Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Bu optimize edilmiş mRNA interaktom yakalamanın genel amacı, bitki hücrelerinden mRNA'ya bağlı bir proteomu izole etmek ve tanımlamaktır. Bu yöntem, çeşitli hücresel tahlillerde çok yönlü bir araç olarak kullanılan bir hücre tipi olan arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanır. Bu yöntem, bitki habercilerinin, RNA bağlayıcı proteinlerin rolünü keşfetmek ve anlamak gibi, transkripsiyon sonrası gen düzenleme implantları alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, bağlı bir proteom üzerindeki bir bitki habercisini doğrudan fizyolojik ortamdan izole edebilmesi ve tanımlayabilmesidir. Dolayısıyla bu yöntem, aribidopsis yaprak mezofil protoplastlarından haberci RNA'ya bağlı protein hakkında bilgi sağlayabilir. Diğer bitkinin protoplastları veya dokuları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, maya ve memeli hücre hatlarına başarıyla uygulandığını fark ettiğimizde aklımıza geldi. Metin protokolünde açıklandığı gibi iki farklı numune için arabidopsis yaprak mezofil protoplastlarını izole edin. UV çapraz bağlı olmayacak kontrol numunesini veya CL olmayan numuneyi buz üzerinde tutun.

Çapraz bağlanacak protoplast süspansiyonunu veya CL örneğini büyük bir petri kabına aktarın. Yüzeyi kaplamak için tabağa 30 mililitre buz gibi MMG çözeltisi ekleyin ve hücreleri nazikçe pipetleyerek yayın. UV çapraz bağlama aparatına taşınırken petri kabını alüminyum folyo ile örtün.

Açılmış petri kabını hemen bir UV çapraz bağlama aparatına yerleştirin. Çanak ile UV lambası arasındaki mesafenin sekiz santimetre olduğundan emin olun ve ardından numuneyi bir dakika boyunca ışınlayın. Bundan sonra, protoplast süspansiyonunu petri kabından iki yeni 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı tüpe hızlı bir şekilde çıkarın.

Protoplastların geri kalanını toplamak için tabağın altını beş mililitre buz gibi soğuk MMG solüsyonu ile yıkayın. Süspansiyonu iki tüp arasında bölün. Daha sonra, CL olmayan ve iki CL numune tüpünü beş dakika boyunca dört santigrat derecede 100 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı attıktan sonra, CL olmayan pelet içeren tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin. Her bir CL numune tüpüne 10 mililitre buz gibi soğuk MMG çözeltisi ekleyin ve peletleri yeniden askıya almak için tüpleri hafifçe sallayın. İki numuneyi 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpte birleştirdikten sonra, beş dakika boyunca dört santigrat derecede 100 kez g

Süpernatanı attıktan sonra, peleti buz üzerinde tutun. Ardından, her numunenin hücre peletine dokuz mililitre buz gibi soğuk lizis bağlayıcı tampon ekleyin. Çözelti homojen bir açık yeşil renk alana kadar yaklaşık yirmi kez yukarı ve aşağı pipetleyerek protoplastları parçalayın.

Homojenizasyon için, protoplast lizatını dar bir iğne ile 50 mililitrelik bir cam şırıngadan iki kez geçirin ve ardından lizatı on dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede üç haftaya kadar saklayın. Tüpü donmuş protoplast lizat ile oda sıcaklığında çözdürdükten sonra, tüpü buz üzerinde tutun.

1.8 mililitre oligo-d (T) manyetik boncukları, buz üzerine yerleştirilmiş altı yeni iki mililitrelik yuvarlak tabanlı mikro santrifüj tüpüne alı. Her tüpteki boncuk süspansiyonunu 600 mikrolitre lizis bağlayıcı tampon ile kısa bir süre yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın ve boncukları bir döndürücü üzerinde iki dakika boyunca hafifçe döndürün. Boncukları buzun üzerinde tutun.

Ardından, tam manyetik yakalama için yeterli zaman tanımak için boncukları içeren altı tüpün tümünü en az üç dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Boncuklar tamamen yakalandığında, süspansiyon netleşecektir. Ardından, süpernatanı altı tüpün hepsinden atın ve hemen içine dokuz mililitre protoplast lizatı alın.

Süspansiyon kahverengi ve homojen görünene kadar pipetleyerek boncukları lizat ile karıştırın. Tüpleri hafif bir rotasyonla bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpleri üç dakika boyunca manyetik rafa geri yerleştirin.

Tüm boncuklar tüplerin yan tarafında yakalandığında, protoplast lizatı içeren süpernatanı altı yeni iki mililitre yuvarlak tabanlı mikro santrifüj tüpüne toplayın. Ardından, boncuk içeren her tüpe bir tane olmak üzere 1,5 mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin ve boncukları pipetleyerek yeniden süspanse edin. Bir dakika boyunca hafifçe döndürdükten sonra, tüpleri üç dakika boyunca manyetik rafa geri yerleştirin.

Süpernatanı atın ve bu yıkama adımını bir kez tekrarlayın. 1,5 mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu iki kullanarak aynı yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. mRNP'ler protoplast lizattan verimli bir şekilde izole edilmişse, CL numunesindeki boncuk peletinin etrafında görünür bir hale olmalıdır.

