Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

Bu görüntüleme tabanlı yöntemin genel amacı, nanometre çözünürlükte bir golgi proteinini nicel olarak lokalize etmektir. Bu yöntem, golgi aygıtının incelenmesinde Golgi'nin organizasyonu ve nasıl çalıştığı gibi temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, geleneksel bir ışık mikroskobu ve yazılım araçları kullanmasıdır.

Başlangıç olarak, HeLa hücrelerini DMEM'deki T25 şişesinde %10 FBS ile takviye edilmiş şekilde kültürleyin ve kültürü 37 derece Celsius ve %5 karbondioksit sıcaklığında inkübe edin. Hücreler yaklaşık %80 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamı aspire edilir ve termoya bir mililitre %25 Tripsin EDTA eklenir. Hücreleri 37 derece Celsius'ta iki dakika kuluçka edin.

Hücreleri kuluçka makinesinden çıkarın ve bir mililitre tam ortam ekleyin, böylece hücreler şişenin duvarından nazikçe silinsin. Ayrılmış hücreleri steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 500 g hızında iki dakika boyunca döndürerek hücreleri pellet edin. Süpernatantı aspire ettikten sonra, hücre pelletini askıya almak için bir mililitre tam ortam kullanın.

Sterilize edilmiş cam kapak içeren 24 kuyu plakanın kuyusundan ortamı çıkarın ve yaklaşık 100.000 hücre tohumunu kuyuya yerleştirin. Kuyunun hacmini 5 mililitreye çıkarmak için tam orta kullan. Sonra, plakayı %5 karbondioksit ile 37 derece Celsius'ta kuluçka yapın.

Hücreler %80 birleşmeye ulaştığında, üreticilerin protokolüne göre hücreleri transfekte etmek için 80 nanogram GalT-mCherry ve 320 nanogram TPST1-EGFP plazmid DNA'sı ile transfeksiyon reaktifi kullanın. Hücreler dört ila altı saat kuluçka edildikten sonra, ortamı değiştirin ve hücreleri 12 saat boyunca kuluçka makinesine geri getirin. Ortamı kuyuya aspire edin ve tam ortam içeren 33 mikro kalıp Nokodazol içeren 5 mililitre ekleyin, ardından hücreleri 37 derece Celsius ve %5 karbondioksitte üç saat boyunca kuluçka yapın.

Cam kapak kapaklarını metin protokolüne göre temizledikten sonra, mikrolitre başına 1 mikrogram BSA içeren PBS bir kez kullanarak 110 nanometre çok renkli floresan boncukları 80 kat seyreltirin. Boncuk agregalarını dağıtmak için tüpü kısa bir girdap ile dağıtın. Pipet ucu kullanarak, 60 mikrolitre seyreltilmiş boncukları temiz bir kapak kılıfına yayın.

Karanlıkta, kapak kılıfı 35 milimetrelik bir çanakta koyun ve üzerine alüminyum folyo ile örtün. Kapak slipini vakum pompasına bağlı bir kurutucu ile karanlıkta kurut. Sonra 50 mikrolitre montaj ortamı kullanarak kapak sürgüsünü cam bir sürgüye monte edin.

Floresan kalıntıları ortadan kaldırmak için doğru şekilde temizlenmiş kapak kapakları gereklidir. Yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı kanallarda çok renkli boncukları görüntülemek için, görüntüleme oturumunun başında, en iyi odak düzleminin üstünde ve altında üç bölüm alınarak 3D görüntü yığınları alın. Yığınları TIFF dosyaları olarak kaydet.

Golgi mini yığınlarını görüntülemek için, TPST1-EGFP ve GalT-mCherry transfeksiyonunu floresan etiketli slaytlarda kullanarak TPST1-EGFP ile düşük veya orta seviyeli GalT-mCherry ifade eden hücreleri bulun. Az önce gösterildiği gibi 3D görüntü yığınları edinin. Görüntüleri analiz etmek için, J görüntüsünü açın, File, Image, Open seçeneğini seçerek üç TIFF dosyasından oluşan bir boncuk görüntü setini açın.

Kırmızı kanalda en çok odaklanmış bölüm etrafında ardışık üç bölüm ortalaması almak için Image, Stacks, Z Project seçin. Başlangıç dilimi ve stop diliminin bölüm sayısını girin ve projeksiyon türündeki seçenekler arasında ortalama yoğunluğu seçin. Görselde boncuk içermeyen arka plan yatırım getirisi çizin.

Sonra Analiz Et, Ölçümleri Set'te sadece ortalama gri değeri ve Standart Sapma veya SD'yi kontrol edin. Arka plan ortalama yoğunluğunu ve standart sapmayı elde etmek için Uygula, Analiz Et, Ölç. Süreç, Matematik, Çıkarma seçeneklerini seçerek arka plan ortalama yoğunluğunun karşılık gelen değerleri ve standart sapmanın altı katı olan görüntüyü çıkarın. Sonra bu kanala karşılık gelen hesaplanan değeri girin.

