Name: Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Öğrenin, aktive T hücrelerinde tek molekül lokalizasyon mikroskobisi kullanarak çoklu protein görüntüleme yöntemini. Bu teknik, geleneksel yöntemlerden daha fazla çoğullama sağlayarak immünoloji araştırmalarında yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

STORM mikroskopuna erişim için Xufeng Wu&#39;ya teşekkür ediyoruz. Bu araştırma, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Kanser Araştırmaları Merkezi ve Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI )&#39;nin İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Dikkat: Kullanmadan önce lütfen ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Bu protokolde kullanılan kimyasallardan birçoğu zehirli ve kanserojen. Mühendislik kontrollerinin (davlumbaz, torpido gözlüğü) ve kişisel koruyucu ekipmanların (koruyucu gözlükler, eldivenler, laboratuar önlükleri, tam pantolonlar, kapalı ayakkabı) kullanılmasını içeren protokolü uygularken lütfen tüm uygun güvenlik kurallarını kullanın. 1. Aktive T Hücrelerinin Çoklu Görüntüleme <ol><li> Alexa 647 antikor etiketleme kiti kullanılarak antikorları doğrudan Alexa-647 (A647) boya ile konjuge edin. Üretici tarafından verilen etiketleme protokolünü izleyin. NOT: Antikor etiketleme verimliliğini artırmak için bu aşamadan önce 1x PBS&#39;de antikor çözeltisinin diyalizi yapılması önerilir. </li><li> Etiketli antikorları 20.800 rcf&#39;de 5 dakika spinleyin ve toplanmış antikorları uzaklaştırmak için süpernatant toplayın. </li><li> Floresan nano-elmas kaplamalı lamelleri hazırlama <ol&gt; <li> 15 dakika boyunca 250 μL% 0.01 Poli-L-Lizin (PLL) ile 8 yuvalı lamelleri kaplayın (reaktif / malzeme listesine bakınız), aspire edin ve 30 dakika boyunca 65 ° C&#39;de kurutun. (Kurutma işleminden önce durulamayın.) </li><li> 1x PBS&#39;de 100 nm FND&#39;lik bir seyreltme hazırlayın. Adım 1.2.7&#39;deki her görüş alanında yeterli FND&#39;lerin görünmesini sağlamak için çeşitli seyreltileri test edin (üretici tarafından sağlanan FND&#39;lerin 1: 200 oranında seyreltilmesini kullanıyoruz). </li><li> Seyreltilmiş FND&#39;leri 1 dakika boyunca vorteksleyin. </li><li> Yüksek güçlü bir ortamda 30 saniyeliğine FND süpernatantını sonik hale getirin. </li><li> Sonike edilmiş FND üst fazını bir PLL kaplı 8 kuyulu lamel hücresinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> 1x PBS ile 5x yıkayın ve TDAF mikroskopta 647 nm lazer uyarımı kullanarak FND kaplı oda görselleştirmek. İdeal olarak, adım 1.2.2&#39;de uygun FND seyreltmesi göz önüne alındığında, 4-10 bireysel FND&#39;ler bir görüş alanında görülebilir olmalıdır (256 x 256 kamera piksel ayarı ile 100X objektif kullanarak 61 x 61 μm görüntü alanı elde ediyoruz) At ileGörüntüleme alanının her kadranında en az bir FND mevcut. FND&#39;ler kümelenmiş görünüyorsa ( örn. Çevreleyen FND&#39;lerden önemli ölçüde daha yüksek sinyal ile FND&#39;ler ve 200 nm&#39;den büyük bir nokta yayılım fonksiyonu) 1 dakika boyunca FND&#39;leri 6,800 rcf&#39;de santrifüjleyin ve FND üst fazını kullanarak kaplama prosedürünü tekrarlayın. </li><li> Her oyuğa 250 ul anti-CD3 antikoru (10 ug / mL) ekleyin ve 37 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin veya gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Çözümü çıkarın ve 30 saniye boyunca 1x PBS ekleyin. Bu yıkama adımını 5 kez tekrarlayın (5x yıkayın). </li></ol></li><li> Jurkat T hücrelerinin aktivasyonu <ol><li> 1 ml Jurkat T hücresini 6 dakika boyunca 800 rcf&#39;de döndürün ve 300 μl 1x HBS solüsyonunda tekrar süspansiyon haline getirin. Jurkat T hücreleri, eğrilmeden önce ideal olarak 0.5-1.0 x 106 hücre / ml konsantrasyonda olmalıdır. 