Name: Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Öğrenin, yatay jel elektroforezi ile RNA-protein etkileşimlerini analiz etmeyi. Bu yöntem, elektroforez sırasında kompleks oluşumunu gerçek zamanlı izlemenizi sağlar ve RNA biyokimyası çalışmalarında 48 örneği aynı anda değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rakamlar hazırladığımız için Laura Vanderploeg&#39;e teşekkür ediyoruz. E-Tablolar laboratuarı çalışması, NSF hibe 1050395 ve NIH hibe (R21HD076828) tarafından desteklenmektedir. Ryder laboratuarı NIH hibe R01GM117237 ve R01GM117008 tarafından desteklenmektedir. Megan Dowdle, National Institutes of Health&#39;in Ulusal Tıbbı Bilimler Ulusal Enstitüsü (T32GM008349) aracılığıyla Wisconsin-Madison Enstitüsü ve Biyoteknoloji Eğitim Programı aracılığıyla SciMed GRS İleri Fırsat Fellowitesi tarafından desteklenmektedir.

1. Yatay Native Poliakrilamid Jelin Hazırlanması 4 . <ol><li> Gerekli malzemelerin hazırlanması. <ol><li> Yatay jel aparatı için 27 cm x 21 cm&#39;lik bir tepsi ve iki adet 24 kuyucuklu tarak için bir jel kutusu (37 cm x 24 cm) kullanın. Bu kurulum, aynı anda analiz edilebilecek toplam 48 örnek sağlar. </li><li> Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:% 40 Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8.0), TEMED ve% 10 APS (amonyum persülfat). </li></ol></li><li> % 10 yerli akrilamid jelinin üretilmesi. <ol><li> 500 mL&#39;lik bir şişe içerisinde 80 mL 5x TBE, 100 mL% 40 akrilamid ve su 400 mL&#39;lik bir son hacme ilave edin. </li><li> 4 mL% 10 APS ve 400 μL TEMED ekleyin. İyice karıştırın. </li><li> Karışımı yatay döküm tepsisine dökün ve jelin 30 dakika boyunca polimerleşmesine izin verin. Jel yaklaşık 2 cm kalınlığında olacaktır. NOT: Jel hızlandırmak için bir duman kabına dökebilirUp polimerizasyon. Polimerizasyondan sonra, ince bir tabaka sıvı jelin üzerinde kalacaktır. </li><li> Sıvıyı boşaltın ve akan tamponla durulayın. Tarakları dikkatlice çıkarın ve bir şırınga kullanarak oyuklu tamponla oyukları durulayın. </li></ol></li><li> Çalışan tamponun hazırlanması. <ol><li> Jel kutusu için 2 L 1x TBE akış tamponu hazırlayın. 400 mL 5XTBE&#39;yi 1600 mL ile inceltin ve karıştırın. Soğuk olması için 1x TBE tamponu soğuk odaya yerleştirin. </li></ol></li><li> Jeli önceden çalıştırma <ol><li> Jel kutusuna 2 L soğuk çalıştıran tampon ekleyin ve jeli takın. </li><li> Jeli, soğuk bir odada 4 ° C&#39;de 1 saat 120 V&#39;de önceden çalıştırın. Bu süre zarfında, bağlanma reaksiyonunu hazırlayın. </li></ol></li></ol> 2. Bağlama Tepkisi 8 <ol><li> 2.1.Aşağıdaki reaksiyon bileşenlerini hazırlayın. 20 mM DTT 10 mM BSA 10 mM maya tRNA&#39;ları 5X bağlama tamponu (50 mM HEPES pH 8.0, 5 mM EDTA, 250 mM KCI,% 0.2 Tween-20) Ticari olarak satın alınan 100 nM floresan etiketli RNA Konsantre Bikioz-C proteini DEPC ile muamele edilmiş, H2O içinde% 50 gliserol DEPC ile muamele edilmiş H2O </li><li> Bağlanma reaksiyon bileşenlerini bir RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpünde bir araya getirin. <ol><li> Tüp için, 10 mM BSA 5 mcL, 20 mM DTT 5 mcL, 10 mM maya tRNA&#39;lar 5 mcL, 5 x Cilt Tamponu 10 mcL ekleyin. </li></ol></li><li> 50 uL&#39;de 250 nM son konsantrasyona protein ekleyin. 