Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı
September 7th, 2017
C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.
Bu prosedürün genel amacı, feromonlara maruz kaldığında erkek C.Elegans baş nöronlarında bir görüntü kalsiyum geçiciliğini etkili bir şekilde yakalamaktır. Bu yöntem, cinsiyete özgü nöral devre düzenlemesini anlamak gibi nörobiyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, erkek C.Elegans'ın artık bir mikro-akışkan tuzak cihazında verimli bir şekilde görüntülenebilmesidir.
Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü hayvanları yüklemek ilk başta zor olabilir ve biyojenik feromonlar her hayvanda kalsiyum geçişine neden olmaz. Rezervuarların montajına başlamak için, bir ucuna bir iğne ve diğer ucuna metal bir boru sokarak üç set boru hazırlayın. Daha sonra, her rezervuar için, üç bir luer valfi alın ve pistonu çıkarılmış 30 mililitrelik bir şırıngaya, üç mililitrelik bir şırıngaya ve boruya takın.
Her rezervuarı, uyaran S bazal veya floresan içeren S bazal olan uygun tamponla doldurun. Ardından, şırıngayı hafifçe vurarak ve pompalayarak hem rezervuardaki hem de borudaki hava kabarcıklarını çıkarın. Şimdi, üç mililitrelik yeni bir şırınga ve hortumu S bazal ile doldurun ve mikro akışkan cihazın çıkış portuna yerleştirin.
Giriş deliklerinin yüzeyinde tampon görünene kadar şırıngaya hafifçe biraz baskı uygulayın. Ardından, akış kontrolü, tampon ve uyaran rezervuar tüplerini uygun giriş deliklerine bağlayın ve hem yükleme portu deliğinde hem de takılacak boruda sıvı damlalarının bulunduğundan emin olun. Şimdi, solucan yükleme portu girişinde damlacıklar görünene kadar şırıngaya hafifçe biraz daha fazla basınç uygulayın, ardından bu porta katı bir engelleme pimi yerleştirin.
Ardından, şırıngayı çıkış portundan çıkarın ve vakum yuvasına bağlı bir çıkış hattı takın. Şimdi, mikroskoptan gelen video beslemesindeki şamandıra kanallarında herhangi bir kabarcık olup olmadığını kontrol edin. Canlı görüntüyü gözlemlemek için canlı'ya tıklayın ve devam etmeden önce baloncukların doğal olarak dağılmasını bekleyin.
Ardından, floresan ışık kaynağını açın ve uygun akış dinamiklerini doğrulamak için bir GFP filtresi kullanın. Üç dalga valfini çalıştırın ve valf açıkken video akışında floresan kontrol akışının göründüğünü gözlemleyin. Başlamak için, tohumlanmamış bir NGM agar plakasına bir solucan seçin ve solucanın sürünerek uzaklaşmasına izin verin.
Ardından, plakayı S bazal ile yüzdürün. Solucanı içeren çözeltiyi şırınganın içine çekin. Şimdi, cihazda, çıkış luer valfini kullanarak akışı durdurmak için vakumu kapatın.
Ardından, sonsuz yükleme portunu tıkayan katı pimi çıkarın. Solucan içeren hortumu yükleme portuna yerleştirin. Çıkış luer valfini açın ve canlı video beslemesini gözlemleyin.
Şimdi, solucan görünene kadar şırıngaya hafif bir baskı uygulayın. Önce kuyruğa girerse solucanı geri çekin, uyarana maruz kalması için önce kafasına girmesi gerekir. Kullanıcı, kuyruk kanala tam olarak girmeden önce solucanı geri çekmelidir, aksi takdirde solucanı kanaldan çıkarmak son derece zordur ve genellikle solucanın kanaldan tamamen yıkanmasını ve yeni bir solucan yüklenmesini gerektirir.
