Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası
31 Temmuz 2017
Bu protokol, kromojenik immünhistokimya ve ImageJ kullanılarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikro çevre bileşenlerini nicel olarak tanımlamak için geliştirildi.
Bu protokolün genel amacı, kromojenik immünohistokimya ve görüntü J kullanarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikroçevre bileşenlerini kantitatif olarak tanımlamaktır. Bu tekniğin temel avantajı, hasta örneklerinde analiz için basit olmasıdır. Bu tekniğin etkileri, yetersiz karakterize edilmiş, karmaşık glioblastoma tümör mikroçevresinin aydınlatılmasına kadar uzanır.
Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü dokunun aşırı gelişmesini ve doygunluğunu önlemek için kromojenik gelişim zamanlamasının yakından izlenmesi gerekir. Eşlik eden metin protokolünde belirtilen yıkamaları gerçekleştirerek protokole başlayın. Üreticinin tavsiyelerini kullanarak tris bazlı yüksek pH'lı antijen maskeleme solüsyonunu ve damıtılmış suyu seyreltin.
Seyreltilmiş maskeleme solüsyonunu sızdırmaz olmayan mikrodalgaya uygun bir kaba ekleyerek ısı aracılı antijen alımına geçin. Slaytları tekneye yerleştirin. Ardından kap slaytlarını mikrodalgaya yerleştirin.
Daha sonra, kabı yüksek güçte 20 dakika kaynatın. Buharlaşma için sıvı seviyelerini izleyin ve kabı gerektiği kadar damıtılmış su ile doldurun. Numunelerin oda sıcaklığında bir saat boyunca çözelti içinde soğumasına izin verin.
Numuneyi kaplamak için gerekli reaktiflerin hacmini en aza indirmek için doku numunesini bir hidrofobik ile ana hatlarıyla belirtin. Ardından, doku örneğini kaplamak için 100 ila 200 mikrolitre yeterli geçirgenlik solüsyonu sıkın. Solüsyonu çıkarın ve atın ve doku örneğini tekrar geçirgenleştirme solüsyonu ile kaplayın.
Numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti ile inkübe edin. Daha sonra, numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve birincil antikorlar bloke edici çözelti içinde seyreltilir. Ertesi gün, birincil antikor konakçı hayvana karşılık gelen bir yaban turpu peroksidaz polimer reaktifi kullanarak birincil antikorları tespit edin.
Doku örneğini kaplayacak kadar geçirgenlik solüsyonu sıkın ve örneği beş dakika inkübe edin. Solüsyonu çıkarın ve atın ve doku örneğini beş dakika boyunca bir kez daha geçirgenleştirme solüsyonunda kaplayın. Slaytları% 0.3 hidrojen peroksit ve IX TBS'de 15 dakika inkübe edin.
İstenilen leke yoğunluğu elde edilene kadar numuneleri bir peroksidaz, diaminobenzidin veya dab substratı ile iki ila 10 dakika geliştirin. Üretici protokolünü izleyerek hematoksilen gibi hücre çekirdeklerini tanımlamak için numuneleri karşı boyayın. Numuneleri %100 etanol ve ksilen ile kurutun.
Son olarak, numuneleri montaj ortamıyla kalıcı olarak monte edin. Tümör rezeksiyonlarımız içinde ilgilenilen iki bölge, primer tümör Bulk ve Komşu bölgeler, öncelikle diffüz invaziv kanser hücrelerine sahip sağlıklı dokudan oluşan, hematoksilen ve eozin lekeli hasta örnekleri üzerinde işbirliği yapılan nöropatologlar tarafından tanımlandı. Kromojenik immünohistokimya, her hasta örneğinde astrositler, mikroglia ve oligodendrositler için pozitif boyamayı tanımladı.
Negatif kontrol için primer antikor olmadan boyama yaptık. Üretici, hücre gövdesinin optimal pozitif boyanması ve anti ALDH 1l1 antikoru için en aza indirgenmiş arka plan ile işlem nedeniyle bir ila 200 seyreltmeye yerleşmeden önce daha fazla seyreltme önerdi. Resim J kullanılarak, OSP-1 pozitif oligodendrosit boyamanın yüzde kapsamı, sonunda ilgilendiğimiz bölgelerdeki farklılıkları karşılaştırmak için ölçüldü.