Yeşil ve uzak kırmızı kanal görüntü yığınları için aynı başlangıç ve durdurma dilimi ile aynı arka plan yatırım getirisi kullanılarak ortalamayı ve çıkarmayı tekrarlayın. İşlenen üç görüntüyü Image, Color, Merge Channels ile birleştirin; kanal R'yi kırmızı, kanal G'yi yeşil ve kanal B'yi mavi olarak seçin. ROI Yöneticisi'ni Analyze, Tools, ROI Manager seçerek başlatın.

Tek boncuklar etrafında kare yatırım getirisi çizin. Sonra klavyede T tuşuna basarak ROI Yöneticisi'ne ROI ekleyin. Analiz Et, Ölçümler bölümünde sadece kütle merkezini kontrol et.

ROI Yöneticisi'nde, sonuç penceresinde ROI merkezlerinin X ve Y koordinatlarını elde etmek için kanal R'yi seçin ve Ölçüt'e tıklayın. İki sütunu bir elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın. Kanal G ve kanal B için ROI merkezlerinin koordinatlarını alın. Tabloyu beads.csv olarak kaydedin.

Image J'de, iki makroyu yüklemek için eklentileri kullanın: makro golgi ROI denetimi ve makro çıkış üç kanal verileri. ROI Manager ve sonuçlar penceresini temizleyin. Üç TIFF dosyasından oluşan bir Golgi mini yığın görsesi setini açın.

Daha sonra kullanmak üzere bu videoda daha önce gösterildiği gibi arka plandan çıkarılan görüntüler oluşturun. Sonra görüntüleri çoğaltın. Süreç, Görüntü Hesaplayıcısı altında, arka plandan çıkarılan kanal G, kanal R ve kanal B görüntülerini ekleyin.

Ortaya çıkan görüntüye Image, Adjust, Threshold altındaki En düşük eşik seviyesi olarak bir girdi seçeneğini seçin. Parçacıkları Analiz Et, Analiz Etme bölümünde, piksel boyut aralığını da girin. 50'yi sonsuzluğa girin, kenarlarda hariç tutanları işaretleyin ve yöneticiye ekleyin.

Sonra, daha önce oluşturulan üç arka plandan çıkarılan görüntüyü birleştirmek için R'yi kırmızı, G kanalını yeşil ve B kanalını mavi olarak seçerek birleştirin. Sonra makro makro golgi ROI denetimini Eklentiler, Makro, Golgi ROI İnspektefesi seçerek çalıştırın. Bir dizi görüntüde tek bir golgi mini yığını içeren mümkün olduğunca çok yatırım getirisi (ROI) seçmek önemlidir.

Analiz Et, Ölçümler Ayarlan bölümünde, sadece alan, ortalama gri değer ve kütle merkezi kontrol edilsin. Makro aracı başlatarak veri edinin, makro çıktı üç kanallı verini. Merkez koordinatlarını burada listelenen sırayla bir tabloya kopyalayın.

Sonra tabloyu ministacks.csv olarak kaydet. Metin protokolüne göre merkezlerin kromatik kaydırma düzeltmesine ve Lokalizasyon Oranı veya LQ hesaplamasına geçin. Burada kullanılan gibi sade apokromatik lensle donatılmış modern araştırma sınıfı ışık mikroskobu, minimal kromatik kayma gösterir.

Ancak, çok renkli boncuk görselinin dikkatli incelenmesi bunu ortaya çıkarır. Kırmızı floresans merkezleri, boncukların gerçek konumları olarak tanımlanır. Yeşil ve uzak kırmızı floresansın göreli kromatik kaymaları vektörlerle temsil edilebilir.

Görüntüleme düzlemindeki kromatik kayma, her boncuk için yeşil ve mavi vektörle gösterilir. Burada gösterildiği gibi, kromatik kaydırma düzeltmesi kromatik kaymayı önemli ölçüde azaltır. Memeli hücrelerinde, Golgi kompleksi perinükleer alanda toplanır ve bu genellikle geleneksel optik mikroskopla çözülemez.

Nocodazol tedavisinden sonra, perinükleer golgi kompleksi ortadan kalkar ve sitoplazma boyunca endoplazmik retikülüm çıkış noktalarında onlarca Golgi mini yığını oluşur. Bu videoda gösterilen görüntü analiziyle oluşturulan örnek bir görüntü burada gösterilmiştir. Makro Golgi ROI inceleme aracı kullanılarak, 40 seçilmiş Golgi mini yığını listelendi.

Üç kriterin uygulanmasından sonra, TPST1-EGFP'nin LQ'larının hesaplanması için 21 golgi mini yığını analiz edilebilirdi. Ustalaştıktan sonra, bu teknik floresan etiketlemesinden bir saat sonra yapılabilir. Geliştirildikten sonra, bu yöntem, Golgi cihazını inceleyen araştırmacıların immünoelektron mikroskopisine eşdeğer çözünürlükte bir Golgi proteinini nicel olarak lokalize etmelerinin yolunu açtı.