Name: Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Öğrenin, yenidoğan ve erişkin fare derisinden primer keratinosit izolasyonu ve kültürü yöntemlerini. Bu teknik, epidermal biyoloji ve UVB yanıtlarını in vitro çalışmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma ULUSAL ARTRİT, MİSKÜLOKELETAL VE CİLT HASTALIKLARI ENSTİTÜSÜ (R01AR069653 - Zhang LJ) ve Ulusal Sağlık Destek Enstitüleri (5T32AR062496-03 - CA) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, UCSD Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Yenidoğan Cildinde Primer Fare KC İzolasyonu ve Kültürü <ol><li> C57B / 6 vahşi tipli fare suşundan post-doğum günündeki 0-2 yenidoğan makas kullanarak kesilerek kurban edin. Bilek ve ayak bileği eklemlerinin hemen üzerindeki kolları kesin, daha sonra kuyruk tamamen kesip küçük bir delik bırakın. </li><li> Tüm cildin soyulması için önce kuyruktaki delikten keskin bir makas takın ve cildinizi vücudun dorsal orta çizgisi boyunca boyundaki açıklığa kadar kesin. Daha sonra, cildi tutunacak şekilde maruz kalan cesedi ve diğer forsepsleri kavrayabilmek için bir forseps kullanın ve vücudun tüm cildi hafifçe soyun ve bir sürekli hareketle bacak kütükleri üzerinden soyun. <ol><li> Ciltten dokunulmamış bir parça olarak soyun ve cildi parçalara ayırmamaya özen gösterin, çünkü cilt soyulurken hücre kaybına neden olur. </li></ol></li> &lt;Li&gt; 10 cm&#39;lik bir Petri kabında 15 mL&#39;lik steril PBS ile soyulmuş cildi durulayın, daha sonra her bir yavrunun cildini, KC büyüme ortamında 4 mg / mL disperse içeren buz gibi soğuk sindirim tamponu ile doldurulmuş 2 mL tüp içine yerleştirin (KC bazal ortamı 0,06 mM CaCl2, DGS ve antibiyotikler / Antimikotiklerin vardır). NOT: Birden fazla deri izolatı kombine edilebilir ve 12 mL dispaz çözeltisi içeren bir 15 mL tüp içinde (tüp başına 5 deriye kadar) inkübe edilebilir. Cilt tüpünü, rotatorda 4 ° C&#39;lik bir buzdolabında gece boyunca inkübe edin. <ol><li> Katlanan bölgenin dispase solüsyonuna yeteri kadar maruz kalmayla sonuçlanacağı için tüpün içinde cildin katlanmadığından emin olun. </li></ol></li><li> Ertesi gün (disperse 12-18 saat sonra), cilt dispase solüsyonu ile bir Petri kabına aktarılır. Fazla disperi uzaklaştırmak için her doku parçasını 15 mL steril PBS ile yeni bir Petri kabına aktarın. </li><li> İki çift forseps kullanarak deriyi PBS&#39;den tutun,Cildi kaldırın ve yeni bir Petri kabına, epidermal tarafı aşağı ve dermis tarafı yukarı gelecek şekilde aktarın. Deri katlanmalarını dikkatli bir şekilde gerin böylece Petri kabında tamamen uzatın. </li><li> Yeni bir Petri kabındaki her cilt için tripsin bazlı sindirim solüsyonundan 500 μL yerleştirin. Cımbızı kullanarak epidermisi tutarken yavaşça dermikleri yukarı kaldırın ve epidermiden uzaklaştırın. Dermizi biyolojik tehlikeli madde olarak atın. Ayrılan epidermisi aktarın ve her damla tripsin solüsyonunda bazal tabaka aşağıya doğru yüzdürün. <ol><li> Epidermis, tripsin solüsyonu üzerine katlanırsa, bazal KC&#39;lerin epitelden etkili bir şekilde sindirilmesini sağlamak için forseps kullanarak herhangi bir kat yeri çıkarın. </li></ol></li><li> Cildini 20 dakika hafifçe çalkalayarak yatay bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında (kapak kapalıyken) tripsin solüsyonundaki bir Petri kabında inkübe edin. </li><li> Epidermis başına 2 mL eklenmiş KC büyüme ortamı ekleyin (başına yaklaşık 1 inç kare boyutuEpidermis) ekleyelim. Forseps kullanarak epidermis kavrayın ve epidermal sayfadan tek hücrelerin serbest bırakmak için şiddetle epidermis ileri ve geri sürtün. <ol><li> Hücreler epidermisden ayrıldıkça orta dönüşün giderek bulanık olduğunu izleyin. Kalan epidermal tabakayı çanakta bırakarak yeni bir tüpe hücre süspansiyonu toplamak ve aktarmak için Petri kabını eğin. </li></ol></li><li> 2 mL KC büyüme ortamı ilave edildikten sonra epidermal tabakanın sürtünmesini iki kat daha tekrarlayın ve hücre süspansiyonlarını aynı tüpe birleştirin. </li><li> Uygun serum serumu pipetini kullanarak herhangi bir hücre yığını kırmak için hücre solüsyonunu birkaç kez hafifçe birkaç kez pipetleyin, sonra yeni bir 50 mL&#39;lik santrifüj tüpüne 100 μm&#39;lik bir filtreden geçirin. </li><li> Filtrelenmiş hücreleri 5 dakika 180 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı aspire edin ve yavaşça 1 mL soğuk KC büyüme ortamı / epidermis hücre peletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Hücreleri bir hemositometre ile sayın. <br/&gt; NOT: KC&#39;ler spontan olarak süspansiyonda ayrım yapabilir, bu nedenle hücrelerin optimal performansını sağlamak için hücrelerin izolasyondan sonra en kısa sürede kaplanması gerekir. KC&#39;nin kendiliğinden farklılaşmasını azaltacağı için, sayım yaparken hücreleri buz üzerinde bırakmanızı