Madstorm kullanarak T hücrelerinin çok yönlü, süper çözünürlüklü görüntüsü

Bu görüntüleme protokolünün genel amacı, tek molekül lokalizasyon mikroskopisi kullanarak aktive olmuş bir T hücresindeki birden fazla proteini görselleştirmektir. Bu yöntem, TCR veya mikroküme bileşenlerinin tek molekül dağılımı gibi T hücresi aktivasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mevcut denetimli çözüm mikroskopisi yöntemleriyle elde edilenden daha yüksek düzeyde çoklama (multiplexing) imkanı sunmasıdır.

Başlamak için, üretici tarafından sağlanan etiketleme protokolünü izleyerek, Alexa 647 antikor etiketleme kiti ile antikorları doğrudan Alexa 647 boyasıyla konjuge edin. Etiketlenmiş antikorları 20,800 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, agregat oluşmuş antikorları uzaklaştırmak için süpernatantı toplayın. Ardından, A12 lamella odacıklarını 15 dakika boyunca 0,1% poli-l-lizin ile kaplayın.

Ardından, durulama yapmadan solüsyonu aspire edin ve odacıkları 65 °C'de 30 dakika boyunca kurutun. PBS içerisinde 100 nm floresan nanoelmasların veya FND'lerin seyreltisini hazırlayın; her alanda yeterli miktarda FND'nin görünür olduğundan emin olmak için çeşitli seyreltmeleri test edin. Seyreltilmiş FND'leri bir dakika boyunca vorteksleyin.

Ardından, FND süpernatantını yüksek güç ayarında 30 saniye boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun. Sonikasyona uğramış FND süpernatantını, poli-l-lizin kaplı bir A12 lamel odacığında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Odacığı 1x PBS ile beş kez yıkadıktan sonra, FND kaplı odacığı turf mikroskobunda 647 nanometre lazer eksitasyonu kullanarak görselleştirin.

61 by 61 mikron görüş alanı sağlayan 100x objektif kullanın. FND'lerin uygun seyreltilmesi durumunda, görüş alanında ideal olarak dört ila 10 adet tekil FND görünmeli ve görüntüleme alanının her bir çeyreğinde en az bir FND bulunmalıdır. Uygun FND yoğunluğu elde edildikten sonra, her bir kuyucuğa 250 microliters anti-CD3 antikoru ekleyin.

Hücre odasını 37 °C'de bir saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, solüsyonu kuyucuklardan uzaklaştırın ve 30 saniye boyunca 1x PBS ekleyin. Bu yıkama adımını beş kez tekrarlayın.

Bir mililitre Jurkat T hücresini 800 ×g hızda altı dakika boyunca santrifüjleyin. Jurkat T hücreleri, santrifüjden önce ideal olarak mililitre başına 0,5 ila bir milyon hücre konsantrasyonunda olmalıdır. Hücreleri 300 µL 1x HBS solüsyonunda yeniden süspande edin.

Bu sırada, odacığın her kuyucuğuna 150 µL 1x HBS çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Ardından, her kuyucuğa 50 µL resüspande edilmiş Jurkat T hücreleri ekleyin ve 37 °C'de üç dakika inkübe edin. Sonrasında, her kuyucuğa 300 µL %4 paraformaldehit ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.

1x PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 microliters %0,1 Triton x çözeltisi ekleyerek hücreleri permeabilize edin. 1x PBS ile yapılan üç ek yıkamanın ardından, her kuyucuğa oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 microliters %1 balık jelatini çözeltisi ekleyin. Son olarak, hücreleri 1x PBS ile üç kez daha yıkayın.

Fikse edilmiş hücrelere, oda sıcaklığında bir saat boyunca 0,1 ile 0,5 µg/mL konsantrasyonda 200 µL işaretli antikor ekleyin. Hücreleri 1x PBS ile beş kez yıkadıktan sonra, bir mL STORM tamponu ekleyin ve maruziyeti sınırlamak için hazneyi bir cam lamel ile kapatın. Lamel haznesini konumunda tutmak için mikroskop tablasındaki kıskaçları kullanın.

