bir boşluk kalır.
Mikroskopi teknolojiler ve yeni floresan problar gelişimi son gelişmeler ile canlı hücre görüntüleme teknikleri şimdi sık sık antimikrobiyal peptidler (Amper) MOA incelemek için kullanılır. Bu teknikler çoğunlukla morfolojisi antifungal peptidler etkilerini çözümlemek için istihdam immunolocalization, elektron mikroskobu, Atomik kuvvet mikroskobu veya x-ışını tomografi18, gibi yaygın olarak kullanılan yöntemleri tamamlayacak ve hücre duvarı bütünlüğü, değişiklikler hücre büyüme/dallanma desenleri, hem de plazma zarı permeabilization çalışmanın da dahil olmak üzere ve öldürmek mantar hücrelerinin büyümesini. Yine de, bu çalışmalar gerçekleştirmek yerine peptidler ile tedavi meydan defensin karşılık dinamik değişiklikleri izlemek için aynı hücrelerde Imaging hızlandırılmış sonra hücreleri belirli bir zaman noktasında Imaging'e sınırlı olmuştur. Son yıllarda fluorescently etiketli peptidler canlı hücre confocal mikroskobu kullanarak Imaging ile birlikte kullanımı gerçek zamanlı görselleştirme AMP-mikrop etkileşimleri dinamikleri sağlamıştır. Her ikisi de doğal olarak saflaştırılmış ve kimyasal olarak sentezlenmiş antifungal peptidler floresan etiketlerle öğesini (örneğin, DyLight, rodamine, BODIPY veya Alexa Fluor esaslı boyalar) ve doğrudan hücrelerle onların etkileşim sırasında hızlandırılmış tarafından gözlenen canlı hücre görüntüleme. Bunlar peptidler etiketli kullanımını önemli ölçüde onların MOA giriş, hücre altı yerelleştirme, hücre içi trafiği ve siteleri mantar önleyici eylem yaşam mantar hücreleri içinde modu dahil olmak üzere farklı yönleri anlayışımız artmıştır 18.
Son zamanlarda, çeşitli çalışmalar bitki defensins de dahil olmak üzere çeşitli antifungal peptidler yaşayan mantar hücreleri12,14,19,20tarafından içselleştirilmiş göstermiştir. Bu defensins büyük olasılıkla MOA etkileşim hücre içi hedefleri olan gerektirir. Son zamanlarda MtDef4 iki ascomycete Mantarlar, Neurospora crassa ve Fusarium graminearumdefensin bir bitkinin antifungal eylem bildirdin. MtDef4 mantar Hücre girişini ve bu mantar14hücre altı yerelleştirme için farklı yolları kullanmak için gösterildi. Tetramethyl rodamine (TAMRA) Bu çalışmada kullanılan kimyasal sentez-hayati floresan boyalar (membran seçici boya, FM4-64; hücre ölüm gazeteci boya, propidium iyodür membran permeant boya, SYTOX yeşil) ile birlikte MtDef4 etiketli ve metabolik inhibitörleri. Bu analizler MtDef4, onun mekanizmaları hücre içi ulaşım ve onun hücre altı hedefleri14içselleştirilmesi Kinetik gösterdi.
Burada, confocal mikroskobu kullanarak canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmuştur. Protokol fluorescently etiketli peptidler bitki defensin mantar etkileşimleri, özellikle eğitim için hayati floresan boyalar, translocation yollar ile defensins mantar hücrelerinde hücre içi hedefleri ile birlikte kullanır.

<table><tbody><tr><td>FM4-64 Boya</td><td>Ömrü Teknolojileri</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 550 Antikor Etiketleme Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>Cam Alt Mikrokuyu Yemekleri</td><td>Mat TeK</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Mira kumaş</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>SP8-X konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td>Görüntü analizi için</td> <td>FiJi</td><td></td></tr><tr>Görüntü analizi için<td>Imaris yazılımı</td><td>Bitplane</td><td></td> Görüntü <td>analizi için</td></tr></tbody></table>

canlı hücre görüntüleme modları giriş ve antifungal bitki defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Küçük sistein-zengin defensins bir ana savunma peptidler tüm tesislerinde mevcut en büyük grupları vardır. Birçok bitki defensins karşı geniş spektrumlu fungal patojenlerin güçlü vitro mantar önleyici faaliyet gösteren ve bu nedenle potansiyel transgenik antifungal ajanları olarak kullanılmak üzere. Bitki defensins hastalıkların kontrolü için tam potansiyelini koşum için kendi mekanizmaları eylem (MOA) aydınlatmak önemlidir. Gelişmiş mikroskobu teknikleri ortaya çıkmasıyla, canlı hücre görüntüleme bitki defensins antifungal MOA dinamiklerini anlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir. Burada, bir temel confocal mikroskobu canlı hücre görüntüleme yöntemi hayati floresan boyalar ile birlikte iki fluorescently etiketli bitki defensins (MtDef4 ve MtDef5) kullanılarak açıklanmıştır. Bu teknik, gerçek zamanlı görüntüleme ve mantar hücreleri içine MtDef4 ve MtDef5 içselleştirilmesi dinamik olayların analizi sağlar. Önemlisi, bu tahlil içselleştirilmesi Kinetik, giriş modunu ve Bu peptidler hücre altı yerelleştirme dahil olmak üzere bilgi hazinesi oluşturur. Diğer hücre biyolojik aracın yanı sıra, bu yöntemler dinamikleri ve Bu peptidler MOA karmaşıklığı önemli anlayışlar hazırladık. Bu araçlar aynı zamanda farklı mantarlar karşı Bu peptidler MOA karşılaştırmak için kullanılabilir.

Canlı hücre görüntüleme gerçekleştirildiği parça ve içselleştirilmesi ve iki defensins, MtDef4 ve MtDef5, Medicago truncatula; dan hücre altı yerelleştirme karşılaştırmak için mantar hücrelerinde. TMR-MtDef4 kimyasal sentez MtDef5 Dylight550 ile etiketli iken (Dylight550-MtDef5). Conidia membran seçici boya FM4-64 ile birlikte her iki defensin ile inkübe. TMR-MtDef4 F. graminearumiçin karşılaştırıldığında N. crassa farklı ticaret yolları vardır <strong class="xf...

Bitki defensins patojenlere karşı bitki savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Etkili eylem (MOA) onların mod anlama antifungal ajanları olarak antifungal Bu peptidler kullanımı önemlidir için. Burada, Bu peptidler MOA kritik yönlerini incelemek için canlı hücre görüntüleme yöntemi açıklanmıştır.

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Bu canlı hücre görüntüleme yönteminin genel amacı, antifungal bitki defensinlerinin fungal hücrelerdeki etki mekanizmalarının kritik yönlerini incelemektir. Gelişmiş konfokal mikroskopi tekniklerinin ortaya çıkışıyla birlikte, canlı hücre görüntüleme, antifungal bitki defensinlerinin etki biçimlerini araştırmak için güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu teknolojiden yararlanarak, burada antifungal bitki defensinlerinin etki biçimlerinin anlaşılmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacak bir yöntem sunuyoruz.Odak noktalarımız, bu peptitlerin fungal hücreler tarafından nasıl internalize edildiği ve bu peptitlerin hücre organellerinde nasıl lokalize olduğu veya sitoplazmada nasıl difüze olduğudur. Fusarium graminearum PH-1 suşunun konidiyal süspansiyonunu hazırlamak için, önce suşun kültürlerini komple ortam içeren plaklarda oluşturun. Bunları 28 °C'de beş gün boyunca kültüre edin.Konidiyum üretmek için, beş günlük kültürden alınan dört adet 10 mm çapındaki diskle 50 mL karboksimetil selüloz ortamını inoküle edin. Bu diskleri, 180 rpm'e ayarlanmış bir döner çalkalayıcıda, 28 °C'de dört ila yedi gün boyunca kültüre edin. Kültürler kırmızı renk aldığında, konidiyumlar oluşmuş

live-cell-imaging-fungal-cells-to-investigate-modes-entry-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, floresan Aspergillus reporter conidia kullanılarak insan nötrofillerinde antifungal aktivitenin analizi için canlı hücre görüntülemeyi göstermektedir. Başlangıçta, nötrofiller içinde hem kırmızı hem de macenta floresan tespit edilirken, kırmızı floresan zamanla azalır, bu da conidia'nın bozulmasını gösterir ve nötrofillerin antifungal aktivitesini doğrular.

Primer İnsan Bağışıklık Hücrelerinin Antifungal Aktivitesinin Gerçek Zamanlı Değerlendirmesi

Biz canlı hücre Video mikroskopi yöntemleri...

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Burada, canlı hücre bir video mikroskobu ile birlikte floresan Aspergillus raportör konidyalarını kullanarak gerçek zamanlı olarak birincil insan bağışıklık hücrelerinin antifungal aktivitesini değerlendirmek ve akım sitometri bir protokol açıklar. Oluşturulan veriler, fungisit aktivite, fagositoz, hücre göçü ve mantar büyüme inhibisyonu olarak ana bilgisayarın hücreye Aspergillus etkileşimleri ilişkin bilgi sağlar.

Cevabı İnsan İlköğretim nötrofiller ve monositler tarafından Antifungal Faaliyet Canlı Görüntüleme<em&gt; A. fumigatus</em

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Hayati floresan boyalar modern mantar hücre biyolojisinde canlı hücre görüntüleme analizleri için gerekli araçlardır. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo-/eksositoz ve hücre duvarı morfogenezinin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır.

Filamentöz Mantarların Canlı Hücre Görüntülemesi İçin Membran ve Hücre Duvarı Seçici Floresan Boyaların Uygulanması

Toprağın opaklığı nedeniyle, kurucu mikroplar arasındaki etkileşimler hücresel çözünürlükle kolayca görselleştirilemez. Burada, mantar-mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için yeni fırsatlar sunan iki mikroakışkan araç sunulmaktadır. Cihazlar çok yönlü ve kullanımı kolaydır, bu da hücresel düzeyde yüksek mekansal zamansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile antifungal bitki defensinlerinin mantar hücrelerine içselleşme ve hücre içi yerelleşme mekanizmalarını inceleyin. Bu yöntem, Fusarium graminearum'da etkileşimleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanır.

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin (Video) | JoVE Journal

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Daha fazla video keşfet