Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Bu prosedürün genel amacı, iki farklı fetal kök hücre türünden epizomal yeniden programlama yoluyla indüklenmiş pluripotent kök hücreleri verimli bir şekilde türetmektir. Bu yöntem, doku mühendisliği, hastalık modellemesi, temel araştırma veya boylamsal çalışmalar için bir pluripotent kök hücre kaynağı sağlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, iPSC'lerin yeniden programlanmasının ve olgunlaşmasının, potansiyel pediatrik hücre bazlı tedaviler için erken mevcut olmasına rağmen, kimyasal olarak tanımlanmış koşullarda gerçekleşmesidir.

Bu prosedürü gösteren, baş araştırmacı Steven McClellan ve ben olacağız. Doğumdan sonra mümkün olan en kısa sürede plasenta alın. Amniyonun dokuz santimetre karelik segmentini kesin ve antibiyotik, antimikotik çözelti ile desteklenmiş 30 mililitre PBS ile 50 milimetrelik bir santrifüj tüpünde yıkayın.

Membranlardan kan pıhtılarını çıkarın ve ardından steril bir 10 santimetrelik doku kültürü kabında membranları ince parçalara ayırmak için bir çift ince neşter kullanın. Kıyılmış zar doku kütlesini 4.7 mililitre RPMI-1640 ortamı içeren bir doku ayrışma tüpüne aktarmak için neşter bıçaklarını kullanın. Ayrışma enzimlerini karıştırın.

Tüpü doku ayrıştırıcısına monte edin ve h_tumor_01 programını çalıştırın. Daha sonra tüpü 37 santigrat derecede sallanan bir platformda 30 dakika inkübe edin. Süspansiyonu 35 mililitre RPMI-1640 ile daha da seyreltin ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir süzgecin üzerine uygulayın.

Oda sıcaklığında 200 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti beş mililitre RPMI-1640 içinde yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre kümelerindeki hücreleri, santimetre kare başına yaklaşık 10.000 hücre yoğunluğunda, antibiyotik, antimikotik çözelti ile desteklenmiş taze hazırlanmış AFMC ortamı ile doku kültürü şişelerine tohumlayın.

Hücre tabakasına iki mililitre hücre ayrılma enzimi ekleyerek bir T75 şişesinden yeniden programlama için düşük geçiş sayılı amniyotik sıvı ve zar kök hücrelerini hasat edin. 37 santigrat derecede beş ila sekiz dakika inkübe edin. 45 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjlemeden sonra, peleti bir mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve serum bileşenlerini yıkamak için iyice karıştırın.

Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra hücre yoğunluğunu mililitre PBS başına 100.000 hücreye ayarlayın ve şimdi 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine dörde bölün. Mikrosantrifüj tüplerini normal bir salınımlı dümende santrifüjlemeye izin vermek için beş mililitrelik polistiren tüplere yerleştirin ve oda sıcaklığında dört dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin.

Döndürme işleminden sonra, tüpleri ters çevirin ve süpernatanı bir atık kabına atın ve ardından üç dakika boyunca 200 kez g'de ek bir santrifüjleme adımı gerçekleştirin. Sıkma işleminden sonra, tüplerden kalan sıvıyı dikkatlice aspire etmek için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Transfeksiyon uçlarını, tüpü, yeniden süspansiyon tamponunu ve elektrolitik tamponu doku kültürü kabinine yerleştirin.

Transfeksiyon cihazını, tüp istasyonunun doğrudan kabine yerleştirilebilmesi için yaklaştırın. Bir transfeksiyon tüpünü üç mililitre elektrolitik tamponla doldurun ve tüpü yuvanın içine kadar iterek istasyona monte edin. Eksi 80 santigrat derece saklama alanından önceden hazırlanmış yeniden programlama plazmid çözeltisi alikotlarını çıkarın ve kültür kabininde oda sıcaklığında çözülmelerine izin verin.

950 voltta 40 milisaniyelik bir darbe vermek için cihazdaki transfeksiyon parametrelerini ayarlayın. 10 mikrolitre yeniden süspansiyon tamponunda 100.000 hücre içeren peleti yeniden süspanse edin. Hızlı çalışarak, yeniden programlanan plazmit çözeltisinin 1 / 10'unu yeniden süspanse edilmiş hücrelere ekleyin.

Transfeksiyon ucunu transfeksiyon pipetine monte edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu transfeksiyon ucuna dikkatlice aspire edin ve hava kabarcıklarının oluşmasını önleyin. Transfeksiyon pipetini transfeksiyon tüpüne yerleştirin.

Ve transfeksiyon cihazındaki ekrandaki başlat düğmesine basın. Transfeksiyonun başarısı ile ilgili ekran mesajını bekleyin. Ardından pipeti hemen tüpten çıkarın.

Süspansiyonu, hedef altı kuyulu plakaların bir kuyucuğuna boşaltın. Ortamı komşu bir kuyudan karıştırın ve süspansiyonu her iki kuyucuğa eşit olarak dağıtın. Hücreli her mikrosantrifüj tüpü için transfeksiyonu tekrarlayın.

Beş PCR tüpüne 30 mikrolitre 0.5 milimolar EDTA ve PBS ekleyerek başlayın. Ardından, iki mikrolitreye ayarlanmış 10 mikrolitrelik bir pipete bir uç yükleyin. Pipet ucunu koloni kenarında belirli bir açıyla tutun ve tüm koloniyi dikkatlice ve yavaş yavaş yüzeyden kazıyın.

Tüm koloniyi hemen pipet ucuna aspire edin ve EDTA ile hazırlanmış PCR tüplerinden birine aktarın. İşlemi diğer dört koloni ile tekrarladıktan sonra, oda sıcaklığında dört ila altı dakika inkübe edin. Koloniyi daha küçük kümelere ayırmak için her bir hücre süspansiyonunu nazikçe yukarı ve aşağı pipetlemek için daha büyük bir pipet ucu kullanın.

Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmaktan kaçının. Daha sonra süspansiyonu doğrudan rekombinant vitronektin kaplı 24 oyuklu bir plakanın hedef kuyucuğuna yerleştirin. Kalan koloniler için işlemi tekrarladıktan sonra, üç ila altı gün kuluçkaya yatırın.

Dört ila altı gün sonra, koloniler büyüdüğünde ve kompakt hale geldiğinde, hücre tabakalarını 300 mikrolitre 0.5 milimolar EDTA ile yıkayın ve hemen aspire edin. Sonra 300 mikrolitre daha ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. EDTA'yı aspire ettikten sonra, bir mililitrelik bir pipeti kapasiteye ayarlayın, bir mililitre genişliğinde delikli uca monte edin ve vitronektin kaplı altı oyuklu bir plakanın hedef kuyucuğundan E8 ortamını aspire edin.

iPSC kültürünü yıkamak için kaynak plakasının bir kuyucuğuna bir ortam akışı fışkırtın. Daha sonra süspansiyonu hedef kuyucuğa aktarın ve kolonileri 20 ila 40 hücrelik kümeler halinde ayırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüm hücreleri kapladıktan sonra, plakayı hafifçe sallayarak ve sallayarak kümelerin eşit şekilde dağıldığından emin olun.

Ardından, topak yapışması ve koloni büyümesi için plakayı inkübatöre geri koyun. Yeniden programlama için kaynak hücreleri temsil eden amniyotik sıvı ve zar kök hücreleri, uzun ve faz parlaklığında tipik bir mezenkimal morfoloji sergiler. Hücreler, mezenkimal ila epitel geçişinden geçtikten sonra epitel özellikleri kazanır ve bu da parke taşı benzeri hücrelerle kolonilerin oluşumuna yol açar.

Bu koloniler çoğalır ve düzensiz hücresel MET hücre kütleleri oluşturur. Yeniden programlamanın sonraki aşamalarında, tamamen yeniden programlanmış hücrelerin kolonileri, iyi tanımlanmış sınırlara sahip ayrı ayrı ayırt edilebilir hücreler ortaya çıkar. Bu tamamen yeniden programlanmış hücreler, daha fazla sayıda olan MET kolonilerinin yanında bulunur.

Tamamen yeniden programlanmış izole edilmiş olgun bir klon burada gösterilmektedir. iPSC türevini ve olgunlaşmasını takiben, detay karakterizasyonuna tabi tutulabilir ve farklılaşmayı çeşitli hücre tiplerine yönlendirebilirler. Patojenlerin varlığı açısından test edilmemiş insan dokuları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlem yapılırken kişisel koruyucu ekipman, biyogüvenlik kabininde çalışma gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, fetal kök hücrelerde pluripotentliğin nasıl indükleneceğini, hangi reaktiflerin ve ekipmanların kullanılacağını ve pluripotent kök hücrelerin rutin olarak nasıl kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız.