Hematopoetik kök hücre transplantasyonu Hemoglobinopati olan hastalar için sonra kalan donör Erythroid progenitör hücre algılama

Bu prosedürün genel amacı, kök hücre nakli bağlamında kimerizmi izlemektir. Bu yöntem, hemoglobinopatileri olan hastalar için hematopoetik kök hücre naklinin engraftmanı gibi nakil alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, eritroid kompartmandaki progenitörlerin proliferasyonunu ve diferansiyasyonunu değerlendirmek için akış sitometrisi tabanlı hücre ayıklamayı, kolon bilgi analizini ve ardından kısa tekrarlı dizilerin (STR) analizini birleştirmesidir.

Bu tekniğin çıkarımları, hastalığın nüksetmesine yatkın hastaların belirlenmesine ve ardından gelecek immünomodülatör stratejilerin başlatılmasına yardımcı olabileceği için greft alt red tedavisine kadar uzanmaktadır. Dahası, bu yöntem gelecekteki klinik çalışmalara, kök hücre araştırmalarına ve cilt tedavisi denemelerinin tasarımına da uygulanabilir. Süreç öğrenilmesi zor olduğundan ve eğitimli personel tarafından uygulanması gerektiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterimi kritik öneme sahiptir.

Bu prosedürü, laboratuvarımdaki teknisyen Elisabeth Hoflehner gerçekleştirecek. Başlamak için, yağ boyaması için kemik iliği örneğinin tek hücreli süspansiyonunu hazırlayın. Bunun için, kemik iliğini içeren bir hücre süzgecini santrifüj tüpünün üzerine yerleştirip vidalayın.

Doku parçalarını süzgeçten geçirmek için şırınga pistonunu kullanın. Tüm materyali toplamak için birkaç mililitre süspansiyon tamponu ile durulayın. Bir santrifüj tüpüne üç mililitre gradyan ortamı ekleyin ve tek hücreli süspansiyonu bunun üzerine dikkatlice katmanlayın.

Tüpü 20 °C'de, hızlanma dokuzu ve yavaşlama sıfır olarak ayarlanmış şekilde 30 dakika boyunca 550 G'de santrifüjleyin. Arayüzdeki mononükleer hücre tabakasını bozmamaya dikkat ederek, plazma ve trombositleri içeren üst tabakayı pipetle alın. Bu mononükleer hücre tabakasını bir santrifüj tüpüne aktarın.

Ardından, hücreleri 10 mL süspansiyon tamponu ile yıkayın. Tüpü 4 °C'de, 250 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri pipetleme yoluyla 2 mL complete isokov's modified dulbecco's medium içinde yeniden süspanse edin.

Hemsitometre ile hücre konsantrasyonunu belirlemek için, 96 kuyucuklu bir plakaya 95 µL %2 trypan blue boyası ekleyin. Üzerine beş µL hücre süspansiyonu ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında kısa bir süre inkübe edin. Hemsitometreyi doldurun ve mikroskop altında gözlemleyin.

Yalnızca boyanmış canlı hücreleri sayın. Ardından, hücre süspansiyonunu 25 °C'de 250 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. FC reseptörünü bloke etmek için 100 µL başına 2,5 µg blok kullanın.

10 ila 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri boyamak için kullanılan hacme uygun, önceden titre edilmiş monoklonal antikor kombinasyonunu ekleyin. Karanlıkta, 4 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.

Hücreleri üç mililitre boyama tamponu ile yıkayın ve ardından santrifüjleyin. Hücre konsantrasyonunu ayarladıktan sonra, agregatları uzaklaştırmak için hücre süspansiyonunu 70 mikrolitrelik bir hücre süzgecinden pipetleyerek standart bir akış sitometrisi tüpüne aktarın. Ardından, hücre ayırıcıyı ve yazılımı üretici talimatlarına göre kurun ve optimize edin.

İleri saçılım (FSC) ve yan saçılımı (SSC) görüntülemek için iki değişkenli bir grafik içeren bir şablon oluşturun. İlgilenilen hücre popülasyonunu ölçeklendirmek için hücreleri sorter cihazında çalıştırın ve FSC ile SSC değerlerini ayarlayın. Negatif kontrol tüpünün verilerini kaydederek başlayın, ardından her bir tekli boyama kompanzasyon kontrol tüpünün verilerini kaydedin ve kompanzasyonu hesaplayın.

Bundan sonra, hem lenfositik hem de myeloid hücreleri dahil etmek için deneysel örnekleri iki değişkenli bir FSC, SSC nokta grafiği üzerinde gabe edin. FSC'nin farklı sinyallerini karşılaştırarak dubletleri ve agregatları hariç tutun. Ardından, CD45 ve CD36 sergileyen tekli hücreleri iki değişkenli bir nokta grafiği üzerinde görselleştirin.

CD45 pozitif olaylar lökositleri ve öncüllerini temsil eder. CD45 negatif ve CD36 pozitif olaylar ise eritroid öncülleri temsil eder. CD36 pozitif ve CD45 pozitif hücreleri tanımlamak için kapılama (gating) araçlarını kullanın ve ardından CD45 pozitif olayları ve CD34 ile SSC parametrelerini görüntüleyen başka bir nokta grafiğini görselleştirin.

Ardından, CD34 pozitif hücreleri veya lökosit progenitörlerini ve farklı farklılaşma aşamalarındaki SSC yüksek hücreleri veya miyeloid hücreleri tanımlamak için kapılama (gating) araçlarını kullanın. Bundan sonra, harici toplama tüplerine sıralama yapmak için kapıları seçin. Son olarak, istenen sayıda hücre elde edilene kadar hücre sıralama işlemini 4 °C'de sürdürün.

Hücreleri, insan rekombinant eritropoietin veya EPO ile desteklenmiş tamamlanmış IMDM medyumu ekleyerek seyreltin. Seyreltilmiş hücrelerin 300 mikrolitresini üç mililitre H4434 medyumu içerisine aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin. Ardından, üç adet 35 milimetrelik kaba, her birine bir mililitre hücre süspansiyonu gelecek şekilde ekim yapın.

İki kültür kabını, suyla doldurulmuş üçüncü bir kapla birlikte 100 milimetrelik bir plakaya yerleştirin. Bu hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 degree celsius sıcaklıkta ve %5 carbon dioxide ortamında 14 gün boyunca kültüre edin. Kolonileri morfolojilerine göre puanlamak için 40x büyütmede bir ters mikroskop ve üzerinde puanlama ızgarası bulunan kültür kabını kullanın.

Koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları; multipotent progenitör hücreler, granülosit monosit progenitör hücreler, eritroid burst oluşturan birimler ve eritroid koloni oluşturan birim hücreler olarak sınıflandırın. Başlamak için, hücreleri metin protokolüne uygun olarak fax'tan veya CFU analiz plağından geri kazanın ve DNA ekstraksiyonuna geçin. Hücreleri santrifüj ettikten sonra, peletten nükleik asit izole etmek için otomatik bir kan DNA izolasyon cihazı kullanın.

DNA konsantrasyonunu bir florometre kullanarak ölçün. Numuneleri üretici talimatlarına göre hazırlayın ve ardından numuneyi florometrenin numune haznesine yerleştirin. Kullanım kılavuzuna uygun olarak bir PCR reaksiyonu kurmak için, seyreltilmiş DNA'yı DNA polimeraz, primer seti ve reaksiyon karışımından oluşan karışıma ekleyin.

Negatif kontrol olarak donör ve alıcıdan alınan transplant öncesi DNA'nın yanı sıra nükleaz içermeyen su ve pozitif kontrol olarak 9947A ekleyin. PCR sonuçlarını analiz etmek için, denatüre edilmiş 10 µL DNA örneklerini 96 kuyucuklu bir reaksiyon plağının kuyucuklarına ekleyin. Plağı mühürleyin, kısa süreli santrifüjleyin ve plağı buz üzerine yerleştirin.

Megakaryosit eritroid progenitörleri, CD36 pozitif ve CD45 antijeni negatif popülasyon olarak ayrıştırılmıştır. Ek olarak, CD45 pozitif ve CD34 pozitif hücreler lenfoid miyeloid prekürsörler, yüksek SSC sinyaline sahip CD45 pozitif hücreler ise olgun miyeloid hücreler olarak tanımlanmıştır. Sortlama sonrası eritroid progenitör hücrelerin saflığı %85'in, miyeloid hücrelerin saflığı ise %95'in üzerindeydi. CD34 spesifik manyetik boncuklarla ayrılan kemik iliği hücreleri 14 gün boyunca kültüre edilmiştir.

Bu hücrelerin bazılarının çoğaldığı, farklılaştığı ve koloniler oluşturduğu görülmektedir. Çeşitli konsantrasyonlarda EPO ile stimülasyon, belirgin şekilde kırmızı eritroid kolonilerin oluşumunu artırmıştır. Alıcı ve donör DNA'ya özgü kısa tandem tekrarların veya STR'lerin PCR analizi, hücrelerdeki kimerizmi tespit edebilir.

Bu yöntem, kemik iliği hücrelerinin hücre ayıklama işleminden elde edilen hücrelerde ve klonojenik analizden elde edilen hücrelerde, alıcıya karşı donör DNA miktarını başarıyla belirlemiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, tekniğin standartlaştırılması ve uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmesi gerektiğinin unutulmaması önemlidir.

Bu prosedürü takiben, genetik olarak düzeltilmiş eritroid kök hücrelerin seçici avantajı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, donör kaynaklı kalıntı eritroid progenitor hücreler daha ayrıntılı olarak analiz edilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kök hücre transplantasyonu alanındaki araştırmacıların eritroid kompartmanındaki progenitorlerin proliferasyon ve diferansiyasyonunu incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hemoglobinopatisi olan hastalarda kök hücre transplantasyonu sonrası engraftman takibinin nasıl yapılacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.