Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Bu prosedürün genel amacı, birincil fare keratinositlerini yenidoğan veya yetişkin fare derisinden in vitro farklılaşmalarından izole etmek veya UVb maruziyetine karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini incelemektir. Bu yöntem, epidermal biyoloji alanında keratinosit farklılaşmasının nasıl düzenlendiği veya epidermal keratinositlerin dış uyaranlara nasıl tepki verdiği ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, keratinositlerin geleneksel olarak hem fare, hem yenidoğan hem de yetişkin fare derisinden izole edilebilmesi ve serumumuzla kültürlenebilmesidir.

Prosedürü benimle birlikte göstermek, laboratuvarımdan bir personel araştırma görevlisi olan Fengwu Li olacak. Vahşi bir tip C57 BL6 doğum sonrası sıfır ila iki fare yenidoğanın uzuvlarını, bileğin dolaşık eklemlerinin hemen üzerinde çıkararak başlayın ve kuyruğu tamamen kesin ve küçük bir top bırakın. Kuyruk deliğinden keskin bir makas sokun ve cildi vücudun dorsal orta hattı boyunca boyundaki açıklığa kadar kesin.

Bir forseps kullanarak, açıkta kalan vücudu kavrayın ve cildi kavramak için başka bir forseps kullanın. Daha sonra, cildi parçalara ayırmamaya dikkat ederek, tüm cildi vücuttan ve bacak kütüklerinin üzerinden sürekli bir hareketle nazikçe soyun. Soyulmuş cildi 10 santimetrelik bir petri kabında 50 milimetre steril PBS ile durulayın ve cildi buz gibi soğuk içeren iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin, sindirim tamponunu boşaltın, cildin katlanmamasına dikkat edin.

Tüm yenidoğan cilt tabakaları toplandığında, tüpü gece boyunca dört santigrat derecede bir döndürücüye yerleştirin. Ertesi sabah, tüp içeriğini yeni bir petri kabına dağıtın. Daha sonra, fazla dispasyonu gidermek için her bir doku parçasını 50 mililitre steril PBS içeren yeni bir petri kabına aktarın.

İki forseps kullanın, cilt örneklerini epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde ayrı petri kaplarına yerleştirin ve cilt kıvrımlarını, parçalar tabak tabanlarında tamamen uzayacak şekilde dikkatlice gerin. Her yemeğe 500 mikrolitre tripsin bazlı bir sindirim solüsyonu ekleyin ve epidermisi ikinci bir forseps ile yerinde tutarken, her dermisi epidermisten yavaşça yukarı ve uzağa kaldırmak için bir forseps kullanın. İzole edilmiş epidermisleri tripsin çözeltisi içinde, bazal seviyeler aşağı bakacak şekilde yüzdürün ve bulaşıkları örtün.

Daha sonra deri parçalarını oda sıcaklığında yatay bir çalkalayıcı üzerinde 20 dakika boyunca hafif çalkalayarak inkübe edin. Kuluçka süresinin sonunda, her bir petri kabına epidermis başına iki mililitre takviye edilmiş keratinosit büyüme ortamı ekleyin ve epidermal tabakaları kuvvetlice ovalamak için forseps kullanın ve tek hücreleri cilt dokusundan serbest bırakın. Ortam bulanıklaştığında, hücre süspansiyonlarının toplanmasına ve yeni bir tüpe aktarılmasına izin vermek için bulaşıkları eğin.

Kalan epidermal dokuyu tabakta bırakmak. Üçüncü hücre toplama turundan sonra, herhangi bir hücre kümesini parçalamak için havuzlanmış hücre süspansiyonunu birkaç kez nazikçe ezin ve hücreleri 100 mikronluk bir süzgeçten yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe süzün. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve saymak için peleti bir mililitre soğuk keratinosit büyüme ortamında buz üzerinde nazikçe yeniden süspanse edin.

Hücreleri, hücre bağlanmasını destekleyen ekstra hücresel bir matris ürünü ile önceden kaplanmış kültürlenmiş kaplarda keratinosit büyüme ortamında 5x10 ila dördüncü santimetre kare yoğunlukta tohumlayın. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin, hücreler uygun birleşmeye ulaşana kadar süpernatanı günlük olarak taze ortamla değiştirin. Keratinositleri yetişkin bir fareden izole etmek için önce kuyruğunu tabanından çıkarın.