öneririz. </li><li> Kültür tabaklarında KC büyüme ortamı içinde, 5 x 10 4 / cm2 &#39;lik bir yoğunlukta hücreler ana hücre eki teşvik eden bir hücre dışı matris (ECM) ürünü ile kaplı önceden. NOT: Bir ticari mevcut (örn., Jelatin bazlı bir kaplama malzemesi olan bağlanma faktörü kullanıyoruz (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreler nemlendirilmiş inkübatörde% 5 CO 2 ile 37 ° C&#39;de kültüre edildi ve taze ortam Her geçen gün yenilendi. <ol><li> Kaplama için kültür bulaşıkları, hücre tohumlamasından önce 10 dakika ila 2 saat süreyle oda sıcaklığına ısıtılmış hücre bağlama kaplama malzemesiyle kaplanır. Daha önce bağlanma faktörünü kaldırınHücre süspansiyonu ekleniyor. </li></ol></li><li> Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için ilk kaplamadan 24 saat sonra ortamı değiştirin ve deneyler öncesinde hücreler istenen konfluene erişene kadar ortamı her gün değiştirin. </li></ol> 2. Yetişkin Kuyruk Cildinden Primer Fare KC İzolasyonu <ol><li> Yetişkin bir C57BL / 6 fare (tercihen 6-15 hafta arasında yaş; erkek ya da dişi) hayvan tesis yönetmeliklerine göre kurban edilir. Kuyruk gövdesindeki kuyruğu kuyruk tabanı üzerinden kesin ve ucunda görünür bir delik olması için ~ 2 mm kuyruk ucunu kesin. </li><li> Kuyruk cildi soymak için öncelikle kuyruk derisini kaide ucundan kuyruk ucuna kesmek için keskin bir bıçak kullanın. Ardından, maruz kalan kuyruk kemiğini ve diğer forsepsleri kavramak için bir forseps kullanın ve hafifçe tek bir kesintisiz hareketle kemikten kuyruk cildi soyun. Soyulmuş cildi orta çizgiden kesin böylece her bir parça 2-3 cm&#39;den daha kısa olacaktır. </li><li> Soyulmuş deri zehirini yıkayınH 10 mL&#39;lik bir Petri kabında steril PBS&#39;nin 15 mL&#39;si, daha sonra her bir kuyruktan cildi buz soğuğu sindirim tamponu (KC büyüme ortamında 4 mg / mL dispaz) ile doldurulmuş 2 mL tüp içine yerleştirin. NOT: Birden fazla cilt parçası da birleştirilebilir ve 12 mL dispaz çözeltisi içeren bir adet 15 mL&#39;lik tüple (en fazla 5 kuyruk tüpü) inkübe edilebilir. <ol><li> Cilt tüpünü, rotatorda 4 ° C&#39;lik bir buzdolabında gece boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> Tek hücre süspansiyonunu kuyruk epidermisinden izole etmek için 1.4 ila 1.13 arasındaki adımları uygulayın. </li><li> 10 x 10 4 / cm2 yoğunluğunda yetişkin hücrelerinin tohum kültür tabaklarına kollajen ile önceden kaplanmış KC büyüme ortamı içinde (bir hematositometre ile sayılmıştır). NOT: Ticari olarak temin edilebilen bir kollajen bazlı kaplama kiti kullanırız (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreler, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatör içinde kültürlenmiştir ve taze ortam her gün doldurulan. Genel olarak, cUltura yemekleri, hücre ekiminden önce 30 dakika ila 1 saat boyunca kollajen ile kaplanmalıdır. Jelatin bazlı bir kaplama malzemesi olan bağlanma faktörüne kıyasla, kollajen ile kaplandığında kaba yetişkin KC bağlanmasının önemli bir artışının olduğunu gözlemliyoruz. </li><li> Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için ilk kaplamadan 24 saat sonra ortamı değiştirin ve deneyler öncesinde hücreler istenen konfluene erişene kadar ortamı her gün değiştirin. </li></ol> 3. Yüksek Kalsiyum ile KC&#39;lerin İn Vitro Farklılaşması <ol><li> Nihai değişimi etkilemek için, kültür ortamı içinde 0.2 mM CaCl2 ilave edin. </li><li> Alternatif olarak, yüksek kalsiyum ilavesinden önce düşük kalsiyum KC bazal ortamda eklenen büyüme takviyeleri olmadan kültürlü KC&#39;leri bir gece aç bırakın. NOT: Büyüme faktörü açlığı, erken farklılaşma için hücre taahhüdünü ve K10 gibi erken farklılaşma belirteçlerinin indüksiyonunu geliştirecektir 5 </&gt; Sup. </li></ol> 4. UVB Işınlaması Aracılı Hücre Ölümü ve KC&#39;lerden TNFa salınımı <ol><li> Hücreler konfluansa ulaşıncaya kadar günlük orta değişim ile KC büyüme ortamında fare KC&#39;leri (37 ° C&#39;de% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş inkübatörde) kültürleyin. UVB ışınlamasından hemen önce, büyüme ortamını çıkarın ve 500 μL PBS ile değiştirin. Daha sonra hücreleri 25 mJ / cm 2 UVB veya taklit kontrol uygulayın (UVB yok). Not: UVB ışınlaması daha önce tarif edildiği gibi 10, iki 8 W ampuller (312 nm) ile el UVB lambalar kullanılarak gerçekleştirilir. UVB ışınlamasından sonra, PBS aspire edilir ve taze ortam ilave edilir. </li><li> Ölçün ve 6, 8, CCK-8, hücre canlılığı deneyi ile hücre canlılığını ölçmek ve üreticinin talimatlarına 11 takip eden 24 saat sonra UVB tedavisi. </li><li> İstenilen zaman noktalarında UVB ile muamele edilen KC&#39;lerden şartlandırılmış ortamı toplayın ve salınan TNFa&#39;yı ölçünÜreticinin talimatına göre 7 , 12 numaralı fare TNF (Mono / Mono) ELISA kiti ile klimatize edilmiş ortamda. </li></ol>