Görüntüye uygun eşik uygulandıktan sonra, eşikten elde edilen kapsama yüzdesi ölçülebilir ve birden fazla hasta için karşılaştırılabilir. Sağlıklı beyin dokusu ile birlikte glioblastoma veya GBM hasta örneklerinin beş bitişik ve toplu bölgesi, oligodendrosit spesifik protein bir veya OSP1 yüzde kapsamı için karşılaştırıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, boyama tekniği uygun şekilde yapılırsa ilk gün dört saat ve ikinci gün iki saat içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, doku lekelenme yoğunluğunu ve hidrasyonunu yakından izlemeyi unutmamak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kromojenik immünohistokimya ve ImageJ kullanarak glioblastom hasta rezeksiyonlarında tümör mikroçevre bileşenlerini kantitatif olarak belirleme yöntemi açıklamaktadır. Bu teknik, karmaşık glioblastom tümör mikroçevresine dair bilgiler sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Histiyoloji
Arka Plan
- Glioblastom, oldukça agresif bir beyin tümörüdür.
- Tümör mikroçevresi, tümör ilerlemesinde kritik bir rol oynar.
- Bu çevrenin bileşimini anlamak, hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesi için esastır.
- Kromojenik immünohistokimya, doku bileşenlerinin detaylı görselleştirilmesine izin verir.
Çalışmanın Amacı
- Glioblastom örneklerinde tümör mikroçevresini kantitatif olarak değerlendirmek.
- Farklı hücre tiplerinin fizyolojik olarak ilgili oranlarını belirlemek.
- Hasta örnekleri için basit bir analiz yöntemi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Doku boyama için kromojenik immünohistokimya.
- Kantitatif analiz için ImageJ yazılımı.
- Üreticinin tavsiyelerine göre yıkama ve antijen maskeleme protokolleri.
- Kromojenik gelişim zamanlamasının dikkatli izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Çeşitli tümör mikroçevre bileşenlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Glioblastom örneklerinde hücre oranlarını belirleme yöntemlerinin kurulması.
- Glioblastom mikroçevresinin karmaşıklığı hakkında bilgiler.
- Yöntemin hasta örneklerine uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Bu protokol, glioblastom mikroçevrelerini incelemek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Tümör mikroçevresindeki etkileşimleri anlamak için yardımcı olur.
- Gelecek araştırmaları, bu bulgulara dayanarak glioblastom tedavi stratejilerini geliştirmeye katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of the tumor microenvironment in patient-derived glioblastoma samples enables mechanistic de-risking of glial cell targets in neuro-oncology drug discovery. By providing reproducible, region-specific measurements of astrocytes, microglia, and oligodendrocytes, this method supports target validation and phenotypic screening in disease-relevant systems. It enhances predictive confidence in preclinical models by linking microenvironment composition to therapeutic response and resistance mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial cell phenotypes and their functional states within heterogeneous tumor regions.
- Operational Value: Provides quantitative, image-based readouts for assessing target engagement and microenvironment modulation.
- Predictive Value: Supports biomarker-aligned target selection by correlating glial abundance with pathological gradients in patient samples.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized immunohistochemistry protocols compatible with high-throughput imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Delivers percent coverage metrics via ImageJ that enable inter-sample and inter-region comparisons.
- Reproducibility: Defines critical timing controls for chromogenic development to ensure signal specificity and minimize background noise.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses actual patient resection samples to maintain pathophysiological fidelity in target validation studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by defining quantitative benchmarks for glial cell composition.
- Risk Mitigation: Reduces biological de-risking uncertainty in glial-targeted therapies by characterizing microenvironmental context.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for neuro-oncology programs focused on microenvironment modulation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by enabling spatial and quantitative profiling of glial populations in human tissue.
- Screening: Generates standardized, quantifiable staining patterns that can be used to evaluate compound effects on microenvironmental composition.
- Analytics: Provides threshold-based percent coverage measurements that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking glial cell densities to histopathological regions of interest.
- Enterprise Reuse: Establishes a transferable IHC/ImageJ workflow applicable across glioma and other CNS tumor models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence through quantitative, spatially resolved glial cell analysis in patient samples.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized antigen retrieval, blocking, and development timing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing ambiguity in target microenvironment interactions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial-modulating therapeutics based on microenvironmental engagement data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and neuropathological sample handling.
- Dependent on optimized chromogenic development timing to avoid signal saturation.
- Necessitates standardized ImageJ thresholding protocols for consistent quantification.
- Requires access to patient-derived glioblastoma resection samples with annotated regions of interest.
- Limited by tissue heterogeneity and the need for region-specific analysis to avoid confounding signals.
