Complement Reseptör 1 Boyunca Polimorfizm Genotiplendirme için Yüksek Çözünürlükte Melting PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç

Bu yöntemin genel amacı, CR1 izoformlarının hastalık patogenezindeki rolünü daha iyi anlamak için Alzheimer hastalığı gibi hastalıklara yatkınlığın değerlendirilmesinde kullanılmak üzere kompleman reseptörü 1 uzunluk polimorfizmlerinin genotiplendirilmesidir. Bu yöntem, Alzheimer hastalığının patogenezi gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, taze kan örnekleri gerektirmemesi ve daha kolay, daha ucuz, daha hızlı olması nedeniyle daha geniş popülasyonlara uygulanabilir olmasıdır.

Bu yöntemle ilgili ilk fikri, Western blot uygulamalarında gereken süre ve taze kan örneği ihtiyacıyla ilgili zorlukları fark ettiğimizde geliştirdik. 1,5 mL'lik bir tüpün dibine 20 µL proteinaz K pipetleyin. Ardından, tüpe 200 µL örnek ekleyin.

Numuneye 200 µL lizis tamponu ekleyin. 15 saniye boyunca kısa süreli vorteksleyerek karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, bir su banyosunda 56 °C'de 10 dakika inkübe edin.

Kapak içindeki damlacıkları uzaklaştırmak için 1,5 mililitrelik tüpü kısa süreli santrifüjleyin. Ardından, örneğe 100 µL etanol ekleyin. Tüpü daha önce olduğu gibi kısa süreli santrifüjlemeden önce, 15 saniye boyunca pulse vortex uygulayarak tekrar karıştırın.

Ardından, karışımı iki mililitrelik bir toplama tüpü içindeki membran kolonuna dikkatlice uygulayın. Kenarları ıslatmadan kapağı kapatın ve 6.000 ×g hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Membran kolonu temiz bir iki mililitrelik toplama tüpüne yerleştirin ve filtratı içeren tüpü atın.

Membran kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarına temas ettirmeden 500 µL yıkama tamponu bir ekleyin. Kapağı kapatın ve 6,000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, membran kolonunu temiz bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve filtratı içeren tüpü atın.

Membran kolon dikkatlice açıldıktan sonra, kenarları ıslatmadan 500 µL yıkama tamponu iki ekleyin. Kapağı kapatın ve 20,000 ×g hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, membran kolonu yeni bir 2 mL toplama tüpüne yerleştirin ve tekrar santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, membran kolonunu temiz bir 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin ve filtratı içeren toplama tüpünü atın. Membran kolonunu dikkatlice açın ve 200 mikrolitre distile su ekleyin. Kolonu oda sıcaklığında beş dakika inkübe ettikten sonra 6.000 ×g hızda bir dakika santrifüjleyin.

HRM-PCR protokolünü gerçekleştirmek için öncelikle DNA örneklerini 1,5 mililitrelik tüplerde su ile mikrolitre başına 10 nanogram konsantrasyona gelecek şekilde seyreltin. Ardından, çözülmüş primer solüsyonlarını 1,5 mililitrelik tüplerde su ile aynı konsantrasyona, yani 6 mikromolar'a seyreltin. HRM-PCR kit solüsyonlarını çözün ve tüm içeriğin geri kazanıldığından emin olmak için vorteksleyerek dikkatlice karıştırın.

DNA bağlayıcı boya içeren enzimatik karışım, magnezyum klorür ve su içeren üç şişeyi açmadan önce bir mikrocentrifüjde kısa süreliğine santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, 1.5 mililitrelik bir tüp içerisinde, metin protokolünde açıklandığı üzere 120 mikrolitrelik reaksiyon için PCR karışımını hazırlamak amacıyla bileşenleri kullanın. Vorteksleyerek dikkatlice karıştırın.

Moleküler biyolojideki iyi uygulama yöntemlerine uygun olarak, dikkatli ve titiz bir şekilde çalışmanız kritik önem taşır. Beyaz çok kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa 19 µL PCR karışımı pipetleyin. Bir µL konsantrasyonu ayarlanmış DNA kalıbı ekleyin ve ardından beyaz çok kuyucuklu plakayı sızdırmazlık folyosu ile kapatın.

Beyaz çok kuyucuklu plakayı, uygun adaptörlere sahip çok kuyucuklu plakalar için bir rotor içeren standart bir salınımlı kova santrifüjünde 1.500 ×g hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin. Beyaz çok kuyucuklu plakayı HRM-PCR cihazına yerleştirin. Metin protokolünde yer alan PCR koşullarıyla HRM-PCR programını başlatın.

HRM-PCR reaksiyonunun ardından, metin protokolünde açıklandığı şekilde CR1 uzunluk polimorfizmini belirlemek için HRM analizi gerçekleştirin. Farklı CR1 izoformlarına sahip deneklerin genomik DNA'sından elde edilen PCR amplikonlarının yüksek çözünürlüklü eritilmesinin ardından, füzyon eğrileri yazılım kullanılarak analiz edilmiştir. Sonuçlar, denekleri allotipik CR1 ekspresyon fenotiplerine göre ayırt eden eğrilerdir.

Normalize edilmiş ve kaydırılmış erime eğrileri ile normalize edilmiş ve sıcaklık kaydırmalı fark grafiği olmak üzere iki sunum modunda gösterildiği üzere, eğri profilleri CR1 star üç, CR1 star bir grubu, CR1 star bir, CR1 star iki grubu, CR1 star bir grubu, CR1 star iki grubu ve CR1 star iki, CR1 star dört grubuna göre dağılmıştır. Bu eğriler, CR1 uzunluk polimorfizmi alellerine karşılık gelmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, HRM-PCR ile elde edilen mükemmel eğrilerle CR1 uzunluk polimorfizminin nasıl kolayca genotiplenebileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Genel olarak, bu yöntemi yeni deneyen kişiler, CR1 uzunluğu genotipleri önceden bilinen referans örneklerin gerekliliği nedeniyle zorlanabilirler. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, her bir DNA örneği için aynı konsantrasyonun kullanılmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Bu prosedürün ardından, yeni bir bilinen özel SNP'nin bulunması gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla konik DNA dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu gelişmenin ardından söz konusu teknik, popülasyon genetiği alanındaki araştırmacıların CR1 uzunluk polimorfizmindeki patojenlerin seçici baskısını keşfetmelerine olanak sağlamaktadır. Bu yöntem, Alzheimer hastalığının patogenezindeki duyarlılık hakkında içgörü sağlayabildiği gibi, sistemik lupus eritematozus ve sıtma gibi diğer hastalık çalışmalarına da uygulanabilir.