Name: Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Öğrenin, glioblastoma hastalarının tümör mikro çevre bileşenlerini kromojenik immünohistokimya ve ImageJ kullanarak nicel olarak nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, hücre oranlarını belirlemeye ve tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Dr teşekkür ederim. Fahad Bafakih ve Jim Mandell, hasta numunelerinin edinilmesi ve tanımlanması için Garrett F. Beeghly, Biyorepository ve Doku Araştırma Tesisi, Kardiyovasküler Araştırma Merkezi Histoloji Çekirdeği ve Virginia Üniversitesindeki Biyomoleküler Analiz Merkezi ile yardımda bulunmak için yardım ettiler. Örnek alma, immünohistokimya ve görüntüleme.

Bu protokol, bloke edilmiş klinik hasta örnekleri için normal olduğu gibi, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) numunelerdeki hücresel bileşenleri tanımlar. Parafin gömülmesi, hücresel ve doku morfolojisinin en iyi şekilde korunmasına ve bölümlerin daha uzun ömürlü olmasına olanak tanır. Bu analiz için kullanılan örneklere Virginia Üniversitesi Biyorepository ve Doku Araştırma Tesisi aracılığıyla erişilmiştir. Hasta numuneleri, 2010 ve 2013 yılları arasında Virginia Üniversitesi&#39;nde tümör rezeksiyonlarını tamamlayan ve glioblastoma (astrositom, DSÖ grade IV) kesin bir teşhisine dayanan bir nöropatolog tarafından seçildi ve bu analizden önce tanımlanmadı 11 . 1. FFPE Örneği Deparafinizasyon ve Rehidrasyon NOT: Protokolün bu kısmı FFPE örneklerine özeldir. Parafin gömülü numuneler, bu analiz için hücresel ve t korunmasından dolayı daha yararlı olabilirkenMorfoloji yayınlarken, bu analiz donmuş bölümlerle de yapılabilir. Dondurulmuş kesitler kullanılıyorsa bu bölüm atlanabilir ve direkt olarak kromojenik immünohistokimyaya geçebilir. <ol><li> Ksinilen, ksilen,% 100 etanol,% 100 etanol,% 95 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol, Deiyonize su, Deiyonize su </li></ol> 2. Antijen Geri Alma NOT: Protokolün bu kısmı, FFPE numunelerinin formalin fiksasyonu sırasında oluşan metilen köprülerini kırmak ve bağlamak için antikorlar için antijen alanlarını ortaya çıkarmak için gereklidir. <ol><li> Damıtılmış suda üreticinin tavsiyesi üzerine Tris bazlı yüksek pH antijen maskesini çözündürünüz. </li><li> Bir mikrodalga kullanarak ısı aracılı antijen alımını gerçekleştirin. Isı aracılı geri alımın diğer biçimleri (basınçlı ocak, sebze buharı veya kaynar su gibi) de yeterli olacaktır. <ol><li> Seyreltilmiş maskelenmeyen çözeltiyi, mühürlenmemiş bir mikrodalgaya tabi tutulabilirliğe ilave edindamar. Kayıkları tekneye yerleştirin. Slaytları mikrodalga fırına yerleştirin. </li><li> Yüksek güçlü, 20 dk kaynatın. Buharlaşma için sıvı seviyelerini izleyin ve gerekirse damıtılmış su ile doldurun. </li></ol></li><li> Numunelerin, çözeltide oda sıcaklığında 1 saat bekletilmesine izin verin. </li></ol> 3. Kromojenik İmmünohistokimya <ol><li> Örneği örtmek için gereken reaktif hacmini en aza indirgemek için hidrofobik bir kalem ile doku örneğini ana hatlarıyla çizin. NOT: Doku numunelerini sulu tutun ve lekelenme etkinliğini etkileyeceği için kurumasına izin vermeyin. </li><li> Doku örneğini örtmek için yeterli permeabilizasyon solüsyonu (Tris-tamponlu salin (TBS) +% 0.01 Triton-X) pipetleyin (tipik olarak yaklaşık 100 - 200 μL). </li><li> Çözümü çıkarıp atın ve adım 3.2&#39;yi tekrarlayın. </li><li> Örnekleri engelleme çözeltisi (% 2.5 at serum + permeabilization çözüm) oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Seyreltilmiş primer antikorlarla gece boyunca 4 ºC&#39;de örnekleri inkübe edinEngelleme çözümünde. NOT: Burada kullanılan tüm birincil antikorlar 1: 200&#39;de seyreltilir, ancak en iyi seyreltiler imalatçının tavsiyesi ile başlayan seri seyreltmeler kullanılarak belirlenebilir. Bu protokolde kullanılan antikorlar hakkında ayrıntılı bilgi 11 yayınlanmıştır. </li><li> Birincil antikorları, birincil antikor konakçı hayvana karşılık gelen bir yaban turbu peroksidaz polimer reaktifi kullanarak, üretici protokolünü izleyerek tespit edin. </li><li> Doku numunesini örtmek için 5 dakika yeterli inkübasyon solüsyonu pipetleyin ve inkübe edin. </li><li> Çözümü çıkarın ve atın ve Adım 3.7&#39;yi tekrarlayın. </li><li> 15 dakika boyunca 1 x TBS,% 0.3 H2O 2 slaytlar inkübe edin. </li><li> Bir peroksidaz diaminobenzidin (DAB) substrat ile istenilen leke yoğunluğuna ulaşılıncaya kadar 2-10 dakika örnekler geliştirin. </li><li> Hematoksilen gibi hücre çekirdeğini üreticinin protokolünü izleyerek tanımlamak için leke örnekleri hazırlayın. </li><li> Örnekleri% 100 oranında kurutunEtanol ve ksilen. </li><li> Örnekleri montaj malzemeleri ile kalıcı olarak monte edin. </li></ol> 4. İlgi Alanı Tanımlama Bölgeleri <ol><li> Yüksek çözünürlüklü görüntülere sahip parlak alan mikroskobu altında görüntü slaytları. NOT: Görüntüleme hücresel bileşenlerini en az 20x çözünürlükte kullanın. </li><li> Fotoğraf makinesini doku örnekleri boyunca belirli bölgelere taşıyın. </li><li> Niceleme için resimleri TIFF dosyaları olarak kaydedin. </li></ol> 5. Görüntü Analizi <ol><li> Yüzde kapsama alanının miktarını belirlemek için ImageJ&#39;de resim açın. </li><li> Hematoksilenle boyalı çekirdeğin mor rengini çıkarmak için Eşik Renk eklentisini kullanın. </li><li> Görüntüyü 8 bit&#39;e dönüştürün. </li><li> Karanlık arka plan olmadan eşik ekleyin. </li><li> 17 önceden yüklenmiş ImageJ eşik filtrelerinden ( örn. MaxEntropy) birini kullanarak işlem görüntüsü, böylece yalnızca DAB lekeli kısımları eşiğe dahil edilir. NOT: Minimize eden en iyi ön yüklemeli eşik filtresini seçinArka plan boyamanın dahil edilmesi. Bu, lekelenme kalitesine ve antikorun spesifitesine bağlı olabilir. Her hasta örneğindeki tüm teknik çoğaltmalar için aynı eşiği kullanın. </li><li> Eşik uygula. </li><li> Eşikli görüntünün yüzde alanını ölçün. </li><li> Her örnek içindeki birden çok bölge için yüzde yüzdelik kapsam. </li></ol>

