Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem

Bu deneysel prosedürün genel amacı, daha sonra kromatin immünopresipitasyon çalışmaları için kullanılabilecek çapraz bağlı iskelet kasından yüksek kaliteli çekirdeklerin hazırlanmasına izin vermektir. Bu yöntem, sirkadiyen veya diğer zamana duyarlı bağlamda kas dokuları ve hücreleri kullanan genomik çalışmalar gibi kas ve sirkadiyen alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, numunelerin anında çapraz bağlanmasına izin vermesi ve filtrasyon tabanlı prosedürün, minimum miyofibril kontaminasyonu ile yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için güvenilir bir şekilde yürütülebilmesidir.

Bu yöntem iskelet kası hakkında bilgi verebilse de, kalp ve düz kaslar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Daha önce tarif edildiği gibi buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin içinde yaklaşık 20 haftalık C57 siyah altı erkek fareden izole edilen arka bacak iskelet kasını tartın ve doğrayın. Kıyılmış iskelet kası dokusunu buz üzerinde 10 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Daha sonra numuneyi beş dakika boyunca dört santigrat derecede 300 kez g santrifüjleyin. PBS süpernatanı aspirasyon ile dikkatlice çıkarın. Bir, iki, üç ve dört mililitre su içeren referans tüpleri kullanarak her 50 mililitrelik tüpteki pelet hacmini tahmin edin.

Yedi hacim buz gibi %1 formaldehit ve PBS ekleyin ve numuneleri bir prob doku homojenizatörü kullanarak buz üzerinde homojenize edin. Ardından, numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek çapraz bağlayın. Çapraz bağlanma reaksiyonunu, bir molar glisin ilavesiyle 0.125 molar nihai konsantrasyona kadar söndürün, ardından oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı aspirasyon yoluyla çıkarın. Peletleri, yeni eklenmiş proteaz inhibitörleri içeren 10 mililitre buz gibi soğuk baz tamponda yeniden süspanse ederek durulayın. Numuneyi tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı aspirasyon ile dikkatlice çıkarın.

Daha sonra peleti, yeni eklenmiş proteaz inhibitörleri içeren altı mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneyi önceden soğutulmuş 15 mililitrelik Dounce homojenizatöre aktarın ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Gevşek bir havaneli kullanarak 15 yavaş vuruşla her numuneyi buz üzerinde homojenize edin, ardından çekirdekleri serbest bırakmak için sıkı bir havaneli ile 15 vuruş yapın.

Aşağıdaki filtreleme adımları, yüksek kaliteli çekirdeklerin izolasyonunun anahtarıdır. Homojenatı bir hücre süzgecinden süzün ve dört mililitre lizis tamponu ile durulayın. Daha sonra numuneleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin.

Peleti beş mililitre buz gibi soğuk baz tamponda yeniden süspanse edin ve çekirdekleri serbest bırakmak için sıkı bir havaneli ile 10 kez Zıplayın. Daha sonra süspansiyonu bir hücre süzgecinden süzün ve tüpü iki mililitre baz tamponla durulayın ve tekrar süzün. Filtrelemeyi, gözenek boyutu kademeli olarak azaltılmış hücre süzgeçleri ile tekrarlayın.

Son olarak, 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 1.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve tekrar santrifüjlemeden önce peleti 500 mikrolitre baz tamponda yeniden süspanse edin. Süpernatanı atın ve peleti eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Numuneleri 500 mikrolitre SDS lizis tamponunda çözdürün ve nazik pipetleme ile yeniden süspanse edin. Çekirdek DNA süspansiyonunu buz üzerinde bir cam şişeye aktarın. Doğru sonikasyon platformunu ve koşulunu seçmek, izole edilmiş çekirdeklerden kromatin hazırlanması için kritik öneme sahiptir.

Metin protokolünde belirtilen ayarları kullanarak disk şeklindeki bir dönüştürücüden odaklanmış ultrasonik akustik enerji patlamaları ile sonikasyonu çalıştırın. Sonikasyonlu kromatini 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra 15 dakika boyunca 12.000 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.