1x HBS çözeltisi, daha önce tarif edildiği gibi% 1 sığır serum albümini içeren HEPES tampon salininden oluşur 22 . </li><li> 150 uL ekleHer kuyuda 1x HBS solüsyonu ve 37 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edin. </li><li> Her bir göze 50 μL yeniden süspansiyon haline getirilmiş Jurkat T hücresi ekleyin ve 37 ° C&#39;de 3 dakika inkübe edin. </li><li> Her göze 300 μL% 4 Paraformaldehit ekleyin ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 250 μL% 0.1 Triton-X çözeltisi ilave ederek hücreleri geçirir hale getirin. </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her oyuğa 1x PBS içerisinde 250 μL% 1 balık jelatin solüsyonu ekleyin. </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın. </li></ol></li><li> MadSTORM&#39;u kullanarak aktive edilmiş Jurkat T hücrelerini görüntüleme <ol><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca sabit hücrelere 0.1-0.5 μg / mL&#39;de etiketli antikor 200 mcL ekleyin. </li><li> 1x PBS ile 5x yıkayın. </li><li> 1 ml STORM tamponu ekleyin ve hava ile temasını sınırlamak için cam bir lamelle bölmeyi kapatın. STORM tamponu daha önce açıklanmıştır 10 . Ma tavsiye ediyoruzHer raund görüntüsü için yeni STORM tamponunu ve çökeltileri çıkarmak için STORM tamponunu 20.800 rcf&#39;de 2 dakika döndürün. </li><li> TIRF modunda düşük 647 nm lazer gücü kullanarak, görüş alanında en az 3 FND olan lekeli bir hücreyi bulun. FND&#39;lerin konumlandırılmasına yardımcı olmak için, 568 nm lazerle eşzamanlı uyarılma, FND sinyalinin parlaklığını arttırmak için kullanılabilir. NOT: Bölüm 2.1&#39;de anlatılan ortalama düzeltme düzeltmesinin performansı, daha fazla FND içermesi ile gelişir. </li><li> 647 nm lazer gücünü artırın ve görüntü elde edin. Genellikle 200 ms pozlama, 125 mW 647 nm lazer, 100X TIRF objektif lens (1.49 NA), 100X EM kazanımı (16 bitte 5 MHz, dönüşüm kazancı 1) ile 10,000 çerçeve elde ediyoruz. Görüntüleme kurulumumuzun ayrıntıları daha önce açıklanmıştır 10 . </li><li> 1x TBS ile 5 kez yıkayın. </li><li> 1 ml oElüsyon tamponu (3.5 M MgCI2, 20 mM BORULAR,% 0.1 Tween-20, pH 6.5) ile yıkanır ve oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edilir. </li><li> Elüsyonu 3 kez tekrarlayın. (Kesin elüsyon koşulları ve sinyal kaldırmak için gereken yıkama durulama sayısı kullanılan her bir antikor için kontrol edilmelidir). </li><li> 1x TBS ile 3 kez yıkayın ve 1 ml 1x PBS ekleyin. </li><li> Fotobirik, karanlık durumda A647 boyalarını foto-aktive etmek için 2-5 mW&#39;da 405 nm lazerle yüksek güçte (125 mW) 647 nm lazer kullanıyor. Seyreltilmemiş antikorun kalan tüm sinyalleri photobleached edilinceye kadar bekleyin. Tipik olarak bu, 2-5 sn&#39;lik bir lazer maruziyeti gerektirir. Elution ve fotokopi sonrası sinyallerin kaldırılmasını onaylamak için 1.3.5&#39;deki STORM ayarlarını kullanarak örnek resimler (~ 100 çerçeve) edinilmesi önerilir. Bu yöntemi kullanarak sinyalin% 99.8&#39;ini ortadan kaldırırız. Daha önce gösterildiği gibi madSTORM&#39;da kullanılmadan önce her antikorun elüsyon verimliliğini test etmenizi öneririz 10 . </li><li> 15 dakika boyunca 250 μL% 4 paraformaldehid ekleyin. Bu prOlaylar hücredeki sabit moleküllerin çapraz bağlanmasını tersine çevirir. </li><li> 1x PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> Birden fazla hedefin sıralı etiketlenmesi için adım 1.3.1-1.3.12&#39;yi tekrarlayın. Şekil 1 , madSTORM kullanılarak elde edilen aktive edilmiş Jurkat T hücresindeki çoklu moleküllerin birleşik bir görüntüsünü göstermektedir. </li></ol></li></ol> 2. Çoğaltılmış Görüntü Yığınlarının Drift Düzeltmesi ve Hizalanması <ol><li> MadSTORM görüntü yığınlarının sürüklenme düzeltmesi <ol><li> ImageJ kullanarak resimleri aç. ImageJay&#39;ı açmadan önce görüntü dosyalarını bir TIFF formatına dönüştürmenizi öneririz. Tek bir FND seçmek için dikdörtgen ROI kullanın. FND&#39;nin görüntü yığınının her karesinde görünür olmasını sağlamak için zaman aşımını oynatın. FND&#39;yi yerelleştirmek için ThunderSTORM eklentisindeki Çalıştırma Analizi&#39;yi kullanın. 