<ol><li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+glioma+growth%3A+a+guerilla+war%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li>
<li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+the+terminator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li>
<li>Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublethal+Irradiation+Promotes+Migration+and+Invasiveness+of+Glioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells.</a> Cancer Res. 61 (6), (2001).</li>
<li>Tuettenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrence+pattern+in+glioblastoma+multiforme+patients+treated+with+anti-angiogenic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).</li>
<li>Munson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-invasive+adjuvant+therapy+with+imipramine+blue+enhances+chemotherapeutic+efficacy+against+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma.</a> Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36(2012).</li>
<li>Correia, A. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+is+a+dominant+force+in+multidrug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.+Updat%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance.</a> Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).</li>
<li>Rubin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Only+in+congenial+soil%3A+the+microenvironment+in+brain+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis.</a> Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Le, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+astrocytes+by+glioma+cells+to+facilitate+invasiveness%3A+a+mechanism+involving+matrix+metalloproteinase-2+and+the+urokinase-type+plasminogen+activator-plasmin+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade.</a> J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+microglia%2Fmacrophages+enhance+the+invasion+of+glioma+stem-like+cells+via+TGF-%CE%B21+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway.</a> J. Immunol. 189, 444-453 (2012).</li>
<li>Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Cellular+Microenvironment+of+Glioblastoma+to+Develop+Predictive+Statistical+Models+of+Overall+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Image+Analysis+of+Cellular+Heterogeneity+in+Breast+Tumors+Complements+Genomic+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling.</a> Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).</li>
<li>Yi, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+Obstructive+Intimal+Lesions+and+Their+Cellular+Phenotypes+in+Chronic+Pulmonary+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).</li>
<li>Turcan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH1+mutation+is+sufficient+to+establish+the+glioma+hypermethylator+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype.</a> Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).</li>
<li>Songtao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH+mutations+predict+longer+survival+and+response+to+temozolomide+in+secondary+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma.</a> Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).</li>
<li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Value+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Patients+with+Glioblastoma+Multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme.</a> Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).</li>
<li>Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+high-grade+gliomas%3A+where+do+we+stand%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?</a> Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).</li>
<li>Badie, B., Schartner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+glioma+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in glioma biology.</a> Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Alves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cells%3A+A+heterogeneous+and+fatal+tumor+interacting+with+the+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.</a> Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+glioma+maintenance+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression.</a> Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocytes+in+the+progression+of+brain+cancer%3A+complicating+the+picture+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment.</a> Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).</li>
<li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752(2013).</li>
</ol>