<ol><li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2%2B+and+K%2B+gradients+in+murine+epidermis%3A+quantitative+measurement+using+PIXE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li>
<li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis%3A+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li>
<li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li>
<li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li>
<li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li>
<li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+3+Activation+Is+Required+for+Normal+Skin+Barrier+Repair+Following+UV+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+%28DPP4%29+in+primary+human+%28pre%29adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074(2016).</li>
<li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage-inducible+C-type+lectin%2C+mincle%2C+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li>
<li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li>
<li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li>
<li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15502164">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li>
<li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li>
<li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li>
<li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li>
<li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+cell+cycle+exit%2C+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes%3A+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li>
<li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+1.2+mmol%2Fl+calcium%2C+triamcinolone+acetonide%2C+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Cilt epidermisi vücudu dış ortamdan ayırmak ve korumak, su kaybı, patojenler, ısı ve UV ışınlarından hasar oluşturmak için kritik bir bariyer olarak işlev görür. KC&#39;ler epidermisin baskın hücre soylarıdır ve epidermal KC&#39;lerin birincil kültürü, bariyer oluşumunun biyolojik süreçlerini ve KC&#39;lerin in vitro ortamda hakaretlere tepkisini incelemek ve anlamak için yararlı bir araçtır. Burada neonatal ve erişkin fare derisinden birincil epidermal KC&#39;leri izole etme ve kül...

