Bir xarakteristikaları ve fare çene kemiğinde düzgün için hücresel analiz yöntemi

Bu deneyin genel amacı, radyograflardaki morfometrik ölçümler ve histolojik analizler kullanarak farelerin mandibuler kondiler kıkırdağındaki kompresif yüklemenin etkilerini gözlemlemektir. Bu metrikler, kemirgenlerin mandibula kondilindeki yapısal ve hücresel değişikliklere ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Burada gösterilen tekniğin temel avantajı, diğer küçük kemikli veya eklemli hayvanların analiz edilmesi için de kullanılabilmesidir.

Bu protokol için izole edilmiş, diseke edilmiş fare mandibula örneklerini kullanıma hazır hale getirin. Mandibulaları bir Petri kabı içerisinde röntgen kabini sistemine aktarın. Ardından, 26 kilovolt değerinde beş saniye boyunca radyografileri çekin.

Şimdi, morfometrik ölçümler yapmak için görüntüleri analiz yazılımında açın. İlk olarak, ölçek çubuğunu ayarlamak için birim düğmesini kullanın. Ardından, marker stili 2'yi kullanarak altı anatomik nokta seçin.

İlk olarak, mandibuler kondilin en posterior noktalarını birinci nokta olarak seçin. Ardından, ikinci nokta için incisura process'i seçin. Daha sonra, üçüncü nokta için sigmoid çentiğinin en derin noktasını seçin.

Ardından, mandibuler ramus konkavitesinin en derin noktası olan dördüncü noktayı ve sonrasında kondiler eklem yüzeyinin en anterior noktası olan beşinci noktayı seçin. Şimdi, kondiler eklem yüzeyinin en posterior noktasını altıncı nokta olarak seçin ve uzunluk aracıyla uzunluk ölçümlerini almaya devam edin. Daha sonra, kondil başı uzunluğunu ölçmek için üç ve dört noktaları arasından dik çizgi aracını kullanın; bu uzunluk, birinci noktadan üç ve dört noktaları arasındaki çizgiye olan dik uzaklıktır.

Ardından, bir ve iki noktaları arasındaki mandibula uzunluğunu ölçün. Son olarak, beş ve altı noktaları arasında yer alan kondil başı genişliğini ölçün. Verileri kaydetmek için ekranın sağ tarafındaki ölçüm listesini kopyalayın.

Fikse edilmiş ancak dekalsifiye edilmemiş mandibulleri gömmeye başlamadan önce, gece boyunca PBS içindeki yüzde 30'luk sakkaroz çözeltisinde bekletin. Ertesi gün, fazla yumuşak dokuları disseksiyonla uzaklaştırın ve mandibular kondili dikkatlice kesin. Şimdi, örnekleri kondilin medial yüzeyi kalıbın tabanına gelecek ve örnek kalıbın altına paralel olacak şekilde plastik kalıplara yerleştirin.

Ardından, bunları gömme reçinesine daldırın ve reçineyi bir parça kuru buzla soğutun. Sonra, kalıpları daha fazla gömme reçinesi ile tamamlayın. Bunları, dondurucu veya kuru buzla soğutulmuş soğuk iki metil butana aktarın.

Soğutulduktan sonra, örnekleri kesme işlemi için -20 °C veya -80 °C'de saklayın. Kondillerin sagital kesitlerindeki MCC'de Col10a1 ekspresyonunu nicelleştirmek için, histolojik görüntüleri bir görüntü analiz yazılım paketinde açın ve kement (lasso) aracını kullanarak ilgilenilen alanı seçin. Bu örnekte, MCC bölgesi seçilmiştir.

Histogram kutusunda bildirilen alandaki piksel sayısını not edin. Ardından, renk aralığını ayarlayarak Col10a1 kırmızı piksellerini seçin. Görüntüden kırmızı bir piksel seçmek için damlalık aracını kullanın ve Tamam'a tıklayın. Daha sonra, histogram kutusunda bildirilen alandaki kırmızı piksel sayısını kaydedin.

Alandaki kırmızı piksellerin oranı, Col10a1 ekspresyon miktarını temsil eder. Şimdi, aynı temel tekniği kullanarak, MCC ve subkondral kemikteki TRAP aktivitesini kantifiye edin. İlk olarak, analiz edilecek alanlar olarak subkondral kemik bölgelerindeki kıkırdağı seçin ve toplam piksel sayısını not edin.

Ardından, ELF97 substratı tarafından oluşturulan sarı pikselleri seçin. Pozitif piksel sayısını kaydedin ve TRAP pozitif piksellerin oranını hesaplayın. Şimdi, DEPI ile maviye karşıt boyanan EDU pozitif hücreleri nicelendirin.

Tekrar ilgi alanını seçin ve ardından buradaki mavi pikselleri nicelendirin. Aynı bölgedeki EDU pozitif piksellerin sayısını belirlemek için de bu yöntemi kullanın. Kompresif TMJ yüklemesine tabi tutulan farelerin morfometrik ölçümleri, yüklemenin mandibula ve kondil başı uzunluğunu anlamlı şekilde artırdığını göstermiştir.

Buna rağmen, yükleme kondil genişliğinde anlamlı bir değişikliğe yol açmamıştır. Kollajen dağılımının kantifikasyonu, yüklenen hayvanların kondillerinde Col10a1 ekspresyonunda ve MCC değerinde anlamlı bir artış olduğunu ortaya koymuştur. Öte yandan, Col2a1 ekspresyonu kontrol grubuyla karşılaştırıldığında çok farklı değildi.

Kondillerin subkondral bölgesinde ve yüke maruz kalan farelerde TRAP aktivitesi ile sub proliferasyon artış göstermiştir. EDU boyaması, proliferatif hücre sayısını belirtmektedir. MCC'deki proteoglikan dağılımı, Toluidine blue boyanmış alan ve mesafe haritası değerlendirilerek nicelleştirilmiştir.

Yüklü grubun kondil MCC'lerinde mesafe haritalamasında anlamlı bir artış vardı. Ancak, proteoglikan boyalı alan gruplar arasında istatistiksel olarak farklı değildi. Bu videoyu izledikten sonra, kemirgenlerin mandibüler kondilindeki hücresel ve yapısal değişikliklerin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.