Burada önerilen yöntemimiz, geleneksel kromojenik immünhistokimyayla boyanan histolojik örneklerin analizinde niceliksel bir yaklaşımdır. Bu tür analizler için güncel metodoloji, bağımsız patologlar tarafından derecelendirilen benzer boyama protokollerini içerir. Bu yöntem güvenilir olmuştur, ancak birçok uygulama için, tümör ile ilişkili heterojenliği daha iyi anlamak ve in vitro çalışmalar için tümörlerin doğru yeniden özetlenmesi gibi, hücresel makyajın daha kesin bir şekilde anlaşılması gerekir. <p class="jove_c...

En yaygın ve malign beyin kanseri olan Glioblastoma (GBM), birincil tümör hacminden çevreleyen sağlıklı beyin parankimine 1 , 2 oranlarında dağılmış istila ile karakterizedir. Bu dağınık istila, tümörün tamamen kesilmesini zorlaştırır ve tedaviden sonra kalan istilacı kanser hücreleri, kaçınılmaz nüksetmenin en yaygın nedenidir 2 , 3 , 4 . Daha önce, diffüz glioma hücre invazyonunu inhibe ederek terapötik açıdan faydalı 5 bulduk, ancak GBM istilasına katkıda bulunan kompleks mekanizmalar hakkında çok az şey biliniyordu. Tümör mikro ortamı veya kanseri çevreleyen doku, çoklu kanserlerde tümörlerin ilerlemesinde rol oynadı 6 , 7 . Glioblastoma tümör mikro ortamı, pEkstraselüler matriks, çözünür faktörler ve biyofiziksel faktörlerin yanı sıra, astrositler, mikroglia ve oligodendrositler gibi çok sayıda glial hücrenin oluşturduğu benzersiz bir şekilde karmaşıktır. Deneysel olarak, astrositler ve mikrogliaların glioma progresyonunu ve istilasını 8 , 9 , 10 arttırdığı gösterilmiştir, ancak doğal insan beyninin mikro ortamındaki tüm glial hücrelerin kompozisyonu bilinmemektedir. Daha önce, mikro çevre bileşenleri, glioblastoma mikro ortamının hücresel bileşenlerini nicel olarak analiz ederek ve analizlerimizi orantısal bir tehlike modeli 11 içine dahil ederek, hastanın hayatta kalmasını öngörebildiğini gösterdi. Burada, glioblastoma hastasından tümör rezeksiyonlarının tümör hacmi ve komşu bölgelerindeki glial hücrelerin popülasyonlarının tanımlanması için nicel analiz metodunu açıklıyoruzs. Glial hücre popülasyonlarını tanımlamak için kromojenik immünohistokimya ve her glial popülasyon için boyamanın yüzde kapsama oranını analiz etmek için ImageJ kullanılmıştır. Kapsam yüzdesinin değerlendirilmesi, özellikle kanser hücreleriyle etkileşimlerden etkilenen hücrelerin morfolojik farklılıklarını belirlemek için basit bir ölçüm oluşturur. Histopatolojik boyamanın nicelleştirilmesi için yapılan önceki çalışmalar, hematoksilin ve eozin 12 veya Masson&#39;s trikrom 13 gibi standart boyayı antikor esaslı immünhistokimyasal boyanmanın özgüllüğünden yararlanmayan boyayı kullanır. Metodumuz, kompleks glioblastoma mikro ortamını aydınlatmak için kullanmayı düşündüğümüz, glioblastoma hasta tümör rezeksiyonlarında glial popülasyonları doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Ksilen</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek pH antijen maskeleme çözeltisi</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>At serumu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oligodendrosit Spesifik Protein1&nbsp;</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS keçi önleyici</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (fare karşıtı/tavşan)</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB substrat</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen karşı leke</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Montaj Ortamı</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Kalem</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

