Complement Reseptör 1 Boyunca Polimorfizm Genotiplendirme için Yüksek Çözünürlükte Melting PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç

Bu yöntemin genel amacı, CR1 izoformlarının hastalık patogenezindeki rolünü daha iyi anlamak için Alzheimer hastalığı gibi hastalıklara duyarlılığın değerlendirilmesinde kullanılmak üzere kompleman reseptörü 1 uzunluk polimorfizmlerini genotiplemektir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığının patogenezi gibi sinirbilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, taze kan örnekleri gerektirmemesi ve daha kolay, daha ucuz, daha hızlı olması ve bu nedenle daha büyük popülasyonlara uygulanabilir olmasıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, taze kan örnekleri için gerekli zaman ve ihtiyaç ile ilgili olarak Western blotlarını gerçekleştirmenin zorluklarını fark ettiğimizde aklımıza geldi. 1,5 mililitrelik bir tüpün dibine 20 mikrolitre proteinaz K pipetleyin. Ardından, tüpe 200 mikrolitre numune ekleyin.

Numuneye 200 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. 15 saniye boyunca nabız girdabı ile karıştırın. Karıştırdıktan sonra, bir su banyosunda 10 dakika boyunca 56 santigrat derecede inkübe edin.

Kapağın içindeki damlaları çıkarmak için 1,5 mililitrelik tüpü kısaca santrifüjleyin. Ardından, numuneye 100 mikrolitre etanol ekleyin. Tüpü daha önce olduğu gibi kısa bir süre santrifüjlemeden önce 15 saniye boyunca nabız girdabı ile tekrar karıştırın.

Daha sonra, karışımı iki mililitrelik bir toplama tüpündeki membran kolonuna dikkatlice uygulayın. Jantı ıslatmadan, kapağı kapatın ve bir dakika boyunca 6.000 kez G'de santrifüjleyin. Membran kolonunu iki mililitrelik temiz bir toplama tüpüne yerleştirin ve süzüntüyü içeren tüpü atın.

Membran kolonunu dikkatlice açın ve kenarı ıslatmadan 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Kapağı kapatın ve bir dakika boyunca 6.000 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, membran kolonunu iki mililitrelik temiz bir toplama tüpüne yerleştirin ve süzüntüyü içeren tüpü atın.

Membran kolonunu dikkatlice açtıktan sonra, kenarı ıslatmadan 500 mikrolitre yıkama tamponu iki ekleyin. Kapağı kapatın ve üç dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, membran kolonunu iki mililitrelik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin ve tekrar santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, membran kolonunu 1,5 mililitrelik temiz bir tüpe yerleştirin ve süzüntüyü içeren toplama tüpünü atın. Membran kolonunu dikkatlice açın ve 200 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Bir dakika boyunca 6.000 kez G'de santrifüjlemeden önce sütunu oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

HRM-PCR protokolünü gerçekleştirmek için, önce DNA örneklerini 1.5 mililitrelik tüplerde su ile mikrolitre başına 10 nanogram konsantrasyona seyreltin. Daha sonra, çözülmüş astar çözeltilerini 1.5 mililitrelik tüplerde suyla aynı altı mikromolar konsantrasyona seyreltin. HRM-PCR kit solüsyonlarını çözün ve tüm içeriğin geri kazanılmasını sağlamak için girdap yaparak dikkatlice karıştırın.

DNA bağlayıcı boya, magnezyum klorür ve su ile enzimatik karışım içeren üç şişeyi açmadan önce bir mikrosantrifüjde kısaca döndürün. Oda sıcaklığında 1,5 mililitrelik bir tüpte, metin protokolünde açıklandığı gibi PCR karışımını 120 mikrolitrelik reaksiyona hazırlamak için bileşenleri kullanın. Girdap yaparak dikkatlice karıştırın.

Moleküler biyolojideki iyi uygulamalara göre dikkat ve uygulama ile çalışmanız çok önemlidir. 19 mikrolitre PCR karışımını beyaz çok kuyucuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin. Konsantrasyon ayarlı DNA şablonundan bir mikrolitre ekleyin, ardından beyaz çok kuyulu plakayı sızdırmazlık folyosu ile kapatın.

Beyaz çok kuyulu plakayı, uygun adaptörlere sahip çok kuyulu plakalar için bir rotor içeren standart bir döner kovalı santrifüjde 1.500 kez G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Beyaz çok kuyulu plakayı HRM-PCR cihazına yükleyin. HRM-PCR programını metin protokolünde bulunan PCR koşullarıyla başlatın.

HRM-PCR reaksiyonunu takiben, metin protokolünde açıklandığı gibi CR1 uzunluk polimorfizmini belirlemek için HRM analizi yapın. Füzyon eğrileri, farklı CR1 izoformlarına sahip deneklerin genomik DNA'sından PCR'den türetilen amplikonların yüksek çözünürlüklü eritilmesinden sonra yazılım kullanılarak analiz edildi. Sonuçlar, denekleri allotipik CR1 ekspresyon fenotiplerine göre ayıran eğrilerdir.

İki sunum modu, normalleştirilmiş ve kaydırılmış erime eğrileri ve normalleştirilmiş ve sıcaklık kaydırmalı fark grafiği ile gösterildiği gibi, eğri profilleri CR1 yıldız üç, CR1 yıldız bir gruba, CR1 yıldız bir, CR1 yıldız iki grubuna, CR1 yıldız bir gruba, CR1 yıldız iki grubuna ve CR1 yıldız ikisine göre dağıtılır, CR1 yıldız dört grubu. Bu eğriler CR1 uzunluk polimorfizmi alellerine karşılık gelir. Bu videoyu izledikten sonra, HRM-PCR ile elde edilen mükemmel eğrilere göre CR1 uzunluk polimorfizminin nasıl kolayca genotipleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, halihazırda bilinen CR1 uzunluk genotiplerinin referans örneklerine ihtiyaç duydukları için mücadele edeceklerdir. Ustalaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, her DNA örneği için aynı konsantrasyonu kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, bilinen yeni bir özel SNP'nin bulunması gibi ek soruları yanıtlamak için konik DNA dizilimi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu gelişmeden sonra, bu teknik, CR1 uzunluk polimorfizminde patojenlerin seçici baskısını araştırmak için popülasyon genetiği alanındaki araştırmaların yolunu açmıştır. Bu yöntem Alzheimer hastalığının patogenezindeki duyarlılık hakkında fikir verebilse de, sistemik lupus eritematozus ve sıtma gibi diğer hastalık çalışmalarına da uygulanabilir.