Cilt, vücudun en büyük organıdır ve dış tabaka olarak epidermisdir. Epidermis, vücudu çevreden ayırmak için sağlam bir epidermal bariyer oluşturmada kritik bir rol oynar ve böylece su kaybını önler ve alerjen, patojen ve UVB maruziyeti gibi çevresel hasarlardan korunma sağlar. Epidermis, farklılaşmamış bazal keratinositlerden (KCs) oluşan tek bir katmandan, bazal tabaka, bunu takiben bir östrus tabakası, granüler tabaka ve stratum corneum&#39;dan oluşan çok tabakalı bir tabakalı epitele dönüşür. Hem epidermal kök hücrelerden hem de transit amplifikatör hücrelerden oluşan bazal KC&#39;ler proliferatif ve farklılaşmamıştır. Bazal KC&#39;ler hücre döngüsünden çıkarken hücreler farklılaşmaya çalışırlar ve hücre-hücre kavşaklarının olgunlaşması ve bir epidermal geçirgenlik bariyeri (EPB) oluşumu eşliğinde epidermisin yüzeyine doğru giderek yer değiştirirler. Eğik tabakadaki KC&#39;ler, erken diferansiyasyonu ifade ederIyon belirteçleri, örneğin Keratin 10 (K10); KC&#39;ler granül tabakaya göç ederken, hücreler Filaggrin (FLG), Lorikrin (LOR) ve Involucrin (INV) gibi geç farklılaşma belirteçlerini ekspres eder. Stratum corneum&#39;da, KC&#39;ler terminal olarak diferensiye edilmiş korneositler haline gelir ve bunlar, sonunda yeni hücreler yerine geçtikten sonra süsleme yoluyla dökülür. Kalsiyum, epidermisin en fizyolojik ajanı olarak düşünülür ve benzer şekilde in vitro ve in vivo farklılaşmaları tetikler. Normal deri epidermisinde, kalsiyum iyonları karakteristik bir &quot;konsantrasyon gradyanı&quot; oluşturur ve konsantrasyonda deri yüzeyine doğru artar 1 , 2 , 3 . Kalsiyum konsantrasyonu, en alttaki tabakalardan (bazal ve spinöz katmanlar) düşük seviyelerden üst granüler katmandaki bir tepeye yükselir ve en yüzeysel katmanda (stratum corneum) ihmal edilebilir seviyelere düşer.<html> Kalsiyum degradasyonu, aynı zamanda, kalsiyum sinyallemesinin KC diferansiyasyonunda kritik bir rol oynadığını destekleyen bir bileşen geçirgenlik bariyerinin ortaya çıkması ile çakışarak gelişir. İn vitro düşük kalsiyum (0.02-0.1 mM) bazal KC&#39;lerin tek tabaka halinde çoğalmasını sağlarken, yüksek kalsiyum (&gt; 0.1 mM), hücrelerin terminal birleşimine hızlı ve geri döndürülemez bir taahhütte bulunur, bu da sıkı birleşim oluşumu ve indüksiyon ile gösterilir LOR ve INV&#39;nin bazal KC 4 , 5&#39;e yüksek kalsiyum muamelesi üzerine uygulanması. Bariyer oluşumuna ek olarak, epidermal KCler de cildin doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir bileşenidir. UVB ışınlaması veya yaralanması üzerine salınan patojenlere veya hasar görmüş moleküler kalıplara (DAMP&#39;ler) yanıt olarak, KCs TNFa, IL6 ve IFNβ gibi inflamatuar sitokinleri büyük miktarda üreterek immün sistem aktivasyonuna yol açabilir&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . KC&#39;lerden uygun iltihap sinyali patojen temizlemesi için gerekli olmakla birlikte, kontrol edilemeyen inflamatuar yanıt, sedef hastalığı ve rosacea 6 , 8 gibi oto-inflamatuar cilt hastalıklarının gelişimini tetikleyebilir. Genel olarak, KCler bozulmamış cilt bariyerini korumada ve patojen istilasına veya çevresel hakaretlere karşı bir bağışıklık tepkisi başlatmada hayati bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, epidermal KC&#39;lerin birincil kültürü, epitel biyolojisini, KC farklılaşmasını ve ayrıca KC uyarılı doğal immün yanıtları incelemek için yararlı bir tekniktir. Primer fare epidermal KC&#39;lerin izolasyonu ve kültürü, KC&#39;nin çeşitli harici uyarıcılara duyarlılığı ve hassasiyeti nedeniyle zor bir süreç olabilir. Burada, yenidoğan fare derisinden KC&#39;leri izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem anlatılmaktadır.Yetişkin fare kuyruğu cildi. Yetişkin KC izolasyonu için, fare dorsal deri kullanmıyoruz, çünkü bu dokudan yeterli miktarda canlı KC&#39;lerin izole edilmesi aşağıdaki nedenlerle zor olabilir: Birincisi, saç döngüsünün (telogen) dinlenme fazındaki yetişkin dorsal deri, Sadece 1-2 kat hücreli ince epidermis, düşük hücre verimi ve epidermisin dermisden ayrılmasına neden olur ki bu başarılı KC izolasyon için kritik adımdır. İkincisi, yetişkin dorsal deri üzerinde bulunan yüksek kıl follikülü yoğunluğu, epidermisin dermisden ayrılma zorluğuna daha fazla katkıda bulunur. Bunun yerine, yetişkin fare KC&#39;leri için kuyruk derisini rutin olarak kullanırız, çünkü bu epitel 3-5 epidermal KC tabakasıyla daha kalıntır. Ayrıca epidermal ayrılmaya müdahale etmeyen daha düşük bir saç follikülü yoğunluğu vardır, böylece fare yaşına ve saç döngüsüne bakılmaksızın yetişkin fare kuyruk derisinden KC izolasyonuna izin verir. İzole edilmiş neonaTal KC&#39;ler, jelatin kaplı kültür bulaşıkları üzerine ekilirken kolajen kaplı bulaşıklar yetişkin hücrelerin yenidoğan muadillerine kıyasla zayıf kalma yeteneklerinden dolayı izole yetişkin KC&#39;leri tohumlamak için kullanılır. Kültür fare KC&#39;lerine düşük kalsiyum bazal ortam, epidermal büyüme faktörü (EGF), sığır transferini, insülin benzeri büyüme faktörü (IGF1), prostaglandin E2 (PGE2), sığır serum albümini (BSA) ve hidrokortizon içeren dGS ile takviye edilmiştir. İlk kaplamadan 2-4 gün sonra, farklılaşmış KC&#39;lerin çoğu, günlük orta değişimler sırasında yıkanabilir ve kalan yapışık hücreler, tipik Arnavut kaldırımı morfolojisi 4 gösterir , çoğalmakta ve erken farklılaşma markörü K10&#39;u ifade etmemektedir.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6 yenidoğanlar veya yetişkin vahşi tip fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td>Yabani tip fareler (başlangıçta Jackson Laboratuvarı'ndan satın alınmıştır) UCSD'deki hayvan vivaryumunda yetiştirilir ve bakımı yapılır.</td></tr><tr><td>KC bazal ortamı (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td>0.06 mM CaCl ile keratinosit kültürü için MEPICF500 bazal < CaCl sub > 2 </td></tr> <tr><td>Tanımlanmış Büyüme Takviyesi (dGS)</td> <td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td> Kültür <td>ortamı için tanımlanmış büyüme</td><td>takviyeleri</td></tr><tr><td>Epidermisi dermisten</td><td></td><td></td><td></td> ayırmak için toz Invitrogen, Carlsbad, CA 17105041 enzimi dispas edin</tr><tr><td>Ek Faktörü</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>jelatin bazlı kaplama malzemesi</td></tr><tr><td>Kaplama Matrisi</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>Kollajen bazlı kaplama malzemesi</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>Keratinositleri epidermal tabaka 100 & mu'dan ayırmak için hafif bir tripsin benzeri enzim</td></tr><tr><td>; m Hücre Süzgeci Naylon örgü</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 hücre canlılığı Kiti</td><td>Dojindo Moleküler Teknolojiler, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Fare TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>Kablolu El Tipi UV Lambaları</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>8 watt UV tüpleri</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü için Işığı Ters Çeviren Mikroskop</td><td>ZEISS, Jena, Almanya</td><td>Axio Gözlemci</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