2.1.5&#39;te açıklanan ortalama düzeltme yöntemi için, tek bir FND&#39;nin her görüntü çerçevesinde lokalize olması önemlidir ( örn . Belirlenen tepe sayıları e olmalıdırQual sayısına göre). </li><li> FND her çerçevede tanımlanmazsa, başka bir FND seçin. Birden fazla zirve tek bir karede bulunuyorsa, en yüksek zirvelerden sapan zirveyi çıkarın. </li><li> Görüntü yığındaki her FND için 2.1.2&#39;yi tekrarlayın. Bazı FND&#39;lerin sürüklenme düzeltme sürecine dahil edilmemesi gerektiğini unutmayın; bu nedenle, adım 2.1.7&#39;de anlatıldığı gibi sürüklenme düzeltme hassasiyeti için bağımsız bir gösterge görevi görebilirler. </li><li> Hızlı, daha az hassas sürüklenme düzeltmesi için, FND görüntülerini düzeltmek için ThunderSTORM&#39;da bulunan çapraz korelasyon veya düzeltme algoritmalarını kullanın. Tipik olarak, çapraz korelasyon ve 10 maksimum mesafe, 0.1 dakika işaretleyici görünürlük oranı ve 100 düzeltme düzeltmesi için 0.01 yörünge düzeltme faktörü için 100 kutu, 5 büyütme ve 0.1 yörünge yumuşatma faktörü kullanıyoruz. Çapraz korelasyon ve standart düzeltme, sürüklenme düzeltme hassaslığını test etmek için diğer FND&#39;lere uygulanabilecek bir düzeltme dosyası üretecektir. </li><li> Daha katı, daha hassas sürüklenme düzeltmesi için, daha önce tarif edildiği gibi ortalama referans düzeltme (AFC) algoritmasını kullanın 10 . Bu işlem, parametrelerin optimizasyonunu gerektirmez ve SMLM yerelleştirme algoritmaları tarafından öngörülenden daha yüksek yerelleştirme hassaslığı sağlar. Bununla birlikte, ortalama sürüklenme düzeltmesi en az 4 FND gerektirir ve FND&#39;lerin görüntü yığınının her karesinde lokalize edilmesi gerekir. AFC sürüklenme düzeltmesi, daha fazla FND&#39;yi dahil ederek daha iyi performans gösterir çünkü çok sayıda yerel FND belirli bir çerçevedeki aşırı olmayan bir tepenin bozucu etkisini azaltacaktır. </li><li> ThunderSTORM&#39;u daha önce açıklandığı gibi kullanarak görüntü yığını içindeki tüm nokta yayılım fonksiyonlarını lokalize edin 10 . Genelde 100 nm piksel boyutu, 4.28 A / D sayısı başına fotoelektronlar, 100 taban seviye A / D sayısı, 100 EM kazancı, PSF: Entegre Gauss lokalizasyonu, 5 piksel uyum yarıçapı, maksimum olasılık uydurma yöntemi ve 1.3 Piksel başlangıç ​​sigma.</li><li> FND&#39;lerden elde edilen sürüklenme düzeltme faktörünü tüm görüntü yığından yerelleştirmelere uygulayın. Uygun sürüklenme düzeltmesini sağlamak için nihai görüntüyü görsel olarak inceleyin ( Şekil 2 ). Oluşan sürüklenme düzeltme faktörü, sürüklenme düzeltme hassasiyet seviyesini ölçmek için AFC prosedürüne dahil edilmeyen FND&#39;lerde bağımsız olarak test edilmelidir. Sürüklenerek düzeltilmiş bağımsız FND&#39;lerin hassasiyeti, adım 2.1.6&#39;da kullanılan lokalizasyon algoritmasından hesaplanan ortalama hassasiyet / belirsizlik değerine yakın olmalıdır. </li><li> Kademeli etiketli antikorların madSTORM görüntü yığınları için 2.1.1-2.1.7 adımlarını tekrarlayın. Her madSTORM görüntü yığında aynı FND setini yerelleştirmenin aşağıdaki hizalama prosedürü için kritik olduğunu unutmayın. </li></ol></li><li> MadSTORM resimlerinin hizalanması <ol><li> Her bir madSTORM görüntüsünde sapma düzeltilmiş FND&#39;lerin merkez konumunu hesaplayın. Bunu yapmak için, ortalama x ve y ekseni poHer yerelleştirilmiş FND için alanlar ve her madSTORM görüntüsündeki tüm FND&#39;lerin ortalama x ve y konumlarını ortalamaktadır. Bu adım için ayrıntılı algoritma daha önce açıklanmıştır 10 . FND referans işaretlerinin ağırlık merkez noktalarını kullanarak ardışık madSTORM görüntülerini hizalayın. Hizalamayı gerçekleştirmek için, ilk