hasta glioblastoma rezeksiyonlarında hücresel mikro Çevrenin kantitatif İmmünohistokimyası

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Tümör mikro ortamındaki artan ilgiyle, ölümcül ve en invaziv beyin kanseri olan glioblastomun hasta örnekleri içindeki mikro çevre bileşenlerini spesifik olarak belirlemek için bir yöntem geliştirdik. Kantitatif yöntemler hastalıklı dokuları doğru bir biçimde tanımlamak için yararlı değildir, aynı zamanda potansiyel olarak daha doğru prognoz, teşhis ve doku mühendisliğindeki sistemlerin ve replasmanların geliştirilmesine katkıda bulunabilirler. Glioblastomada, mikroglia ve astrositler gibi glial hücreler, patoloğun derecelendirmesine dayalı zayıf prognoz ile bağımsız olarak ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin ve diğer glial hücre bileşenlerinin durumu nicel olarak iyi tanımlanmamıştır. Bu, bu glial hücreleri işaretleyen büyük süreçler nedeniyle zor olabilir. Dahası, histolojik analizlerin çoğu, genel doku örneğine veya yalnızca tümör hacmine odaklanır; zira bölgeleri esas alan kantifikasyonları tasvir ederÇok heterojen dokuda. Burada, glioblastoma hastalarından tümör rezeksiyonlarının tümör hacmi ve komşu bölgelerindeki glial hücrelerin popülasyonlarının tanımlanması ve nicel olarak analiz edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Hastanın tümör rezeksiyonlarında glial hücre popülasyonlarını ve ImageJ&#39;de kromojenik immünohistokimya kullandık ve her glial popülasyon için boyama yüzdesini analiz ettik. Bu tekniklerle, glioma tümör mikro ortamının bölgeleri boyunca glial hücreleri daha iyi tarif edebiliyoruz.

Bu analiz için, tümör rezeksiyonlarımızda iki bölgenin (esas olarak diffüz istilalı kanser hücreli sağlıklı dokudan oluşan primer tümör hacmi ve komşu bölgeler), hematoksilin ve eozin boyalı hastada nöropatologların işbirliği yaptığı tespit edildi ( Şekil 1A , 1B ) örnekleri. Her hasta örneği içinde, astrositler ( Şekil 1C ), mikroglia ( Şekil 1D ) ve oligodendrositler ( <strong cla...

Bu protokol, kromojenik immünhistokimya ve ImageJ kullanılarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikro çevre bileşenlerini nicel olarak tanımlamak için geliştirildi.

