Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası
31 Temmuz 2017
Bu protokol, kromojenik immünhistokimya ve ImageJ kullanılarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikro çevre bileşenlerini nicel olarak tanımlamak için geliştirildi.
Bu protokolün genel amacı, kromojenik immünohistokimya ve görüntü J kullanarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikroçevre bileşenlerini kantitatif olarak tanımlamaktır. Bu tekniğin temel avantajı, hasta örneklerinde analiz için basit olmasıdır. Bu tekniğin etkileri, yetersiz karakterize edilmiş, karmaşık glioblastoma tümör mikroçevresinin aydınlatılmasına kadar uzanır.
Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü dokunun aşırı gelişmesini ve doygunluğunu önlemek için kromojenik gelişim zamanlamasının yakından izlenmesi gerekir. Eşlik eden metin protokolünde belirtilen yıkamaları gerçekleştirerek protokole başlayın. Üreticinin tavsiyelerini kullanarak tris bazlı yüksek pH'lı antijen maskeleme solüsyonunu ve damıtılmış suyu seyreltin.
Seyreltilmiş maskeleme solüsyonunu sızdırmaz olmayan mikrodalgaya uygun bir kaba ekleyerek ısı aracılı antijen alımına geçin. Slaytları tekneye yerleştirin. Ardından kap slaytlarını mikrodalgaya yerleştirin.
Daha sonra, kabı yüksek güçte 20 dakika kaynatın. Buharlaşma için sıvı seviyelerini izleyin ve kabı gerektiği kadar damıtılmış su ile doldurun. Numunelerin oda sıcaklığında bir saat boyunca çözelti içinde soğumasına izin verin.
Numuneyi kaplamak için gerekli reaktiflerin hacmini en aza indirmek için doku numunesini bir hidrofobik ile ana hatlarıyla belirtin. Ardından, doku örneğini kaplamak için 100 ila 200 mikrolitre yeterli geçirgenlik solüsyonu sıkın. Solüsyonu çıkarın ve atın ve doku örneğini tekrar geçirgenleştirme solüsyonu ile kaplayın.
Numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edici çözelti ile inkübe edin. Daha sonra, numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve birincil antikorlar bloke edici çözelti içinde seyreltilir. Ertesi gün, birincil antikor konakçı hayvana karşılık gelen bir yaban turpu peroksidaz polimer reaktifi kullanarak birincil antikorları tespit edin.
Doku örneğini kaplayacak kadar geçirgenlik solüsyonu sıkın ve örneği beş dakika inkübe edin. Solüsyonu çıkarın ve atın ve doku örneğini beş dakika boyunca bir kez daha geçirgenleştirme solüsyonunda kaplayın. Slaytları% 0.3 hidrojen peroksit ve IX TBS'de 15 dakika inkübe edin.
İstenilen leke yoğunluğu elde edilene kadar numuneleri bir peroksidaz, diaminobenzidin veya dab substratı ile iki ila 10 dakika geliştirin. Üretici protokolünü izleyerek hematoksilen gibi hücre çekirdeklerini tanımlamak için numuneleri karşı boyayın. Numuneleri %100 etanol ve ksilen ile kurutun.
Son olarak, numuneleri montaj ortamıyla kalıcı olarak monte edin. Tümör rezeksiyonlarımız içinde ilgilenilen iki bölge, primer tümör Bulk ve Komşu bölgeler, öncelikle diffüz invaziv kanser hücrelerine sahip sağlıklı dokudan oluşan, hematoksilen ve eozin lekeli hasta örnekleri üzerinde işbirliği yapılan nöropatologlar tarafından tanımlandı. Kromojenik immünohistokimya, her hasta örneğinde astrositler, mikroglia ve oligodendrositler için pozitif boyamayı tanımladı.
Negatif kontrol için primer antikor olmadan boyama yaptık. Üretici, hücre gövdesinin optimal pozitif boyanması ve anti ALDH 1l1 antikoru için en aza indirgenmiş arka plan ile işlem nedeniyle bir ila 200 seyreltmeye yerleşmeden önce daha fazla seyreltme önerdi. Resim J kullanılarak, OSP-1 pozitif oligodendrosit boyamanın yüzde kapsamı, sonunda ilgilendiğimiz bölgelerdeki farklılıkları karşılaştırmak için ölçüldü.
Görüntüye uygun eşik uygulandıktan sonra, eşikten elde edilen kapsama yüzdesi ölçülebilir ve birden fazla hasta için karşılaştırılabilir. Sağlıklı beyin dokusu ile birlikte glioblastoma veya GBM hasta örneklerinin beş bitişik ve toplu bölgesi, oligodendrosit spesifik protein bir veya OSP1 yüzde kapsamı için karşılaştırıldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, boyama tekniği uygun şekilde yapılırsa ilk gün dört saat ve ikinci gün iki saat içinde yapılabilir.
Bu prosedürü denerken, doku lekelenme yoğunluğunu ve hidrasyonunu yakından izlemeyi unutmamak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kromojenik immünohistokimya ve ImageJ kullanarak glioblastoma hastalarından alınan rezeksiyonlarda tümör mikroçevresi bileşenlerinin kantitatif olarak tanımlanması için bir yöntem açıklamaktadır. Bu teknik, karmaşık glioblastoma tümör mikroçevresine dair içgörüler sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Histoloji
Arka Plan
- Glioblastoma oldukça agresif bir beyin tümörüdür.
- Tümör mikroçevresi, tümör progresyonunda kritik bir rol oynar.
- Bu ortamın bileşimini anlamak, hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesi için gereklidir.
- Kromojenik immünohistokimya, doku bileşenlerinin ayrıntılı şekilde görselleştirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Glioblastoma örneklerindeki tümör mikroçevresini kantitatif olarak değerlendirmek.
- Farklı hücre tiplerinin fizyolojik olarak anlamlı oranlarını belirlemek.
- Hasta örnekleri için kolay uygulanabilir bir analiz yöntemi sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Doku boyama için kromojenik immünohistokimya.
- Kantitatif analiz için ImageJ yazılımı.
- Üretici önerilerine uygun yıkama ve antijen maskesinin açılması protokolleri.
- Kromojenik gelişme süresinin dikkatli şekilde izlenmesi.
Temel Sonuçlar
- Çeşitli tümör mikroçevre bileşenlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Glioblastoma örneklerinde hücre oranlarının belirlenmesine yönelik yöntemlerin oluşturulması.
- Glioblastoma mikroçevresinin karmaşıklığına dair öngörüler.
- Yöntemin hasta örneklerine uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Bu protokol, glioblastoma mikroçevrelerinin incelenmesi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Tümör mikroçevresi içindeki etkileşimlerin anlaşılmasına yardımcı olur.
- Gelecekteki araştırmalar, glioblastoma tedavi stratejilerini geliştirmek için bu bulgular üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Hasta kaynaklı glioblastoma örneklerinde tümör mikroçevresinin kantitatif analizi, nöro-onkoloji ilaç keşfinde glial hücre hedeflerinin mekanistik risk azaltımına olanak tanır. Astrositlerin, mikrogliaların ve oligodendrositlerin tekrarlanabilir, bölgeye özgü ölçümlerini sağlayarak bu yöntem, hastalıkla ilişkili sistemlerde hedef doğrulamayı ve fenotipik taramayı destekler. Mikroçevre bileşimini terapötik yanıt ve direnç mekanizmalarıyla ilişkilendirerek preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Heterojen tümör bölgelerindeki glial hücre fenotiplerinin ve fonksiyonel durumlarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşimini ve mikroçevre modülasyonunu değerlendirmek için görüntü tabanlı kantitatif okumalar sağlar.
- Öngörücü Değer: Hasta örneklerindeki glial yoğunluğunu patolojik gradyanlarla ilişkilendirerek biyobelirteç odaklı hedef seçimi sürecini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek verimli görüntüleme ve analiz hatlarıyla uyumlu, standartlaştırılmış immünohistokimya protokolleri oluşturur.
- Kantitatif Çıktı: Örnekler ve bölgeler arası karşılaştırmalara olanak tanıyan yüzde kapsama metriklerini ImageJ aracılığıyla sunar.
- Tekrarlanabilirlik: Sinyal özgüllüğünü sağlamak ve arka plan gürültüsünü en aza indirmek için kromojenik geliştirme için kritik zamanlama kontrollerini tanımlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Hedef doğrulama çalışmalarında patofizyolojik sadakati korumak için gerçek hasta rezeksiyon örnekleri kullanılır.
- Translasyonel Süreklilik: Glial hücre kompozisyonu için kantitatif referans noktaları tanımlayarak, keşif bulguları ile preklinik modeller arasında köprü kurar.
- Risk Azaltma: Mikroçevresel bağlamı karakterize ederek, glial hedefli tedavilerdeki biyolojik risk azaltma belirsizliğini düşürür.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif sürekliliğine, özellikle de mikroçevre modülasyonuna odaklanan nöro-onkoloji programlarına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: İnsan dokusundaki glial popülasyonların mekansal ve kantitatif profillenmesini sağlayarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Tarama: Bileşiklerin mikroçevresel kompozisyon üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılabilecek standartlaştırılmış, ölçülebilir boyama paternleri oluşturur.
- Analitik: Deneysel koşullar arasında istatistiksel karşılaştırmaya olanak tanıyan eşik tabanlı yüzde kapsama ölçümleri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Glial hücre yoğunluklarını histopatolojik ilgi bölgeleriyle ilişkilendirerek biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Gliom ve diğer MSS tümör modellerinde uygulanabilir, aktarılabilir bir IHC/ImageJ iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hasta örneklerinde nicel ve mekânsal olarak çözümlenmiş glial hücre analizi yoluyla hedef güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış antijen geri kazanımı, bloklama ve geliştirme süresi protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Hedef mikroçevre etkileşimlerindeki belirsizliği azaltarak devam/dur karar verme sürecini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Mikroçevresel etkileşim verilerine dayanarak, glial modüle edici terapötiklerin risk ayarlı önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- İmmünohistokimya ve nöropatolojik örnek işleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Sinyal saturasyonunu önlemek için optimize edilmiş kromojenik geliştirme süresine bağlıdır.
- Tutarlı kantifikasyon için standardize edilmiş ImageJ eşikleme protokollerini gerektirir.
- Not edilmiş ilgi bölgeleri bulunan, hastadan türetilmiş glioblastoma rezeksiyon örneklerine erişim gerektirir.
- Doku heterojenliği ve kafa karıştırıcı sinyalleri önlemek için bölgeye özgü analiz gereksinimi ile sınırlıdır.