Daha sonra, sonikasyonlu numunenin 50 mikrolitresini, gece boyunca 65 santigrat derecede ters çapraz bağlama için yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. DNA örneklerinin toplanması aşağıdaki bölümde açıklanmıştır. Metin protokolünde tarif edildiği gibi sonikasyon ve kantitasyonun değerlendirilmesini takiben, çözülmüş kromatini tüp başına yaklaşık 100 ila 120 mikrograma kadar alikotlayın.

Daha sonra kromatini bir ila 10 arasında immünopresipitasyon tamponu ile seyreltin. Daha sonra, 40 mikrolitre% 50'lik bir BSA önceden bloke edilmiş protein HE agaroz veya IgY boncukları ekleyin ve dört santigrat derecede üç saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin. Numuneyi 10 dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjledikten sonra, süpernatanı dikkatlice yeni tüplere aktarın.

Daha sonra 25 ila 100 mikrogram kromatin DNA'sı başına bir mikrogram antikorda antikor ekleyin. Gece boyunca dört santigrat derecede ve yaklaşık 15 rpm'de hafifçe döndürün. Daha sonra 10 mikrolitre BSA önceden bloke edilmiş protein, HE, agaroz veya IgY boncukları ekleyin ve karıştırın.

Boncuk süspansiyonunu soğuk odada iki saat döndürün. Ardından, boncukları RIPA tamponu ve ardından metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yüksek tuz tamponu, lityum klorür tamponu ve Tris EDTA ile yıkayın. Yıkamayı takiben, önce bir dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyerek ve süpernatanı dikkatlice çıkararak DNA'yı boncuklardan çıkarın.

Boncukları 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile yeniden süspanse edin. Daha sonra 65 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, beş dakika boyunca 12.000 kez g'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve beş dakika boyunca 12.000 kez g'de bir kez daha santrifüjlemeden önce 50 mikrolitre daha elüsyon tamponu ekleyin. Son elüsyon hacmi 100 mikrolitre olacaktır. Çapraz bağlanmayı tersine çevirmek ve DNA elüsyonunu gerçekleştirmek için, önce ayrıştırılan kromatini gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe etmeden önce bir mikrolitre RNase A ekleyin. Daha sonra, 55 santigrat derecede 30 dakika boyunca mililitre proteaz K başına sekiz mikrolitre 10 miligram inkübe edin. Üreticinin protokolüne göre 50 mikrolitre elüsyon hacmine sahip bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA'yı hasat edin.

Son olarak, profilleri daha önce açıklandığı gibi gerçek zamanlı QPCR ile analiz edin. Sıralı filtrasyon, doku kalıntılarını etkili bir şekilde uzaklaştırdı. İlk filtrelemeden sonra ve seri filtrelemeden sonra numunelerin temsili görüntüleri karşılaştırma için burada gösterilmektedir.

10 döngü sonikasyon yoluyla aşamalı kromatin parçalama, bir agaroz jeli çalıştırılarak ortaya çıkar. Sindirilmiş kromatin ile 10 döngü sonikasyon, yaklaşık 500 baz çiftinin DNA'sı ile sonuçlandı. Burada, ZT6 ve ZT18'de toplanan fare iskelet kası örnekleri ile B erkekleri bir chIP için temsili QPCR sonuçları gösterilmektedir.

Dbp geni üzerindeki Dbp konum elemanlarının analizi, önceki sonuçlarla tutarlı olarak, ZT6 civarında bağlanma zirveleri olduğunu ortaya koydu. Bir kez ustalaştıktan sonra, düzgün bir şekilde yapılırsa çekirdeklerin hazırlanması beş ila altı saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, çapraz bağlı kas dokusundan yüksek kaliteli çekirdekleri ve kromatin DNA'sını saflaştırmak için filtrasyon tabanlı yöntemlerin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, numuneleri buz üzerinde veya soğuk bir odada tutmayı unutmamak ve filtrasyon adımlarından önce ve sonra mikroskobik kontrol için numune alikotlarını saklamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kas ve genomik alanındaki araştırmacıların çeşitli kas dokularında kromatin-protein etkileşiminin sirkadiyen veya zamana duyarlı dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu prosedürü takiben, kas dokularında transkripsiyon faktörü bağlanma paternlerini aramak gibi ek soruları yanıtlamak için chIP dizilimi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.