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Bu protokolün genel amacı, kromojenik immünohistokimya ve Image J kullanarak glioblastoma hastalarından alınan rezeksiyonlarda tümör mikroçevre bileşenlerini kantitatif olarak tanımlamaktır. Bu yöntem; bu bileşenlerin hasta örneklerinde nasıl göründüğü ve hücrelerin fizyolojik olarak ilgili oranlarını nasıl belirleyebileceğimiz gibi tümör mikroçevresi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hasta örneklerinin analizi için basit ve doğrudan bir yöntem olmasıdır. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, yeterince tanımlanmamış ve karmaşık olan glioblastoma tümör mikroçevresinin aydınlatılmasına yöneliktir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, dokunun aşırı gelişmesini ve doygunluğa ulaşmasını önlemek için kromojenik gelişme süresinin yakından izlenmesi gerektiğinden zorluk yaşayacaklardır. Protokole, beraberindeki metin protokolünde belirtilen yıkama işlemlerini gerçekleştirerek başlayın. Tris bazlı yüksek pH'lı antijen maske çözücü çözeltiyi ve distile suyu, üretici önerilerine uygun olarak seyreltin.Seyreltilmiş maske çözme solüsyonunu sızdırmaz olmayan mikrodalgaya uygun bir kaba ekleyerek ısı aracılı antijen geri kazanma işlemine geçin. Lamları kabın içine yerleştirin. Ardından, lamların bulunduğu kabı mikrodalga fırına yerleştirin.Ardından, kabı yüksek güçte 20 dakika boyunca kaynatın. Buharlaşma nedeniyle sıvı seviyelerini izleyin ve gerektiğinde kabı distile su ile tamamlayın. Örneklerin oda sıcaklığında bir saat boyunca çözelti içinde soğumasını bekleyin.Numuneyi örtmek için gereken reaktif hacmini en aza indirmek amacıyla doku örneğinin etrafını hidrofobik bir kalemle çevreleyin. Ardından, doku örneğini kaplayacak kadar, 100 ila 200 microliters permeabilizasyon solüsyonu ekleyin. Solüsyonu çekip atın ve doku örneğini tekrar permeabilizasyon solüsyonu ile kaplayın.Numuneleri oda sıcaklığında bloke edici çözelti ile bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, numuneleri bloke edici çözelti içinde dilüe edilmiş primer antikorlar ile dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, primer antikorları, primer antikorun konak hayvanı ile uyumlu bir yaban turpu peroksidaz polimer reaktifi kullanarak tespit edin.Doku örneğini kaplayacak kadar permeabilizasyon çözeltisini pipetle ekleyin ve örneği beş dakika boyunca inkübe edin. Çözeltiyi çekip atın ve doku örneğini beş dakika daha permeabilizasyon çözeltisiyle kaplayın. Lamları 0.3% hidrojen peroksit ve IX TBS içerisinde 15 dakika boyunca inkübe edin.İstenilen boyama yoğunluğu elde edilene kadar örnekleri iki ila 10 dakika boyunca peroksidaz diaminobenzidin veya dab substratı ile geliştirin. Hücre çekirdeklerini belirlemek için, üretici protokolünü takip ederek hematoksilin ile örnekleri karşıt boyayın. Örnekleri %100 etanol ve ksilen iledehidre edin.Son olarak, örnekleri montaj medyumu ile kalıcı olarak monte edin. Tümör rezeksiyonlarımız içindeki iki ilgi alanı, yani primer tümör Bulk ve esas olarak yaygın istilacı kanser hücreleri içeren sağlıklı dokudan oluşan Komşu bölgeler, hematoksilin ve eozin boyalı hasta örnekleri üzerinde iş birliği yapan nöropatolog tarafından belirlenmiştir. Kromojenik immünohistokimya, her bir hasta örneğinde astrositler, mikroglia ve oligodendrositler için pozitif boyanma saptamıştır.Negatif kontrol için primer antikor kullanmadan boyama gerçekleştirdik. Anti ALDH 1l1 antikoru ile hücre gövdesinin ve uzantılarının optimal pozitif boyanması sağlanırken arka planın minimize edilmesi nedeniyle, üreticinin önerdiği ve daha sonra karar kıldığımız 1:200 seyreltme oranı kullanıldı. Image J kullanılarak, ilgi alanlarımızdaki farkları karşılaştırabilmek amacıyla OSP-1 pozitif oligodendrosit boyanmasının yüzde kaplama alanı nicelleştirildi.Görüntüye uygun eşik değer uygulandıktan sonra, eşikten elde edilen yüzde kapsama alanı ölçülebilir ve birden fazla hasta için karşılaştırılabilir. Glioblastoma veya GBM hasta örneklerinden alınan beş komşu ve toplu bölge ile sağlıklı beyin dokusu, oligodendrosit-spesifik protein bir veya OSP1 yüzde kapsamı açısından karşılaştırılmıştır. Teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde yürütülürse boyama tekniği ilk gün dört saatte ve ikinci gün iki saatte tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, doku boyama yoğunluğunu ve hidrasyonu yakından izlemenin önemli olduğunu unutmayın.