Birkaç yıkama ve inkübasyon turundan sonra aynı görüş alanının korunması gerektiğinden, bu adım geniş ölçekli multipleksleme için kritik öneme sahiptir. Turf modunda düşük 647 nanometre lazer gücü kullanarak, görüş alanında en az üç FND içeren boyanmış bir hücre tespit edin. 647 nanometre lazer gücünü artırın ve görüntüleri edinin.

Tipik parametreler metin protokolünde bulunabilir. Hücreleri beş kez 1x tris-tamponlu salin veya 1x TBS ile yıkayın. Ardından, bir mililitre elüsyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin.

Elüsyon işlemini üç kez tekrarlayın. Her antikor için belirtilen tam elüsyon koşullarını ve sinyali gidermek için gerekli olan elüsyon durulama sayısını kullanın. Ardından, hücreleri 1x TBS ile üç kez yıkayın ve bir mililitre 1x PBS ekleyin.

Bu elüsyon adımının uygun şekilde yürütülmesi, önceden bağlanmış antikorun uzaklaştırılmasını sağlayacak ve sonraki antikor etiketleme işlemi için daha yüksek verimlilik sunacaktır. Elüsyon adımları arasında çökmeyi en aza indirmek için yıkamalarda TBS kullanılması önemlidir. Karanlık durumdaki Alexa 647 boyalarını fotoaktive etmek için hücreleri, iki ila beş milliwatt gücünde 405 nanometre bir lazer ve yüksek güçte 647 nanometre bir lazer kullanarak fotobeyazlatın.

Elüye edilmemiş antikorlardan gelen tüm kalan sinyal fotobleyç (foto-ağarma) ile yok olana kadar bekleyin. Bu işlem genellikle iki ila beş saniyelik lazer maruziyeti gerektirir. Sinyalin kalktığını doğrulamak için illüzyon ve fotobleyç sonrası STORM ayarlarını kullanarak örnek görüntüler elde edin.

Ardından, 15 dakika boyunca 250 µL %4 paraformaldehit ekleyin. Bu işlem, hücredeki fikse edilmiş moleküllerin ters çapraz bağlanmasını önler. Hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın.

Birden fazla hedefin ardışık etiketlenmesi için bu adımları tekrarlayın. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı şekilde, multipleks görüntü yığınlarının kayma düzeltmesini ve hizalamasını gerçekleştirin. Aktive edilmiş bir Jurkat T hücresindeki mikro kümelerin ve diğer yapıların multipleks MET STORM görüntüsünü oluşturmak için ardışık illüzyon ve sabit durma yöntemi kullanılmıştır.

Final MET STORM görüntüsü, ortalama fidusiyal düzeltme ve FND fidusiyal markörleri kullanılarak sürüklenme ve hizalama açısından düzeltilmiştir. Burada, ortalama fidusiyal düzeltme ile sürüklenme düzeltmesi öncesi ve sonrasında, 30.000 görüntü karesinde lokalize edilmiş tek bir FND'nin tek molekül lokalizasyon mikroskopi görüntüleri gösterilmektedir. Benzer şekilde, burada anti-fosforile SLP76 antikoru ve FND fidusiyal markörleri ile boyanmış aktive bir Jurkat T hücresinin, ortalama fidusiyal düzeltme ile sürüklenme düzeltmesi öncesi ve sonrasındaki tek molekül lokalizasyon mikroskopi görüntüleri yer almaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, MET STORM kullanarak aktive edilmiş bir T hücresindeki proteinlerin çoklu süper çözünürlüklü görüntülemesinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik her bir çoklama turu için üç saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, örneğin mikroskop tablası üzerinde aynı konumda tutulduğundan emin olmak önemlidir.

Bu işlem sahne klempleri kullanılarak yapılabilir. Modifiye STORM tamponu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken respiratör ve koruyucu gözlük gibi önlemler her zaman alınmalıdır.