maddenin ikinci madSTORM görüntüsündeki FND&#39;lerin ağırlık merkezinden çıkararak iki lokalize madSTORM görüntüsü arasındaki farkı hesaplayın. Ardından, ikinci madSTORM resmindeki tüm lokalizasyondan ofset miktarını çıkarın. </li><li> İlk madSTORM resmini referans görüntü olarak kullanmanızı ve birinci ve üçüncü, birinci ve dördüncü arasında bu hizalama adımını tekrar etmenizi öneririz. Hizalama işlemine dahil edilmeyen FND&#39;ler arasındaki ofset ölçerek hizalama hassaslığını test edin. Büyük uzaklıklar ardışık madSTORM görüntülerinin ağırlık merkezlerini hesaplarken farklı FND setlerinin kullanıldığını gösterebilir. </li><li> Eğer öyleyse adımlar 2.2.1-2.2.2 shouHizalama yapmak için aynı FND setini kullanarak tekrarlanmalıdır. NOT: Hem AFC sürüklenme düzeltmesi hem de hizalama prosedürleri için özel kodlar sağlanmıştır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Rieger, B., Stallinga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lateral+and+axial+localization+uncertainty+in+super-resolution+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy.</a> Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).</li>
<li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnanometre+single-molecule+localization%2C+registration+and+distance+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).</li>
<li>Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%3A+a+method+for+superresolution+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((madSTORM%3A+a+superresolution+technique+for+large-scale+multiplexing+at+single-molecule+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+super-resolution+imaging+with+photo-switchable+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Erdelyi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+chromatic+offset+in+multicolor+super-resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy.</a> Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).</li>
<li>Gerdes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+single-cell+analysis+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tomographic+super-resolution+fluorescence+imaging+of+serially+sectioned+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples.</a> PLoS One. 7 (5), e38098(2012).</li>
<li>Schubert, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+proteome+topology+and+function+by+automated+multidimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy.</a> Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).</li>
<li>Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk-free+multi-color+STORM+imaging+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore.</a> PLoS One. 9 (7), e101772(2014).</li>
<li>Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+superresolution+imaging+of+multiple+targets+using+a+single+fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore.</a> PLoS One. 10 (4), e0123941(2015).</li>
<li>Hoebe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+light-exposure+microscopy+reduces+photobleaching+and+phototoxicity+in+fluorescence+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging.</a> Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).</li>
<li>Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multitarget+super-resolution+microscopy+with+high-density+labeling+by+exchangeable+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes.</a> Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).</li>
<li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li>
<li>Sarkar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+in+vivo+background+free+imaging+by+selective+magnetic+modulation+of+nanodiamond+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence.</a> Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).</li>
</ol>

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

MadSTORM&#39;daki sıralı çoğullama, sürüklenme düzeltme ve hizalama prosedürleri, hücrelerdeki heterojen yapıların hassas, çok yönlü görselleştirilmesini sağlar. 10 Buna ek olarak, madSTORM, çok uzak olmayan kırmızı renklerin 9 , 12 renk sapması ve alt optimal fotoğraflar / ışık emisyon özellikleri gibi çok renkli STORM&#39;un sınırlamalarını önler. Seyreltme adımı, ardışık olarak bağlanan antikorlardan gelen sterik enterferansı önemli öl...

Işık mikroskopisinin (~ 200 nm) kırınım sınırını aşmak için çeşitli süper-çözünürlüklü mikroskopi teknikleri geliştirilmiştir. Bunların arasında, foto-aktivasyon lokalizasyonu mikroskopisi (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) içeren tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) adı verilen bir teknik kategorisi bulunmaktadır. SMLM teknikleri, (floresan) ve kapalı (karanlık / foto-anahtarlamalı) durumlar arasında değiştirilebilen, floresanın tekli moleküller 1 , 2 , 3&#39;den sıralı lokalizasyona olanak tanıyan flüorofor kullanımını paylaşır. Ticari olarak mevcut boyalar ve mikroskoplar ile uyumluluğu nedeniyle doğrudan STORM (dSTORM) yaygın bir şekilde benimsenen SMLM tekniği haline gelmiştir. DSTORM, bir kırınım merkezinin hesaplanmasında belirsizlik olarak tanımlanan ~ 10 nm lokalizasyon hassasiyetini rutin olarak gerçekleştirebilirIyon sınırlı nokta yayılım fonksiyonu (PSF). Bununla birlikte, lokalizasyon algoritmaları 5 , 6 , 7 kullanılarak yüksek hassasiyet tahmini yapılmasına rağmen, tek moleküllerin gerçek konumunun doğru olarak belirlenmesi bir takım hususlarla engellenmiştir. Birincisi, görüntü yakalama işlemi sırasında mikroskop kademesinin mekanik hareketi, lokalizasyon hassasiyetinde belirgin belirsizlik katmaktadır. SMLM görüntüleri binlerce zaman aşımı karesinden elde edildiğinde, mikroskop kademesinin nano ölçekli hareketi, son süper-çözünürlüklü görüntünün 8 hassasiyetini önemli ölçüde tehlikeye atabilir. Görüntü yakalama işlemi sırasında sahne hareketini telafi etmek için sahne kayması yaygın olarak, kendiliğinden yerleşimlerin resmin kendisinden regresyon temelli uydurulması (çapraz korelasyon) veya referans işaretlerinden sıralı lokalizasyonlar (referans düzeltme 1 , 9 ) ile tahmin edilir. ancak buradanBu yöntemler, her görüntü yığıtı için birden fazla parametrenin optimizasyonunu gerektirir ve mekanik titreşim gibi kısa zaman ölçeklerinde sahne hareketlerini hesaba katamaz. SMLM&#39;de, altın nano parçacıkları ve çok renkli flüoresan boncuklar referans işaretleyiciler olarak kullanılıyor ancak foto-kararlı değiller ve sürüklenme düzeltildikten sonra kullanılan azot boşluğu-merkez flüoresan nano-elmas (FND) değerlerinden çok daha düşük hassasiyetle sonuçlanıyorlar MadSTORM 10&#39;da . Kırılma sınırına ek olarak, ışık mikroskopisi spektral sınırlarla daha da sınırlandırılmıştır. Birden fazla hedefin eşzamanlı olarak görselleştirilmesi, örtüşmeyen spektral profilleri olan flüoresan sondaları gerektirir ve genellikle 6 renk ve SMLM&#39;den flüoresan esaslı ışık mikroskopisi 4 , 11 , 12&#39;ye kısıtlanır. Ayrıca, lineer olmayan renk sapmaları, çok renkli görüntülerin hizalamasına neden olur, wÇok renkli referans işaretleri 8 , 13 kullanarak geniş hizalama prosedürleri gerektirir. Bu sınırların üstesinden gelmek için, daha önceki çalışmalar, ardışık olarak bağlı fluoroforların 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19&#39;un tekrarlayan fotoblokajı veya kimyasal söndürme kullanılarak çoklu hedefleri görüntülemiştir. Bu yöntemler mikroskopik spektrum sınırlarını aşabilmesine karşın floresans ağartma işlemi toksik bir süreçtir20 ve uzun süren ağartma veya söndürme, çapraz bağ kaybı gibi istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Ayrıca, flüoresan probların birikimi, numunedeki bağlanma alanlarının sterik olarak bloke edilmesine ve epitopların geniş çaplı çoğullama ve sağlam hedeflemesine engel olabilir. Bu tür sterik parazitlerden kaçınmak için, son zamanlardaTitizlikle serbestçe yayılmakta olan protein parçalarının stokastik değişimi kullanılarak çoğullama elde edilmiştir 21 . Bu yöntem, hücresel yapıların yoğun şekilde etiketlenmesine izin verirken, peptid parçalarını izole etmek için kapsamlı biyokimyasal hazırlık gerektirir, tek molekül konumlarını bulamaz ve piyasada bulunan problar kullanılarak büyük ölçekli çoğullamayı kolayca kolaylaştırmaz. Çoğaltılmış, antikor boyutuna sınırlı dSTORM (madSTORM) görüntüleme için floresan antikorların sıralı bağlanmasını ve elüsyonunu anlatan ayrıntılı bir video protokolünü sunmak ve hassas sürüklenme düzeltmesi ve hizalama yapmak için flüoresan nano-elmas kullanımı kullanmaktayız.

<table><tbody><tr><td>8 kuyulu lamel odası</td><td>Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>%0.1 Poli-L-Lizin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>NV-100 nm Floresan Nano-elmas</td><td>Adamas</td><td>Kırmızı FND</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 ve epsilon; antikor</td><td>BD Biosciences</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini, Fraksiyon V</td><td>KSE Scientific</td><td>98-100P</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>%10 Paraformaldehit</td><td>EMS</td><td>15712</td><td></td></tr><tr><td>Tatlı su balığı derisinden kanserojen Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647 antikor etiketleme kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür hekzahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td></td></tr><tr><td>BORULARI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154</td><td>Son derece toksik, havaya duyarlı</td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td>Son derece toksik</td></tr><tr><td>Cyclooctatetraene %98</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>138924</td><td>Son derece toksik, havaya duyarlı</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>KD Tıbbi</td><td>RGF-3210</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>KD Tıbbi</td><td>RGF-3385</td><td></td></tr></tbody></table>

madstorm kullanarak t hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Tek molekül lokalizasyonu mikroskopisini kullanarak heterojen hücresel yapıların görüntülenmesi yetersiz lokalizasyon hassasiyeti ve çoklama yeteneği tarafından engellenmiştir. Flüoresan nano elmas referans işaretleyiciler kullanarak, tek moleküllü lokalizasyon mikroskobunda yüksek hassasiyet elde etmek için gereken sürüklenme düzeltme ve hizalama prosedürlerini açıkladık. Ayrıca, floresan antikorlarının ardışık bağlanması ve elüsyonu kullanılarak aynı hücrede birden fazla molekülün hedeflendiği yeni bir çoklama stratejisi madSTORM açıklanmaktadır. MadSTORM, T hücresi reseptör mikroklusteru adı verilen, membrana bağlı, çoklu proteinli yapıdaki farklı bileşenlerin yerlerini görselleştirmek için aktive edilmiş bir T hücresi üzerinde gösterilmiştir. Buna ek olarak, çoklu protein yapılarının görselleştirilmesi için genel bir araç olarak madSTORM&#39;un uygulanması tartışılacaktır.

Sıralı elüsyon ve boyama yöntemi, aktive edilmiş bir Jurkat T hücresindeki mikro kümelerin ve diğer yapıların çoğaltılan madSTORM görüntüsünü üretmek için kullanılmıştır ( Şekil 1 , şekil hizalamalarını kontrol edin). Her sahte renkli görüntü, adım 1.1.1 ila 1.3.13&#39;te elde edilen madSTORM görüntüsünün bir turunu temsil eder. Daha önce açıklandığı gibi 10 , çoklu hedefler arasındaki çapraz izi önlemek için, önceden yıkanmamış antik...

Floro etiketli antikorların ardışık bağlanması ve elüsyonunu kullanarak heterojen nano yapılardaki çoklu molekülleri tek molekül doğruluğu ile görüntüleme yöntemi gösteriyoruz.

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Bu görüntüleme protokolünün genel amacı, tek molekül lokalizasyon mikroskopisi kullanarak aktive olmuş bir T hücresindeki birden fazla proteini görselleştirmektir. Bu yöntem, TCR veya mikroküme bileşenlerinin tek molekül dağılımı gibi T hücresi aktivasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mevcut denetimli çözüm mikroskopisi yöntemleriyle elde edilenden daha yüksek düzeyde çoklama (multiplexing) imkanı sunmasıdır.Başlamak için, üretici tarafından sağlanan etiketleme protokolünü izleyerek, Alexa 647 antikor etiketleme kiti ile antikorları doğrudan Alexa 647 boyasıyla konjuge edin. Etiketlenmiş antikorları 20,800 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, agregat oluşmuş antikorları uzaklaştırmak için süpernatantı toplayın. Ardından, A12 lamella odacıklarını 15 dakika boyunca 0,1% poli-l-lizin ile kaplayın.Ardından, durulama yapmadan solüsyonu aspire edin ve odacıkları 65 °C'de 30 dakika boyunca kurutun. PBS içerisinde 100 nm floresan nanoelmasların veya FND'lerin seyreltisini hazırlayın; her alanda yeterli miktarda FND'nin görünür olduğundan emin olmak için çeşitli seyreltmeleri test edin. Seyreltilmi

highly-multiplexed-super-resolution-imaging-of-t-cells-using-madstorm

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Biz üç test örneklerinin hazırlanması ve nasıl optimize etmek ve STORM mikroskoplar performansını değerlendirmek için kullanılır açıklar. Bu örnekleri kullanarak biz ham veri almak ve daha sonra yaklaşık 30-50 nm çözünürlükte hücrelerinde süper çözünürlüklü görüntüleri elde etmek işlemek için nasıl gösterir.

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için...

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

Çip tabanlı süper çözünürlüklü optik mikroskopi floresan mikroskobu için yeni bir yaklaşım dır ve maliyet etkinliği ve iş akışı avantajları sunuyor. Burada TIRF mikroskobu ve lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi için çip hazırlama ve görüntüleme protokolleri gösterilmiştir.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Burada, formalin-sabit parafin gömülü tümör doku bölümlerinde bağışıklık hücrelerini görselleştirmek, ölçmek ve haritalamak için basit ve erişilebilir bir strateji tanımlıyoruz. Bu metodoloji, mevcut görüntüleme ve dijital analiz tekniklerini görüntüleme testlerinin çoklama yeteneğini ve multiparametre analizini genişletmek amacıyla birleştirir.

Tümör Mikroortamında Bağışıklık Hücre Popülasyonlarının Görselleştirilmesi, Ölçülmesi ve Haritalanması

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Öğrenin, aktive T hücrelerinde tek molekül lokalizasyon mikroskobisi kullanarak çoklu protein görüntüleme yöntemini. Bu teknik, geleneksel yöntemlerden daha fazla çoğullama sağlayarak immünoloji araştırmalarında yeni olanaklar sunar.

Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Daha fazla video keşfet