Son olarak, yıkama işlemini 1,5 mililitre buz gibi düşük tuz tamponu ile bir kez tekrarlayın. Yıkadıktan sonra, her tüpe 500 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve pipetleme ile boncukları nazikçe yeniden süspanse edin. Poli-A kuyruklu RNA'ları serbest bırakmak için 50 santigrat derecede üç dakika inkübe edin.

Boncukları bir kez pipetleyerek nazikçe yeniden askıya alın ve tüpleri beş dakika boyunca dört santigrat derecede manyetik rafa geri yerleştirin. Altı tüpün hepsinden eluentleri buz üzerine yerleştirilmiş 15 mililitrelik konik tabanlı bir tüpe aktarın ve birleştirin. Bu, eluentin yaklaşık üç milimetresini verecektir.

RNA'nın kalitesi ve miktarı bir spektrofotometre kullanılarak hemen belirlenebilir. Oligo-d(T)boncukları bir mililitre buz gibi soğuk elüsyon tamponu ile iki kez yıkayarak yeniden kullanılmak üzere hazırlayın. Bundan sonra, tuz konsantrasyonunu 500 milimolar'a geri ayarlamak için bir mililitre buz gibi soğuk lizis bağlayıcı tampon ile yıkayın.

Bağlama, yıkama ve elüsyon prosedürlerini iki tur daha tekrarlamak için bu yıkanmış oligo-d (T) boncukları kullanın. Bu, poli-A kuyruklu RNA'ları protoplast lizattan tüketecek ve her numune için toplam dokuz milimetre eluent verecektir. Boncuklar saklanabilir ve başka bir deney için en fazla üç kez kullanılabilir.

RNA'nın kalitesini test etmek için, UV çapraz bağlı proteinleri metin protokolüne göre proteinaz K çözeltisi ile sindirin. Ardından, kalan kirleticileri gidermek için RNA saflaştırma kitini kullanarak RNA'yı saflaştırın. Saflaştırmadan sonra numuneler, qRT-PCR kullanılarak RNA kalite testi için hazırdır.

Her numunenin sekiz mililitresini RNAse A ve RNAse T1 içeren 100 ünite RNAse kokteyli ile muamele ederek başlayın. Kısa bir girdaplamadan sonra, numuneleri bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. mRNA bağlayıcı proteinleri veya mRBP'leri konsantre etmek için santrifüjlü filtre üniteleri kullanarak numuneleri filtreleyin. Her numune, iki mikrogram protein ile 75 mikrolitre verecektir.

Uzun süreli saklama için numuneleri eksi 80 santigrat derecede dondurun. Bir SDS sayfası jeli çalıştırmak için, her konsantre numunenin 25 mikrolitresini 15 mikrolitre 2X yükleme boyası ile karıştırın ve numuneleri 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Numuneleri, yüzde beş istifleme jeli ve yüzde on iki çözünen jel içeren bir SDS sayfası jeli üzerindeki bir protein işaretleyicisine yükleyin.

Ardından, jeli yıkama başına beş dakika boyunca ultra saf suyla iki kez yıkayın. Jeli lekelemek için ticari bir gümüş boyama kiti kullanın. Yeterli sayıda başlangıç protoplastı kullanılmışsa, protein bantları beş dakika içinde ortaya çıkacaktır.

mRBP'leri daha fazla test etmek için, peptitleri metin protokolünde açıklandığı gibi ikinci bir 1D sayfa jelinden saflaştırın. Bu saflaştırılmış peptitler artık nano ters fazlı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve kalitatif ve kantitatif proteomik ile analiz edilebilir. Oligo-d (T) boncuk yakalamadan sonra, qRT-PCR, 18S rRNA'ya kıyasla önemli ölçüde daha yüksek poli ubikitin 10 referans mRNA seviyeleri gösterdi.

Oligo-d(T) boncukları yalnızca poli-A kuyruklu RNA'ya bağlandığından, bu, mRNA'ların eluentte zenginleştirildiğini gösterir. mRBP'lerin oligo-d (T) boncuklar tarafından yakalanması, gümüş lekeli bir SDS sayfası jeli ile daha fazla değerlendirilir. Jel, UV çapraz bağlı CL numunesinde, çapraz bağlı olmayan CL olmayan numuneye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir protein miktarı gösterir.

UV ışınlamasının süresi, çapraz bağlamanın verimliliğini etkileyebilir. Bu gümüş lekeli SDS sayfalı jel, en güçlü bant yoğunlukları ile bir veya üç dakikalık UV ışınlamasının en uygun koşul olduğunu doğrular. Kantitatif proteomik analiz ile toplam 325 protein tanımlandı.

Bu proteinlerin 225'i, her protein için düşük miktarda bulunan peptitler ve peptit yoğunluklarının yüksek değişkenliği nedeniyle anlamlılık seviyesinin altındaydı. Bununla birlikte, hepsi sadece CL örneklerinde kalitatif olarak tespit edildiğinden, hepsi pozitif sonuçlar olarak kabul edildi. Bu 325 protein ayrıca Ribozomal proteinler, ana RBP'ler ve aday RBP'ler olmak üzere üç kategoriye ayrıldı.

Aday RBP'lerin konvansiyonel RNA bağlanma alanlarından yoksundur ve rollerinin çoğu doğrulanmamıştır, bu da RNA regülasyonunda olası yeni işlevleri düşündürmektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, bitkilerdeki moleküler düzenleme yolları alanındaki araştırmacıların, dikotlar ve monokot hücrelerinde ve dokularında genom çapında haberci RNA'ya bağlı proteomu keşfetmelerinin yolunu açtı.