yenidoğan ve erişkin fare ciltlerindeki primer fare keratinositlerin İzolasyonu ve kültürü

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Keratinosit (KC), cildin en dış tabakası olan epidermisdeki baskın hücre türüdür. Epidermal KCler, UVB ışınlaması veya patojenler gibi çevresel hasarlara karşı bozulmamış bir cilt bariyeri oluşturarak cilt savunmasını sağlamada ve ayrıca bu hakaretlere karşı iltihaplı bir tepki başlatarak kritik bir rol oynamaktadır. Burada, yenidoğan fare derisinden ve erişkin fare kuyruğu derisinden KC&#39;leri izole etme yöntemlerini açıklıyoruz. Ayrıca, tanımlanmış büyüme takviyeleri (dGS) kullanarak, çoğaltılmış fetüs sığır serumu (cFBS) ile kültür koşullarını tarif ederiz. İşlevsel olarak, hem yenidoğan hem de erişkin KC&#39;lerin yüksek kalsiyumun indüklediği terminal farklılaşması, sıkı birleşim oluşumu ve tabakalaşmaya son derece tepkisel olduğunu göstermektedir. Ek olarak, kültürlenmiş yetişkin KC&#39;ler UVB ile tetiklenen hücre ölümüne duyarlıdır ve UVB ışınlaması üzerine büyük miktarda TNF salabilirler. Birlikte, burada açıklanan yöntemler araştırmacılar için in vitro model kurulumu için yararlı olacaktırYenidoğan fare ve / veya yetişkin fare epidermal biyoloji incelemek için.