Ardından kuyruk ucunun yaklaşık iki milimetresi çıkarılır, böylece görünür bir delik vardır. Kuyruk derisini tabandan uca kadar kesmek için keskin bir bıçak kullanın. Ardından, açıkta kalan kuyruk kemiğini kavramak için bir forseps ve cildi kavramak için başka bir forseps kullanarak, cilt dokusunu kemikten tek bir sürekli hareketle nazikçe soyun.

Soyulmuş cildi orta hatta kesin, böylece her bir parça iki ila üç santimetreden daha kısa olur ve parçaları 10 santimetrelik bir petri kabında 15 mililitre steril PBS'de durulayın. Derileri en fazla beş kuyruktan 12 mililitreye kadar buz gibi soğuk içeren 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin, sindirim tamponunu boşaltın ve derileri gece boyunca dört santigrat derecede rotasyonla inkübe edin. Ertesi sabah, epidermal hücreleri, yenidoğan cilt örneklerinde gösterildiği gibi, kısmen sindirilmiş cilt tabakalarından izole edin.

Daha sonra, izole edilmiş yetişkin keratinosit hücrelerini, kollajen ile önceden kaplanmış kültür kaplarında kerationsit büyüme ortamında 1x10 kuvvet santimetre kare yoğunluğa kadar tohumlayın. Hücreler uygun birleşmeye ulaşana kadar süpernatanı günlük olarak değiştirmek. Her iki tip keratinosit kültürünün terminal farklılaşmasını indüklemek için, hücreler için 2 nanomolar konsantrasyonda kalsiyum klorür ekleyin.

UVb ışınlamasına bağlı ölüm için, büyüme ortamını birleşik bir keratinosit kültüründen 500 mikrolitre PBS ile değiştirin ve hücreleri kısaca UVb'nin santimetre karesi başına 15 milijoule'ye maruz bırakın. PBS'yi taze büyüme ortamı ile değiştirin ve hücreleri altı saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Her deneysel zaman noktasında şartlandırılmış ortamı topladıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre hücre sayma kiti yardımcı canlılık testi ile hücre canlılığını ölçün.

Daha sonra, ışınlanmış keratinositler tarafından standart protokollere göre şartlandırılmış ortama salınması için TNL'yi ölçün. Birincil modun epidermal keratinositleri, 06 nanomolar kalsiyum klorürde kaplanmış ve muhafaza edilmiş, tek tek hücrelerin farklı hücreler arası boşluklara sahip poligonal bir şekil sergilediği ve birleştiğinde genel bir parke taşı görünümü gösterdiği bir tek tabaka olarak büyümüştür. Kalsiyum klorürün 2 milimolara yükseltilmesi, hücrelerde hızlı bir morfoloji değişikliğine neden olur.

Hücrelerin düzleşmesi ve farklı hücreler arası boşluğun sekiz saat içinde daha az belirgin hale gelmesiyle. Ve sıkı bağlantılar arasındaki hücreden hücreye yapışma 24 saat içinde daha çarpıcı hale gelir. 48 ila 72 saat arasında, kornifiye hücre zarfının oluşumu ve dikey hücre tabakalaşması belirginleşir.

Yüksek kalsiyumla muamele edilmiş keratinositlerin falloidin boyaması, kalsiyum değişiminden üç saat sonra bitişik hücreler arasında aktin lifi açısından zengin filopodial çıkıntıların oluşumunu ortaya çıkarır. Altı ila 24 saat arasında, daha fazla aktin lifi yeniden şekillenmesi belirginleşir. Yüksek kalsiyum maruziyetinden 48 saat sonra belirgin miktarda hücre tabakalaşması ile.

UVb ışınlaması, hem faz kontrast görüntüleme hem de hücre canlılığı testi ile kanıtlandığı gibi, keratinosit kültürlerinin zamana bağlı hücre ölümünü tetikler. Gerçekten de, 24 saat içinde, neredeyse tüm hücreler yuvarlaklaşır ve ayrılır ve hücre canlılığı tahlili ile yaşayamaz olarak ölçülür. Büyük olasılıkla, UVb maruziyetine yanıt olarak keratinositler tarafından hafifletilen yüksek TNF alfa seviyeleri nedeniyle.

Bu prosedürü denerken, ayrışmış keratinositi her zaman buz üzerinde tutmanın ve izole edilen hücrelerin terminal farklılaşmasını önlemek için hücreleri mümkün olan en kısa sürede plakalamanın önemli olduğunu hatırlamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, epidermal biyoloji alanındaki araştırmacıların, keratinositlerin cilt gelişimindeki ve cildin doğuştan gelen bağışıklık savunmasındaki rollerini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, birincil epidermal keratinositlerin yenidoğan veya yetişkin fare derisinden nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız.