Name: Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Keşfedin, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarından mRNA bağlayıcı proteinleri izole etmek için optimize edilmiş UV çapraz bağlama yöntemini. Bu teknik, bitkilerde transkripsiyon sonrası gen düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Geleneksel UV lamba ile donatılmış UV çapraz bağlama cihazını sağlayan Prof. Joris Winderickx&#39;in laboratuvarını kabul ediyoruz. KG, KU Leuven araştırma fonu tarafından desteklenmekte ve FWO hibe G065713N&#39;den destek aldığını onaylamaktadır.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mayalar ve insan hücreleri için geliştirilmiş mRNA etkileşim yakalamasını yaprak mezofil protoplastlarına başarılı bir şekilde uyguladık. Yaprak yapraklarındaki başlıca zımpara türü mezofil hücreleridir. Bu yöntemin en büyük avantajı, fizyolojik bir ortamdan proteinleri keşfetmek için in vivo çapraz bağlamayı kullanmasıdır. Bu protokolde, esas olarak birtakım optimize edilmiş deneysel koşulları ( örn., Başlangıç ​​materyali olarak kullanılacak protoplastların sayısı ve UV ı...

Ökaryotlar, hücresel biyolojik süreçleri korumak için çoklu RNA biyogenez düzenleyici yollarını kullanır. Bilinen RNA türleri arasında mRNA çok çeşitlidir ve proteinlerin ve izoformlarının kodlama kapasitesini taşır 1. PTGR yolu, pre-mRNA&#39;ların 2 , 3&#39;ün kaderini yönlendirir. Farklı gen ailelerinden RBP&#39;ler RNA regülasyonunu kontrol eder ve PTGR&#39;da spesifik mRBPler mRNA&#39;ları doğrudan fiziksel etkileşimler yoluyla yönlendirerek fonksiyonel mRNA&#39;ları oluştururlar. Bu nedenle, tanımlanması ve mRBPs karakterize ve mRNPs son üç yıl .Over hücresel mRNA metabolizması 2 düzenleme anlamak için kritiktir, çeşitli in vitro yöntemler - RNA elektroforetik mobilite kayma (Remsa) analizleri, üstel zenginleştirme deneyleri ile ligandların sistematik evrimi dahil olmak üzere (SELEX), kütüphane türevli yapılara, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radyoaktif işaretlenmiş veya nicelikselFloresan RNA bağlama deneyleri, X-ışını kristalografisi ve NMR spektroskopisi 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - esas olarak memeli hücrelerinden RBP çalışmalarına uygulanmıştır. Bu memeli RBP çalışmalarının sonuçları, yayınlanmış gözlemleri toplayan RNA-bağlayıcı Protein Veri Tabanı (RBPDB) vasıtasıyla aranabilir ( 10) . Bu in vitro yaklaşımlar güçlü araçlar olmasına rağmen, belirli bir RNA dizisi havuzundan bağlı RNA motiflerini belirler ve bu nedenle yeni hedef RNA&#39;ları keşfetme yetenekleri sınırlıdır. Aynı şey, protein dizisinin ve yapısının 15 korunmasına dayanan genom çapında RBP&#39;leri öngörmek için hesaplama stratejileri için de geçerlidir. Bunun üstesinden gelmek için, yeni bir deneysel yöntem haBir RBP&#39;nin etkileşime girdiği RNA motiflerinin tanımlanmasına ve bağlanmanın tam yerinin belirlenmesine izin veren bir dizi kurulmuştur. &quot;Çapraz bağlama ve immüno çökeltme&quot; (CLIP) adı verilen bu yöntem, in vivo UV çapraz bağlanma ve ardından immüno çökeltme 11&#39;den oluşur . Erken yapılan çalışmalar, DNA ve RNA nükleotidlerinin fotoaktifleşmesinin, 245 nm&#39;den daha yüksek uyaran UV dalga boylarında oluşabileceğini göstermiştir. 12: timidin ile reaksiyonu (dT ≥ dC&gt; rU&gt; Re, dA, dG azalma photoreactivity sırasına göre sıralama) tercih görünüyor. 254 nm dalga boyunda (UV-C) UV ışığı kullanarak RNA nükleotidleri ve protein kalıntıları arasındaki kovalent bağların sadece birkaç Angstrom (Å) aralığında oluştuğu gözlemlendi. Dolayısıyla fenomen, RNA ve RBP&#39;nin &quot;sıfır uzunluklu&quot; çapraz bağlanması olarak adlandırılır. Bunu takiben katı bir arındırma işlemi izlenebilir<html> Az arka planla dür 13 , 14 . CLIP&#39;i tamamlayan bir strateji, RBP&#39;lerin manzarasını tanımlamak için protein tanımlaması ile in vivo UV çapraz bağlamayı birleştirmektir. &quot;MRNA etkileşimli yakalama&quot; adı verilen bu yeni deneysel yaklaşımı kullanarak maya hücrelerinden, embriyonik kök hücrelerden (ESC&#39;ler) ve insan hücre çizgilerinden ( örn., HEK293 ve HeLa) izole edilmiş bu tür genom çapında mRNA&#39;ya bağlı proteomlar 18 , 19 , 20 , 21 . Yöntem in vivo UV çapraz bağlanma, ardından mRNP saflaştırması ve MS tabanlı proteomiklerden oluşur. Bu stratejiyi uygulayarak, kanonik olmayan RBD&#39;ler içeren birçok yeni &quot;ay ışığı alan&quot; RBP keşfedildi ve daha fazla proteininin önceden tahmin edildiğinden daha fazla RNA bağlama kapasitesine sahip olduğu netleşti.&quot;&gt; 15 , 16 , 17. Bu yöntemin kullanılması yeni başvurulara ve RBP&#39;leri araştırırken yeni biyolojik soruları cevaplama yeteneğine izin verir Örneğin son zamanlarda yapılan bir araştırma mRNA&#39;ya bağlı proteomun (ana RBP) korunmasını araştırmıştır Proteom) maya ve insan hücreleri arasında 22 . Bitki RBP&#39;leri, büyümede ve gelişmede ( örneğin , çiçeklenme zamanının transkripsiyon sonrası düzenlenmesinde, sirkadyere ait saatte ve mitokondriyum ve kloroplastlarda gen ifadesi gibi) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Dahası, abiyotik streslere ( örn. Soğuk, kuraklık, sönümlenme) yanıt veren hücresel süreçlerde işlevleri yerine getirdiği düşünülmektedirLinity ve absisik asit (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34&#39;tür . Arabidopsis thaliana genomunda RNA tanıma motifi (RRM) ve K homoloji (KH) alan dizisi motiflerine dayanan 200&#39;den fazla tahmini RBP geni vardır; Pirinçte yaklaşık 250, 35 , 36 olarak kaydedildi. Birçok tahmin RBPS birçok yeni fonksiyonlara hizmet verdiği düşündüren 35 (RRM alanını içeren tahmin Arabidopsis RBPS yaklaşık% 50&#39;ye örneğin hiçbir metazoan ortologlarıyla) bitkilere özgü olduğu söylenemez dikkat çekicidir. Tahmini RBP&#39;lerin çoğu işlevleri tanımlanmamış halde kalır 23 . Arabidopsis etiylü fidelerden, yaprak dokusundan, kültür kök hücrelerinden ve yaprak mezofil protoplastlarından mRNA&#39;ya bağlı proteomların izolasyonu,mRNA interaktom yakalama geçenlerde, 39 38 bildirilmiştir. Bu çalışmalar, yakın gelecekte bitkilerde fonksiyonel RBP&#39;lerin sistematik olarak kataloglanmasının güçlü potansiyelini ortaya koymaktadır. Burada, bitki protoplastlarından ( yani, hücre duvarları olmayan hücrelerden) mRNA interaksiyonu yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastları, en önemli yaprak hücresi türüdür. İzole edilmiş protoplastlar, UV ışığının hücrelere en iyi şekilde erişilmesine izin verir. Bu hücre tipi, fonksiyonel karakterizasyon için proteinleri geçici olarak ifade eden tahlillerde kullanılabilir 40 , 41 . Ayrıca protoplast, birkaç diğer bitki hücre türüne ve tür 42 , 43 , 44&#39;e uygulanmıştır ( örneğin, Petersson ve diğerleri , 2009; Bargmann ve Birnbaum, 2010; ve Hong ve ark ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; Yöntem toplam 11 basamağı kapsamaktadır ( Şekil 1A ). Arabidopsis yaprak mezofil protoplastları önce izole edilir (aşama 1) ve sonra çapraz bağlanmış mRNP&#39;leri oluşturmak için UV ışınlarına maruz bırakılır (aşama 2). Protoplastlar denatüre edici şartlar altında parçalandığında (basamak 3), çapraz bağlanmış mRNPler liziz / bağlama tamponunda serbest bırakılır ve oligo-d (T) 25 boncuklar tarafından çekilir (adım 4). Sıkı yıkamalar birkaç tur sonra, mRNPs saflaştırılmış ve daha da analiz edilir. MRBP&#39;lerin denatüre peptitleri, çapraz bağlı mRNA&#39;lar saflaştırılmadan ve RNA kalitesi qRT-PCR ile doğrulanmadan önce proteinaz K ile sindirilir (adımlar 5 ve 6). RNaz işlemi ve protein konsantrasyonundan (7. adım) sonra, protein kalitesi SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve gümüş boyama (adım 8) ile kontrol edilir. Protein band örüntülerindeki fark, çapraz bağlı bir numune (CL) ile çapraz bağlanmamış bir numune (CL olmayan;UV ışınlamasına tabi tutulmayan protoplastlardan gelen negatif kontrol örneği). Proteinlerin tanımlanması, MS tabanlı proteomikler aracılığıyla gerçekleştirilir. CL örneğinden gelen proteinler olası arka plan kontaminasyonunu gidermek için tek boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi (1D-PAGE) ile ayrılır, tripsin kullanılarak kısa peptidlere &quot;in-jel ile sindirilir&quot; ve saflaştırılır (adım 9). Nano ters faz sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisine (nano-LC-MS) bağlı olarak, mRNA&#39;ya bağlı proteomdaki kesin protein miktarının belirlenmesine olanak tanır (basamak 10). Son olarak tanımlanan mRNA&#39;lar, biyoenformatik analiz (adım 11) kullanılarak karakterize edilir ve kataloglanır.

<table><tbody><tr><td><güçlü >REAKTİFLER< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.8 M Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M1902-500G</td><td>Birincil izotonik Enzim çözeltisi & MMg çözeltisi</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>MERCK</td><td>Art. 4935</td><td>Birincil izotonik Enzim çözeltisi & W5 tamponu</td></tr><tr><td>0.2 M MES (pH 5.7) (4-morfolineetansülfonik asit)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2933</td><td>Birincil izotonik Enzim çözeltisi, W5 tamponu & MMg solüsyonu, Filtrasyon sterilizasyonu</td></tr><tr><td>Selülaz R10</td><td>Yakult İlaç Sanayi A.Ş.</td><td>SELÜLAZ " ONOZUKA" R-10, 10 g</td><td>Nihai izotonik enzim çözeltisi</td></tr><tr><td>Makrozyme R10</td><td>Yakult İlaç Sanayi A.Ş.</td><td>MACEROZİM R-10, 10g</td><td>Nihai izotonik enzim çözeltisi</td></tr><tr><td>% 10 ( a / h) BSA (Sığır Serum Albümini)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>Son izotonik enzim çözeltisi & Filtrasyon sterilizasyonu</td></tr><tr><td>1 M CaCl2</td><td>Chem-Lab NV</td><td>CL00.0317.1000</td><td>Nihai izotonik enzim çözeltisi, W5 tamponu ve Sindirim tamponu</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td>W5 tamponu</td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td>MMg çözeltisi</td></tr><tr><td>1 M LiCl (Lityum Klorür)</td><td>Acros</td><td>199885000</td><td>Lizis/bağlama tamponu, Yıkama tamponu 1, Yıkama tamponu 2 & Düşük tuz tamponu</td></tr><tr><td>%5 (a/v) LiDS (Lityum Dodesil Sülfat)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4632-25G</td><td>Lizis/bağlama tamponu, Yıkama tamponu 1 & Filtrasyon sterilizasyonu</td></tr><tr><td>1 M DTT (Dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific Yıkama tamponu 1 & Yıkama tamponu 2</td><td>307866</td><td>Lizis/bağlama tamponu,</td></tr> <tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hidroksimetil)aminometan, Hidroklorik asit SG (HCl))</td><td>Acros & Fisher Kimya</td><td>167620010 & H / 1200 / PB15</td><td>Lizis / bağlama tamponu, Yıkama tamponu 1, Yıkama tamponu 2, Düşük tuz tamponu & Elüsyon tamponu</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Etilendiamintetraasetik asit)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>ED-500G</td><td>Lizis / bağlama tamponu, Yıkama tamponu 1. Yıkama tamponu 2. Düşük tuz tamponu & Elüsyon tamponu</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>8.22184.0500</td><td>Oligo-d(T)<alt>25</alt> boncuklarının rejenerasyonu</td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>VWR PROLABO CHEMICALS</td><td>28244.295</td><td>Oligo-d(T)25 boncukların rejenerasyonu</td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.4) (Fosfat Tamponlu Salin) içeren (NaCl; Kartal; Na2HPO4; KH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt>)</td><td>Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich & SAFC</td><td>S/3160/60, Madde 4935, 71640-250G & 60230</td><td>Oligo-d(T)25 boncuklarının rejenerasyonu</td></tr><tr><td>Proteinaz K çözeltisi (2 & mu; g/&mu; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>Protein sindirimi</td></tr><tr><td>Yükleme boyası</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>qPCR ana karışımı</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>qRT-PCR testi</td></tr><tr><td>RNase Kokteyli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>RNA sindirimi</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>322415</td><td>Jel fiksasyonu ve jel lekesi</td></tr> <tr>giderme<td>Asetik asit</td><td>Sigma-aldrich</td><td>537020</td><td>Jel fiksasyonu ve jel lekesi</td></tr><tr><td>giderme Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20278</td><td>Jel boyama</td></tr><tr><td>1 M NH4HCO3 (Amonyum bikarbonat) &nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>09830-500G</td><td>Jel nemlendirme & Sindirim tamponu</td></tr><tr><td>CH < alt > 3 CN (Asetonitril)</td> <td>Sigma-aldrich</td><td>34851-100ML</td><td>Jel dehidrasyon ve Peptit çözme çözeltisi</td></tr><tr><td>IAA (İyodoasetik asit)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>Alkilleyici ajan</td></tr><tr><td>TFA (Trifloroasetik asit)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>302031-10X1ML</td><td>Peptit çözme çözeltisi</td></tr><tr><td>FA (Formik asit)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>06554-5G</td><td>Peptit ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Tripsin çözeltisi (6 ng/&mu; L)</td> <td>Promega</td><td>V5280</td><td>Sindirim tamponu</td></tr><tr><td><güçlü>İsim</güçlü></td><td>güçlü><Şirket<güçlü></td><td>güçlü<güçlü>Katalog Numarası<güçlü></td>güçlü<td><güçlü>Yorumlar</güçlü></td></tr><tr><td><güçlü>EKİPMANLAR</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toprak</td><td>Peltracom</td><td>LP2D</td><td>Bitki büyümesi</td></tr><tr><td>Vermikülit 3</td><td>Sibli AS</td><td>05VERMICULIET</td><td>Bitki büyümesi</td></tr><tr><td>Petri kabı (150 x 20 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>Protoplast süspansiyonu için taşıyıcı</td></tr><tr><td>0.22 & mu; m filtre</td><td>Kırlangıç</td><td>SE2M229104</td><td>Son izotonik enzim çözeltisinin homojenizasyonu</td></tr><tr><td>Razorblade</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Rozet yaprağı şeritleri</td></tr><tr><td>35-75 & mu; m naylon örgü</td><td>SEFAR NITEX</td><td>74010</td><td>Protoplast süspansiyon filtrasyonu</td></tr><tr><td>50 mL yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>Protoplast süspansiyon</td>için <td>Sigma-aldrich</td><td>T1918-10EA</td> Taşıyıcı</tr><tr><td>Hemositometre (B&uuml; rker hemositometre)</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td>Protoplast hücre sayma</td></tr><tr><td>UV çapraz bağlama aparatı (HL-2000 HybriLinker)</td><td>UVP, LLC</td><td>UVP95003101</td><td>in vivo UV çapraz bağlama</td></tr><tr><td>UV lambası (Sankyo-Denki G8T5)</td><td>SANKYO DENKI</td><td>SD G8T5</td><td>in vivo UV çapraz bağlama</td></tr><tr><td>50 mL cam şırınga</td><td>FORTUNA Optima</td><td>Z314560</td><td>Protoplast lizat Dar iğnenin homojenizasyonu</td></tr><tr><td>(0,9 x 25 mm)</td><td>Becton Dickinson mikrolans 3</td><td>2021-04</td><td>Protoplast lizat</td></tr><tr><td>Döndürücü Model L26'nın</td> homojenizasyonu <td>Labinco BV</td><td>26110912</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-d(T)<alt>25</alt> manyetik boncuklar (5 mg/mL)</td><td>New England BioLabs</td><td>S1419S</td><td>mRNP'ler ve mRNA'ların bağlanması ve aşağı açılır</td></tr><tr><td>Manyetik raf</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td>mRNP'ler ve mRNA'lar bağlama ve aşağı çekme</td></tr><tr><td>Santrifüj filtre üniteleri (Amicon Ultra-4 santrifüj filtre üniteleri)</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>mRBP konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Pierce Gümüş Leke Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24612</td><td>Gümüş boyama testi</td></tr><tr><td>RNA saflaştırma kiti (InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td><td>STRATEC Moleküler</td><td>1064100300</td><td>RNA saflaştırma</td></tr><tr><td>Spektrofotometre cihazı (NanoDrop 1000 Spektrofotometre)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>RNA kalitesi ve miktarı</td></tr><tr><td>Gerçek Zamanlı PCR döngüleyici (StepOne Gerçek Zamanlı PCR döngüleyici)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td>cDNA miktar tayini</td></tr> <tr><td>ve mikro;-C18 sütunları (Millipore Zip Ucu ve mikro;-C18 sütunları)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>720046-960EA</td><td>Peptit saflaştırma</td></tr><tr><td>Kütle spektrometresi (Q Exactive Hibrit Dört Kutuplu-Orbitrap Kütle Spektrometresi)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Kütle spektrometresi tabanlı proteomik</td></tr><tr><td>Sıvı kromatografi cihazı (Ultimate 3000 ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (UHPLC) cihazı)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td>Kütle spektrometresi tabanlı proteomik</td></tr><tr><td>C18 kolonu (Easy Spray Pepmap RSLC C18 kolonu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES800</td><td>Kütle spektrometresi tabanlı proteomik</td></tr><tr><td>C18 prekolonu (Acclaim Pepmap 100 C18 prekolon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td>Kütle spektrometresi tabanlı proteomik</td></tr><tr><td>Name</td><td> Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>qRT-PCR testi için primerler</td><td>Sequences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UBQ10 mRNA (Li et al., 2014</td><td>)Fw: AACTTTGGTGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA (Durut et al., 2014)</td><td>Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bitki protoplastlarından mrna İnteraktom yakalama

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA bağlayıcı proteinler (RBPler) RNA&#39;ların kaderini belirler. Bütün RNA biyogenez yollarına katılırlar ve özellikle haberci RNA&#39;ların (mRNA&#39;lar) post-transkripsiyonel gen regülasyonuna (PTGR) katkıda bulunurlar. Son birkaç yılda, maya ve memeli hücresi soylarından elde edilen bir dizi mRNA&#39;ya bağlı proteom, &quot;mRNA etkileşimli yakalama&quot; adı verilen ve mRNA&#39;ya bağlanan proteinlerin (mRBP&#39;lerin) tanımlanmasına izin veren yeni bir yöntem kullanılarak başarıyla izole edilmiştir. Doğrudan bir fizyolojik ortamdan. Yöntem in vivo ultraviyole (UV) çapraz bağlama, oligon (dT) boncuklar ile haberci ribonükleoprotein komplekslerinin (mRNPs) aşağı çekilmesi ve saflaştırılması ve ardından kütle spektrometresi (MS) ile çapraz bağlanmış proteinlerin tanımlanmasından oluşur. Çok yakın bir tarihte, aynı yöntemi uygulayarak, çeşitli Arabidopsis doku kaynaklarına eşzamanlı olarak birkaç bitki mRNA&#39;ya bağlı proteom rapor edilmiştir: etiyole edilmiş fideler, yaprak dokusu,Yaprak mezofil protoplastları ve kültür kökü hücreleri. Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastları için optimize edilmiş mRNA etkileşimli yakalama yöntemini sunuyoruz. Bu hücre türü, çeşitli hücresel tahliller içeren deneyler için çok yönlü bir araç olarak hizmet etmektedir. Optimum protein verimi için koşullar, başlangıç ​​dokusu miktarını ve UV ışınlama süresini içerir. Orta ölçekli bir deneyden (10 7 hücre) elde edilen mRNA&#39;ya bağlı proteomda, RNA bağlama kapasitesine sahip olduğu kaydedilen RBP&#39;lerin aşırı temsil edildiği bulundu ve birçok yeni RBP tespit edildi. Deney ölçeklenebilir (10 9 hücre) ve optimize yöntem, bitkilerdeki mRNA bağlı proteomları geniş ölçüde izole etmek, kataloglamak ve karşılaştırmak için diğer bitki hücre tiplerine ve türüne uygulanabilir.

CL örneğinde boncuk taneciklerini çevreleyen, yıkama basamağı 4.3&#39;de yıkama tamponu 2 ile ( Şekil 1B ) karakteristik bir halo gözlemledik. Araştırılmamış olmasına rağmen, bu fenomen manyetik yakalama esnasında boncuk agregasyonu ile çapraz bağlanmış mRNP komplekslerinin etkileşimi ile muhtemelen açıklanabilir ve daha yaygın bir agreganın oluşmasına neden olur. Oligo-d (T) 25 boncuk yakalama etkisinin 14 olduğunu gösterir</sup...

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA&#39;ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Bu optimize edilmiş mRNA interaktom yakalamanın genel amacı, bitki hücrelerinden mRNA'ya bağlı bir proteomu izole etmek ve tanımlamaktır. Bu yöntem, çeşitli hücresel analizlerde çok yönlü bir araç olarak kullanılan bir hücre tipi olan arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanmaktadır. Bu yöntem, bitki haberci RNA bağlayıcı proteinlerin rolünün keşfedilmesi ve anlaşılması gibi transkripsiyon sonrası gen düzenlemesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, bağlı bir proteom üzerindeki bir bitki elçisini doğrudan fizyolojik ortamdan izole edebilmesi ve tanımlayabilmesidir. Bu nedenle, bu yöntem Arabidopsis yaprak mezofil protoplastlarından mRNA'ya bağlı protein hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, diğer bitki protoplastları veya dokuları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Bu yöntem için ilk fikri, maya ve memeli hücre hatlarına başarıyla uygulandığını fark ettiğimizde edindik. Metin protokolünde açıklandığı gibi, iki farklı örnek için arabidopsis yaprak mezofil protoplastlarını izole edin. UV çapraz bağlanma uygulanmayacak kontrol örneğini veya non-CL örneğini buz üzerinde tutun.Çapraz bağlanacak protoplast süspansiyonunu veya CL-örneğini geniş bir petri kabına aktarın. Yüzeyi kaplamak için kaba 30 milliliters buz gibi soğuk MMG çözeltisi ekleyin ve hücreleri hafifçe pipetleyerek yayın. Petri kabı UV çapraz bağlama cihazına taşınırken üzerini alüminyum folyo ile kapatın.Açılmış petri kabını derhal bir UV çapraz bağlama cihazına yerleştirin. Kap ile UV lamba arasındaki mesafenin sekiz santimetre olduğundan emin olun ve ardından örneği bir dakika boyunca ışınlayın. Bundan sonra, protoplast süspansiyonunu petri kabından hızlıca iki yeni 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı tüpe paylaştırın.Protoplastların geri kalanını toplamak için kabın altını beş mililitre daha buz gibi soğuk MMG çözeltisi ile yıkayın. Süspansiyonu iki tüp arasında paylaştırın. Ardından, non-CL ve iki CL örnek tüplerini 4 °C'de 5 dakika boyunca 100 ×g'de santrifüjleyin.Süpernatant atıldıktan sonra, non-CL peleti içeren tüpü tekrar buza yerleştirin. Her CL örnek tüpüne 10 milliliters buz gibi soğuk MMG çözeltisi ekleyin ve peletleri yeniden süspand etmek için tüpleri hafifçe sallayın. İki örneği bir adet 50 milliliters yuvarlak tabanlı tüpte birleştirdikten sonra, dört degrees celsius sıcaklıkta beş dakika boyunca 100 times g hızında santrifüjleyin.Süpernatan atıldıktan sonra, peleti buz üzerinde bekletin. Ardından, her örneğin hücre peletine dokuz mililitre buz gibi soğuk lizis bağlama tamponu ekleyin. Çözelti homojen, açık yeşil bir renk alana kadar yaklaşık yirmi kez pipetle çekip bırakarak protoplastları lize edin.Homojenizasyon için, protoplast lizatını dar uçlu bir iğneye sahip 50 milliliter cam şırıngadan iki kez geçirin ve ardından lizatı on dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Örnekleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve üç haftaya kadar minus 80 degrees celsius sıcaklıkta saklayın. Donmuş protoplast lizatı içeren tüpü oda sıcaklığında çözdürdükten sonra, tüpü buz üzerinde tutun.Buz üzerinde bekletilen altı adet yeni iki mililitrelik yuvarlak tabanlı mikro santrifüj tüpüne 1.8 mililitre oligo-d(T) manyetik boncuk alikotlayın. Her tüpteki boncuk süspansiyonunu, pipetle kısa süreli olarak çekip bırakarak 600 mikrolitre lizis bağlama tamponu ile yıkayın ve boncukları bir rotatörde iki dakika boyunca nazikçe döndürün. Boncukları buz üzerinde tutun.Ardından, boncukları içeren altı tüpün tamamını, tam manyetik yakalama için yeterli süre tanımak amacıyla en az üç dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Boncuklar tamamen yakalandığında, süspansiyon berraklaşacaktır. Daha sonra, altı tüpün tamamındaki süpernatantı atın ve hemen her birine dokuz mililitre protoplast lizatı paylaştırın.Süspansiyon kahverengi ve homojen görünene kadar pipetleme yaparak boncukları lizatla karıştırın. Tüpleri dört derece santigrat sıcaklıkta, hafif rotasyonla bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından tüpleri üç dakika boyunca tekrar manyetik rafa yerleştirin.Tüm boncuklar tüplerin kenarına tutunduğunda, protoplast lizatını içeren süpernatantı altı yeni iki mililitrelik yuvarlak tabanlı mikro santrifüj tüpüne toplayın. Ardından, boncuk içeren her tüpe 1,5 mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu bir ekleyin ve boncukları pipetleme yoluyla yeniden süspande edin. Bir dakika boyunca hafifçe döndürdükten sonra, tüpleri üç dakika boyunca tekrar manyetik rafa yerleştirin.Süpernatanı atın ve bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. 1,5 milliliters buz gibi soğuk yıkama tamponu iki kullanarak aynı yıkama prosedürünü iki kez tekrarlayın. Eğer mRNP'ler protoplast lizatından verimli bir şekilde izole edilmişse, CL örneğindeki boncuk peletinin etrafında görünür bir halo oluşmalıdır.Son olarak, yıkama işlemini 1.5 milliliters buz gibi soğuk düşük tuzlu tampon ile bir kez tekrarlayın. Yıkama işleminden sonra, her tüpe 500 microliters elüsyon tamponu ekleyin ve boncukları pipetleme yoluyla nazikçe yeniden süspanse edin. Poli-A kuyruklu RNA'ların salınması için 50 degrees celsius sıcaklıkta üç dakika inkübe edin.Boncukları bir kez pipetleyerek nazikçe yeniden süspande edin ve tüpleri dört derece santigrat sıcaklıkta beş dakika boyunca manyetik rafa geri yerleştirin. Altı tüpün tamamındaki elüatları, buz üzerinde bulunan 15 mililitrelik konik tabanlı bir tüpe aktarıp birleştirin. Bu işlem yaklaşık üç milimetre elüat sağlayacaktır.RNA'nın kalitesi ve miktarı bir spektrofotometre kullanılarak anında belirlenebilir. Yeniden kullanılacak oligo-d(T) boncuklarını, bir mililitre buz gibi soğuk elüsyon tamponu ile iki kez yıkayarak hazırlayın. Ardından, tuz konsantrasyonunu tekrar 500 millimolar seviyesine ayarlamak için boncukları bir mililitre buz gibi soğuk lizis bağlanma tamponu ile yıkayın.Bağlanma, yıkama ve elüsyon prosedürlerini ek iki tur daha tekrarlamak için bu yıkanmış oligo-d(T) boncuklarını kullanın. Bu işlem, protoplast lizatındaki poli-A kuyruklu RNA'ları tüketecek ve her örnek için toplam dokuz mililitre elüat sağlayacaktır. Boncuklar saklanabilir ve başka bir deney için en fazla üç kez daha kullanılabilir.RNA kalitesini test etmek için, UV-çapraz bağlanmış proteinleri metin protokolüne uygun olarak proteinaz K çözeltisi ile sindirin. Ardından, kalıntı kontaminantları uzaklaştırmak için RNA saflaştırma kiti kullanarak RNA'yı saflaştırın. Saflaştırma işleminden sonra örnekler, qRT-PCR kullanılarak yapılacak RNA kalite testi için hazır hale gelir.Her bir örneğin sekiz mililitresini, RNAse A ve RNAse T1 içeren 100 ünite RNAse kokteyli ile muamele ederek başlayın. Kısa bir vorteksleme işleminin ardından, örnekleri 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. mRNA bağlayan proteinleri (mRBP'ler) konsantre etmek için örnekleri santrifüj filtre üniteleri kullanarak filtreleyin. Her bir örnekten, iki mikrogram protein içeren 75 µL ürün elde edilecektir.Uzun süreli saklama için örnekleri -80 °C'de dondurun. SDS-PAGE jeli çalıştırmak için, her bir konsantre örnekten 25 µL'yi 15 µL 2X yükleme boyası ile karıştırın ve örnekleri 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtın. Örnekleri ve bir protein marker'ı, %5 yığma jeli ve %12 ayırma jeli bulunan bir SDS-PAGE jeline yükleyin.Ardından, jeli her yıkama için beş dakika süreyle ultrapure su ile iki kez yıkayın. Jeli boyamak için ticari bir gümüş boyama kiti kullanın. Yeterli sayıda başlangıç protoplastı kullanılmışsa, protein bantları beş dakika içinde görünecektir.mRBP'leri daha fazla test etmek için, metin protokolünde açıklandığı şekilde ikinci bir 1D sayfa jelinden peptitleri saflaştırın. Bu saflaştırılmış peptitler artık nano ters faz sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi ile kalitatif ve kantitatif proteomik yöntemlerle analiz edilebilir. Oligo-d(T) boncuk yakalamasından sonra, qRT-PCR, 18S rRNA'ya kıyasla poliyübitikin 10 referans mRNA seviyelerinin anlamlı derecede daha yüksek olduğunu göstermiştir.Oligo-d(T) boncukları yalnızca poli-A kuyruklu RNA'lara bağlandığından, bu durum elüatın mRNA'lar bakımından zenginleştiğini göstermektedir. Oligo-d(T) boncukları ile mRBP'lerin yakalanması, gümüş boyamalı bir SDS-PAGE jeli ile daha ayrıntılı olarak değerlendirilir. Jel, UV ile çapraz bağlanmış CL örneğinde, çapraz bağlanmamış non-CL örneğine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek protein miktarı olduğunu göstermektedir.UV ışınlama süresi, çapraz bağlama verimliliğini etkileyebilir. Gümüş boyamalı SDS-PAGE jeli, en güçlü bant yoğunluklarının gözlendiği bir veya üç dakikalık UV ışınlamanın optimal koşul olduğunu doğrulamaktadır. Kantitatif proteomik analiz ile toplam 325 protein tanımlanmıştır.Bu proteinlerden 225'i, her bir protein için mevcut olan düşük bolluktaki peptitler ve peptit yoğunluklarındaki yüksek değişkenlik nedeniyle anlamlılık düzeyinin altında kalmıştır. Bununla birlikte, tamamı nitel olarak yalnızca CL örneklerinde tespit edildiği için hepsi pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir. Bu 325 protein daha sonra Ribozomal proteinler, ana RBP'ler ve aday RBP'ler olmak üzere üç kategoriye ayrılmıştır.Aday RBP'ler geleneksel RNA bağlanma bölgelerinden yoksundur ve rollerinin çoğu henüz doğrulanmamıştır; bu durum, RNA düzenlemesinde olası yeni işlevlere işaret etmektedir. Uzmanlaşıldıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulandığında bir hafta içinde tamamlanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, bitkilerdeki moleküler düzenleme yolakları alanındaki araştırmacıların, dikotil ve monokotil hücre ve dokulardaki genom genelindeki haberci RNA'ya bağlı proteomu keşfetmelerinin önünü açmıştır.

mrna-interactome-capture-from-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Burada bitki protein komplekslerinin saflaştırılması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklar. Biz bir kompleks içinde bir tek proteini imüno tarafından, bu yüzden onun translasyon sonrası modifikasyonlar ve etkileşim ortakları belirlemek olduğunu göstermektedir.

Plant protein kompleksleri, çevirim sonrası değişikliklerin belirlenmesi

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

Keşfedin, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarından mRNA bağlayıcı proteinleri izole etmek için optimize edilmiş UV çapraz bağlama yöntemini. Bu teknik, bitkilerde transkripsiyon sonrası gen düzenlemesini anlamaya yardımcı olur.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Daha fazla video keşfet