Şimdi, şırıngadan gelen basıncı kullanarak, solucanı kanaldan ilerletin ve solucanın kafasını konumlandırın, böylece tampon akışına maruz kalır, ancak kanalın içine çok fazla girmez, hareket etmekte serbest kalır. Felçli olmayan hayvanlarda az miktarda eksenel veya rotasyonel hareket beklenir. Her ne kadar tamponlara bir felç ilavesi bu etkiyi neredeyse ortadan kaldırsa da.
Deneme sırasında hareket olasılığını azaltmak için, daha verimli bir şekilde yakalanan yaşlı erkekleri kullanın, solucan yükleme portunun genişliğini veya kalınlığını azaltın veya felçlide geçirilen süreyi artırın. Mavi ışık uyarımını kullanarak kayıt yapmak için yazılımı kullanın. Pozlamayı 100 milisaniyeye ayarlayın, görüntü alma penceresini açın, zaman noktalarını sıfırda bir aralıkla 300'e ayarlayın ve ardından görüntü alımını başlatın.
Beş saniye sonra, tamponları kontrol eden üç vanayı değiştirerek uyarıyı uygulayın. 10 saniyelik bir stimülasyon iyi bir başlangıç noktasıdır ve uyaranın uzunluğu gerektiği gibi ayarlanabilir. Stimülasyondan sonra, düğmeye tekrar basarak akışı geri alın ve 30 saniyelik video tamamlanana kadar kayda devam edin.
Bu, g kampı floresansının taban çizgisine dönmesini sağlar. Şimdi, bir sonraki denemeden önce hazırlığı 30 saniye dinlendirin. Duyarlı olmayan nöron olan ASH'de üç kamp geksprese eden solucanlar, bir molar gliserole ASH nöronu içindeki floresanda gözle görülür değişikliklerle yanıt verir, bu da nöral aktivitenin göstergesidir.
Nöron, tüm video için analiz alanında kalmalıdır, aksi takdirde bir hareket artefaktı oluşabilir. Bu durumda, bu zaman noktaları için analiz alanını taşıyın ve tek bir izleme oluşturmak için yoğunluk değerlerini birleştirin. Maruz kalma sırasında çekici biyojenik feromon ascaroside üç ile uyarılan erkekler, dört CEM nöronunda kalsiyum geçiciliği ölçüldü.
Hayvandan hayvana ve nörondan nörona, izler şekil, işaret ve büyüklük bakımından değişiyordu. Bu nedenle, feromon tepkilerini incelerken birçok hayvanı analiz etmek çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir erkek C elegans'ın mikro-akışkan bir cihaza nasıl yükleneceğini ve kafa nöronlarındaki kalsiyum geçişini nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Aynı işlem, nöral tepkilerdeki saniyeye özgü farklılıkları tanımlamak için hermafroditlerle de kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik görüntülenen ilk hayvan için yarım saat içinde yapılabilir. İlk kayıttan sonra, yaklaşık 10 dakika içinde görüntüye yeni bir hayvan yüklenebilir.
Bu prosedürü takiben, nöral devrelerin nasıl düzenlendiğini daha iyi anlamak için optogenetik gibi diğer yöntemler bu protokolle birleştirilebilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, gliserol ve feromonlara tepki olarak C. elegans erkeklerinin verimli kalsiyum görüntülemesine yönelik uyarlanmış bir "olfaktori çip"i açıklamaktadır. Bu yöntem, nörobiyolojide cinsiyet spesifik sinir devresi düzenlemesinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobiyoloji
- Kalsiyum Görüntüleme
- Davranışsal Analiz
Arka Plan
- C. elegans, nöronal fonksiyonu incelemek için önemli bir model organizma olarak hizmet etmektedir.
- Kalsiyum görüntüleme, sinir devrelerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesini sağlar.
- Uyaranlara cinsiyet spesifik tepkiler, sinir devresi dinamikleri hakkında içgörüler sağlar.
- Verimli tuzaklama teknikleri, canlı preparatların görüntüleme yeteneklerini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Erkek C. elegans kafa nöronlarında kalsiyum geçici dalgalanmalarını görüntülemek için bir teknik geliştirmek.
- Erkeklerin biyojenik feromonlara ve diğer uyaranlara nasıl tepki verdiğini keşfetmek.
- Cinsiyet spesifik sinir devrelerinin düzenlenmesi hakkında yeni bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- C. elegans'ın tuzağa düşürülmesi ve görüntülemesinde mikro-akışkan cihazı kullanılmıştır.
- Biyolojik model olarak erkek C. elegans üzerinde sinirsel tepkileri değerlendirmek için odaklanılmıştır.
- Nöronal aktiviteyi görselleştirmek için floresan protein kullanılarak kalsiyum görüntüleme yapılmıştır.
- Kritik adımlar arasında solucanların dikkatli yüklenmesi ve görüntüleme sırasında sıvı akışının kontrol edilmesi yer almıştır.
- Bu işlem, yeni hayvanların yaklaşık 10 dakika içinde görüntülemesine izin vermektedir.
Ana Sonuçlar
- Feromon maruziyetinde ASH nöronunda ve dört CEM nöronunda kalsiyum geçici dalgalanması gözlemlenmiştir.
- Tepkiler şekil ve büyüklükte değişkenlik göstermiştir, bu da sinirsel tepkiler arasında bireysel farklılıkların olduğunu göstermektedir.
- Bu yöntem, feromonlara sinir devresi tepkilerini anlamak için umut verici potansiyel göstermiştir.
- Hareket artefaktlarını en aza indirgemekle sinirsel aktivitenin görüntülemenin uygulanabilirliğini göstermiştir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, erkek C. elegans'ta nöronal aktivitenin gerçek zamanlı görüntülemesine yönelik bir yöntem kurmaktadır.
- Teknik, cinsiyet spesifik sinir mekanizmalarını araştırmak için uyarlanabilir.
- Bu yaklaşım, kimyasal uyaranlara nöronal tepkilerin ve bunların sinir devresi düzenlemesi için olan önemlerini anlamak için nöronal tepkilerin anlayışını geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This microfluidic olfactory chip enables efficient calcium imaging in male C. elegans, addressing a key gap in sex-specific neurobiology research. By allowing real-time imaging of neuronal responses to pheromones, the method supports mechanistic de-risking in target validation for neuroactive compounds. The approach provides predictive value in early discovery by clarifying sex-dimorphic neural circuit regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sex-specific neural circuits in response to pheromonal stimuli.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for trapping and imaging male C. elegans head neurons.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of sex-dimorphic mechanisms in neuroactive compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables standardized, quantitative calcium transient measurements in defined neuronal populations.
- Assay Readiness: Supports scalable imaging workflows with minimal movement artifacts after initial training.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase neural imaging to preclinical continuity via sex-specific biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in sex-specific neural responses to chemical stimuli.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by revealing variable response patterns across individuals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for neuroactive compounds requiring sex-specific efficacy profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of sex-specific neural circuit regulation through controlled pheromone exposure.
- Screening: Delivers assay-ready neuronal preparations with reproducible stimulus delivery and calcium readouts.
- Analytics: Enables quantitative analysis of calcium transients in ASH and CEM neurons using ImageJ for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by providing sex-stratified neural response data relevant to biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic platform for rapid turnover of male C. elegans imaging, reducing per-animal preparation time after initial training.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving sex-specific neural signaling mechanisms.
- Operational Value: Standardizes worm loading and imaging procedures, improving throughput and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing sex-dimorphic neural responses that may predict differential compound efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive compounds based on sex-specific neural activity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly, worm handling, and calcium imaging techniques.
- Depends on access to fluorescence microscopy, syringe pumps, and vacuum control systems for fluid regulation.
- Necessitates standardization across teams for consistent worm loading orientation and stimulus timing.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to hermaphrodites or other neuronal strains.
- Includes practical limitations such as variable pheromone response rates and initial learning curve for worm loading efficiency.