Yenidoğanın ve erişkin KC&#39;lerin yüksek kalsiyum indükte terminal farklılaşması. KCs kaplanmıştır ve 0.06 mM CaCl2 muhafaza primer fare, epidermal bir tek tabaka olarak büyüdü ve tek tek hücreler bir kaldırım taşı görünümünü gösteren, farklı hücre içi alana sahip çok kenarlı bir şekle sahiptir zaman konfluent (Şekil 1A ve Şekil 2A). CaCl2 0.2 mm kaldırma hücrelerinin hızlı morfoloji deği...

Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Bu prosedürün genel amacı, neonatal veya yetişkin fare derisinden primer fare keratinositlerini izole ederek bunları in-vitro farklılaşma çalışmalarında kullanmak veya UVb maruziyetine karşı verdikleri doğal bağışıklık yanıtlarını incelemektir. Bu yöntem, epidermal biyoloji alanında keratinosit farklılaşmasının nasıl düzenlendiği veya epidermal keratinositlerin dış uyaranlara nasıl yanıt verdiği hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, keratinositlerin hem neonatal hem de yetişkin fare derisinden geleneksel yöntemlerle izole edilebilmesi ve serumsuz olarak kültüre edilebilmeleridir.Prosedürü benimle birlikte laboratuvarımdan araştırma görevlisi Fengwu Li uygulamalı olarak gösterecek. İşleme, yaban tipi C57 BL6 postnatal sıfır ila iki günlük bir fare neonatının uzuvlarını el bileği eklemlerinin hemen üzerinden çıkararak ve kuyruğu küçük bir parça kalacak şekilde tamamen keserek başlayın. Sivri uçlu makası kuyruk deliğinden içeri sokun ve vücudun dorsal orta hattı boyunca boyundaki açıklığa kadar deriyi kesin.Bir pensle açığa çıkan gövdeyi, diğer bir pensle ise deriyi tutun. Ardından, derinin parçalanmamasına dikkat ederek, tüm deriy

isolation-culture-primary-mouse-keratinocytes-from-neonatal-adult

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Insan derisi canlı yetişkin epitelyal kök hücreleri izole bir hızlı, sağlam bir şekilde açıklanmıştır. Bu yöntem cilt kollajen matriks enzimatik sindirim, saç folikülleri ve hücre kültürü için, tek bir hücre süspansiyonları ya da doku parçalarının izolasyonu koparma kullanır.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

Bu videoda, insan derisinin epidermal tabakasının en belirgin hücreleri olan keratinositlerin, enzimatik sindirim ve mekanik bozma yöntemlerinin bir kombinasyonu kullanılarak izolasyonu anlatılmaktadır. Bu yöntem, seçici bir büyüme ortamı kullanarak keratinositlerin diğer cilt hücresi tiplerine göre tercihli büyümesine yardımcı olur.

İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model...

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Bu protokolün amacı, moleküler biyoloji, biyokimya, floresan aktif hücre ayrıştırma ve primer in vitro kullanımlar (örneğin, klojenojenik) gibi çeşitli downstream uygulamaları için yetişkin farelerin dorsal deriden epidermal keratinositleri izole etmektir. keratinositler).

Fare Epidermal Keratinositlerin İzolasyon ve In Vitro Klojenik Kültür

Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, canlı hücre görüntülemede kullanılmak üzere taze elde edilen (pasaj 0) keratinositlerin kültürünü ana hatlarıyla belirtir.

Keratinosit Canlı Hücre Görüntüleme için Primer Kültürlerin Oluşturulması

Burada, fare stria vascularis'ten birincil marjinal hücrelerin izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için bir protokol sunuyoruz ve koklear yan duvar bozukluklarını incelemek için oksidatif stres ve hücresel yaşlanma için in vitro modeller oluşturulmuştur.

Stria vascularis'in Primer Marjinal Hücrelerinin Yenidoğan Farelerden İzolyasyonu ve Kültürü

Öğrenin, yenidoğan ve erişkin fare derisinden primer keratinosit izolasyonu ve kültürü yöntemlerini. Bu teknik, epidermal biyoloji ve UVB yanıtlarını in vitro çalışmak için kullanılır.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Daha fazla video keşfet