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Núñez, F. J.,  et al. Parafin Gömülü 3D Glioma Nörosfer Kültürlerinde İmmünohistokimya ile Gliomdaki Biyobelirteçlerin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019). Bu video, parafine gömülü beyin tümörü nörosferlerinde tümör biyobelirteçlerini etiketlemek için immünohistokimyasal bir tekniği göstermektedir. Nörosfer bölümleri parafin uzaklaştırma ve rehidrasyona tabi tutulur, ardından biyobelirteç bölgelerini ortaya çıkarmak için tedavi uygulanır. Birincil ve ikincil antikorlar daha sonra bu...

Beyin Tümörü Nörosfer Kesitlerinde Biyobelirteçlerin İmmünohistokimyasal Boyanması

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

Burada, orthotopic insan birincil beyin tümörü taşıyan immünyetmezligi farelerde hazırlık ve allojenik insan lenfosit stereotaksik yönetim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu çalışmada bir kanıtı-of-concept fizibilite ve hücresel immunotherapies intrabrain teslim antitümör etkinliği için sağlar.

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

3D kültürler yetiştirilen Neurospheres tümörü biyoloji eğitim için güçlü bir araç oluşturur. Burada parafin katıştırma üzerinden tümörü neurospheres 3D yapısını koruyarak immünhistokimya gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem, tümörü neurosphere özellikleri stemness ve sinirsel farklılaşma gibi karakterizasyonu sağlar.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Proteomik disregülasyon, yaygın olarak infiltre eden gliomların yayılmasında önemli bir rol oynar, ancak birkaç ilgili protein tanımlanmamıştır. Dijital mekansal işleme (DSP), infiltratif gliomların invazyonu ve göçüne katkıda bulunabilecek aday proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu karakterize etmek için verimli, yüksek verimli bir yaklaşım sunar.

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

İnvaziv cephede glioma tümör mikroçevresini replike etmek için interstisyel sıvı akışını içeren bir yöntem sunuyoruz. Bu model, bir sıvı basınç başlığının uygulanabileceği bir doku kültürü ekinde bir hyaluronan-kollajen I hidrojeldir. İstila ölçülebilir ve hücreler izole edilebilir veya parçalanabilir.

İnterstisyel Akışlı İnvaziv Glioma Mikroçevresinin Fotopolimerize Olabilen Hyaluronik Asit-Kollajen Modeli

Bu protokol, tümör anjiyogenezinin nicel proteomik analizi için lazer-yakama mikrodiseksiyonu kullanarak glioma örneklerinden yeterli yüksek kaliteli neovasküler doku hazırlamış, geleneksel olarak anjiyojenik faktörlere odaklanan çalışmaların sınırlamalarını aşmış ve glioma anjiyogenezinin geniş ölçekli proteomik profilini sağlamıştır.

İnsan Glioma Dokularından Neovasküler Dokuların Tümör Anjiyogenezinin Nicel Proteomik Analizi İçin Hazırlanması

Öğrenin, glioblastoma hastalarının tümör mikro çevre bileşenlerini kromojenik immünohistokimya ve ImageJ kullanarak nicel olarak nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem, hücre oranlarını belirlemeye ve tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

Daha fazla video keşfet