Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Bu prosedürün genel amacı, iki farklı fetal kök hücre türünden episomal yeniden programlama yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücreleri verimli bir şekilde elde etmektir. Bu yöntem; doku mühendisliği, hastalık modelleme, temel araştırmalar veya boylamsal çalışmalar için pluripotent kök hücre kaynağı sağlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, iPSC'lerin yeniden programlanması ve olgunlaşmasının kimyasal olarak tanımlanmış koşullarda gerçekleşmesi ve potansiyel pediatrik hücre bazlı tedaviler için erken aşamada erişilebilir olmasıdır.

Bu prosedürü, baş araştırmacı Steven McClellan ve ben uygulamalı olarak göstereceğiz. Doğumu takiben plasentaları mümkün olan en kısa sürede temin edin. Amniyondan dokuz santimetrekarelik bir segment kesin ve bunu, antibiyotik-antimikotik çözelti ile desteklenmiş 30 mL PBS içeren 50 mm'lik bir santrifüj tüpü içerisinde yıkayın.

Membranlardaki kan pıhtılarını temizleyin ve ardından steril bir 10 santimetrelik doku kültürü kabında, bir çift ince bisturi kullanarak membranları küçük parçalara ayırın. Parçalanmış membran dokusu kitlesini, 4,7 mililitre RPMI-1640 besiyeri içeren bir doku disosyasyon tüpüne aktarmak için bisturi uçlarını kullanın. Disosyasyon enzimlerini ekleyerek karıştırın.

Tüpü doku ayrıştırıcıya yerleştirin ve h_tumor_01 programını çalıştırın. Ardından tüpü, sallayıcı bir platform üzerinde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Süspansiyonu 35 mL RPMI-1640 ile daha fazla seyreltin ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilmiş 70 µm'lik bir süzgece uygulayın.

Oda sıcaklığında, 200 ×g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı attıktan sonra, peleti beş mililitre RPMI-1640 içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Hücreleri, hücre kümeleri halinde, santimetrekareye yaklaşık 10.000 hücre düşecek yoğunlukta,le yeni hazırlanmış ve antibiyotik, antimikotik solüsyon eklenmiş AFMC besiyerli doku kültürü flasklarına ekleyin.

Bir T75 flask içerisindeki hücre tabakasına iki mililitre hücre ayırma enzimi ekleyerek, yeniden programlama için düşük pasaj numaralı amniyotik sıvı ve membran kök hücrelerini hasat edin. 37 °C'de beş ila sekiz dakika inkübe edin. 200 ×g'de 45 dakika santrifüjlemeden sonra, pellet'i bir mililitre PBS içerisinde yeniden süspande edin ve serum bileşenlerini yıkamak için iyice karıştırın.

Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Ardından hücre yoğunluğunu mililitre başına 100,000 PBS hücresi olacak şekilde ayarlayın ve 1,5 mililitrelik mikrosantrifüg tüplerine paylaştırın. Mikrosantrifüg tüplerini, standart bir salınımlı rotorla santrifüj etmeye olanak sağlamak için beş mililitrelik polistiren tüplerin içine yerleştirin ve oda sıcaklığında, 200 ×g hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüj işleminden sonra tüpleri ters çevirin, süpernatantı bir atık konteynerine boşaltın ve ardından 200 ×g'de üç dakika boyunca ek bir santrifüjleme adımı gerçekleştirin. Santrifüj sonrası, tüplerde kalan sıvıyı dikkatlice aspire etmek için 200 µL'lik bir pipet kullanın. Transfeksiyon uçlarını, tüpü, resüspansiyon tamponunu ve elektrolitik tamponu doku kültürü kabinine yerleştirin.

Transfeksiyon cihazını, tüp istasyonu doğrudan kabine yerleştirilebilecek şekilde yaklaştırın. Bir transfeksiyon tüpünü üç mililitre elektrolitik tamponla doldurun ve tüpü, yuvanın içine tamamen iterek istasyona monte edin. Daha önceden hazırlanmış yeniden programlama plazmit solüsyonu alikotlarını -80 °C depolama alanından çıkarın ve kültür kabininde oda sıcaklığında çözülmeye bırakın.

Cihazdaki transfeksiyon parametrelerini 950 volt değerinde 40 milisaniyelik tek bir darbe verecek şekilde ayarlayın. 100.000 hücre içeren peleti 10 µL resüspansiyon tamponunda yeniden süspande edin. Hızlıca hareket ederek, yeniden süspande edilen hücrelere yeniden programlama plazmid çözeltisinin 1/10'unu ekleyin.

Transfeksiyon ucunu transfeksiyon pipetine monte edin. Ardından, hava kabarcığı oluşumundan dikkatle kaçınarak hücre süspansiyonunu transfeksiyon ucuna aspire edin. Transfeksiyon pipetini transfeksiyon tüpüne yerleştirin.

Ardından, transfeksiyon cihazının ekranındaki başlat düğmesine basın. Ekran üzerinde transfeksiyonun başarısına ilişkin mesajın çıkmasını bekleyin. Daha sonra pipeti tüpten hemen çıkarın.

Süspansiyonu, hedef altı kuyucuklu plakaların bir kuyucuğuna boşaltın. Komşu bir kuyucuktaki besiyerini ekleyerek karıştırın ve süspansiyonu her iki kuyucuğa eşit şekilde dağıtın. Transfeksiyon işlemini hücre içeren her bir mikrosantrifüj tüpü için tekrarlayın.

Beş PCR tüpüne 30 µL 0,5 mM EDTA ve PBS ekleyerek başlayın. Ardından, 2 µL'ye ayarlanmış 10 µL'lik bir pipete uç takın. Pipet ucunu koloni kenarında bir açıyla tutun ve tüm koloniyi yüzeyden dikkatlice ve kademeli olarak sıyırın.

Koloninin tamamını hemen pipet ucuna çekin ve EDTA içeren hazırlanan PCR tüplerinden birine aktarın. Bu işlemi diğer dört koloni için de tekrarladıktan sonra, oda sıcaklığında dört ila altı dakika inkübe edin. Koloniyi daha küçük kümeler halinde parçalamak için, her bir hücre süspansiyonunu daha büyük bir pipet ucuyla nazikçe aşağı yukarı pipetleyin.

Tek hücreli süspansiyon oluşturmaktan kaçının. Ardından, süspansiyonu doğrudan rekombinan vitronektin kaplı 24 kuyucuklu plakanın hedef kuyucuğuna ekleyin. İşlemi geri kalan koloniler için tekrarladıktan sonra üç ila altı gün boyunca inkübe edin.

Koloniler büyüyüp kompakt hale geldiğinde, dört ila altı gün sonra, hücre tabakalarını 300 µL 0.5 mM EDTA ile yıkayın ve hemen aspire edin. Ardından 300 µL daha ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. EDTA'yı aspire ettikten sonra, bir mililitrelik pipeti tam kapasiteye ayarlayın, bir mililitrelik geniş ağızlı ucu takın ve vitronectin kaplı altı kuyucuklu plakanın hedef kuyucuğundan E8 medyumunu aspire edin.

iPSC kültürünü yıkamak için kaynak plakanın bir kuyucuğuna besiyeri püskürtün. Ardından süspansiyonu hedef kuyucuğa aktarın ve kolonileri 20 ila 40 hücrelik kümeler halinde parçalamak için pipetle birkaç kez çekip bırakın. Tüm hücreleri ektikten sonra, plakayı hafifçe sallayarak ve hareket ettirerek kümelerin eşit şekilde dağıldığından emin olun.

Ardından, kümelerin yapışması ve kolonilerin büyümesi için plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Yeniden programlama için kaynak hücreleri temsil eden amniyotik sıvı ve membran kök hücreleri, uzamış ve faz-parlak tipik bir mezenkimal morfoloji sergiler. Hücreler, mezenkimal-epitelyal geçişten geçtikten sonra epitelyal özellikler kazanır ve bu durum, parke taşı benzeri hücrelerden oluşan kolonilerin oluşumuna yol açar.

Bu koloniler çoğalarak MET hücrelerinden oluşan düzensiz hücresel kütleler oluşturur. Yeniden programlamanın daha sonraki aşamalarında, sınırları belirgin ve tek tek ayırt edilebilen hücrelerden oluşan, tamamen yeniden programlanmış hücre kolonileri ortaya çıkar. Bu tamamen yeniden programlanmış hücreler, sayıca daha fazla olan MET kolonilerinin yanında bulunur.

Tam olarak yeniden programlanmış, izole edilmiş olgun bir klon burada gösterilmektedir. iPSC türetimi ve olgunlaşmasının ardından, bunlar ayrıntılı karakterizasyona tabi tutulabilir ve çeşitli hücre tiplerine farklılaşmaları yönlendirilebilir. Patojen varlığına karşı test edilmemiş insan dokularıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve biyogüvenlik kabininde çalışma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, fetal kök hücrelerde pluripotensinin nasıl indükleneceği, hangi reaktiflerin ve ekipmanların kullanılacağı ve pluripotent kök hücrelerin rutin olarak nasıl kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.