45 μL&#39;lik nihai bir hacme su ilave edin. </li><li> 5 μL floresanla işaretlenmiş RNA substratı ekleyin. Ticari olarak satın alınan bir 3 &#39;fluorescein etiketli 32-nukleotid substrat kullanın. </li><li> Karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li></ol> 3. Yerli Yatay Poliakrilamid Jelinde Numunelerin Analizi <ol><li> Her tepkime için, 15 μL% 50 gliserol ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> dikkatli bir şekildJellere her reaksiyondan 30 μL ekleyin. Tek bir oyuğa yüklenebilecek numune miktarı, jelin kalınlığına ve oyukların boyutuna bağlı olarak değişir. 24-kuyucuklu bir tarakla yaratılan ve 2 cm&#39;lik bir kalınlığa dökülen tek bir jel jeline 15 μL kadar ve 45 μL kadar hacim yükledik. </li><li> Gç kaynağını jel aparatına bağladıktan sonra güç kaynağını açın ve voltajı ayarlayın. Jel 4 ° C&#39;de 120 V&#39;de çalıştırın. NOT: Yatay jel aparatı için yaklaşık 5 V / cm kalır. Dikey jel aparatı için, bu 16 V / cm&#39;dir. <ol><li> Floresanla işaretlenmiş RNA&#39;nın hasar görmesini veya ağartılmasını önlemek için karanlıkta elektroforez yapın. </li><li> Analiz edilen RNA-protein kompleksinin özelliklerine bağlı olarak değişen elektroforez zamanı. NOT: Yatay EMSA analizinin önemli bir avantajı, elektroforezin durdurulabileceği, jelin görüntülendiği ve daha sonra daCihaza tekrar yerleştirilebilir ve elektroforez daha uzun süre devam edebilir. </li></ol></li></ol> 4. Jel Görüntüleme <ol><li> Floresan yüzeyler algılama ve görüntüleme için tasarlanmış herhangi bir enstrüman ile analiz yapın. </li><li> Jeli görüntüleyiciye yerleştirin. </li><li> Görüntüleyici ayarlarını yapın. Floresein etiketli RNA ligandları için aşağıdaki ayarları kullanın: FAM (dalga boyu 473 nm), 750 Fotomultiplier voltaj (PMT), 100 μm piksel boyutu. </li><li> Görüntü yakalamak için jel tarayın. </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yerli poliakrilamid jelleri, protein-RNA etkileşimlerini araştırmak için paha biçilemez bir araçtır ve geleneksel olarak bu jeller dikey olarak 2 , 3 elektroforez edilir. Doğal poliakrilamid jelleri oluşturan ve yatay olarak elektroforez edilen 1 , 4 , 6 , 7 , 15&#39;in yerini alan bir protokol değişi...

Elektroforetik mobilite kayma testleri (EMSA&#39;lar), spesifik protein-nükleik asit etkileşimleri 1 , 2 , 3&#39;ü analiz etmek için paha biçilemez bir biyokimyasal araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu tahliller, proteinlerin RNA veya DNA 3&#39;e bağlanma afinitesi hakkında önemli bilgi sağlayabilir ve nükleik asit-protein komplekslerinin 1 bileşen stokiyometrisi 1 ve substrat rekabet deneyleri 1 yoluyla RNA bağlama proteinlerinin bağlanma spesifitesi hakkında önemli yeni bilgiler sağlar 1 . Bu deneyler için geleneksel deney düzeneği, saflaştırılmış proteinin radyo-etiketli bir RNA substratı ile karıştırılmasından oluşur. Ortaya çıkan kompleksler daha sonra iki cam levha arasına dökülen denatüre edici olmayan (doğal) poliakrilamid jeller ile, ardından dikey bir cihazda 3 numune elektroforeziyle analiz edilir. Bu yaklaşım, proteinlerin nükleik asitlere bağlanmasının temelini oluşturan biyokimyasal mekanizmalarda önemli bilgiler sağlamak için kapsamlı bir şekilde kullanılmış olmakla birlikte, çeşitli sınırlamaları da vardır. Örneğin, bu temel strateji nispeten düşük işlem hacmine sahiptir ve birçok bağlama reaksiyonunu paralel olarak analiz etmeyi gerektiren uygulamalar için kolayca uyarlanamaz. Buna ek olarak, geleneksel dikey aparat ile elektroforez 3 , 4 sırasında kompleksleri birden çok kez potansiyel olarak izlemek zor. Burada, düz yataklı bir aparatta, yatay elektroforezde ve floresanla etiketlenmiş RNA substratları 4 , 5 , 6 , 7&#39;de yerli poliakrilamid jelleri kullanan EMSA tahlilinin uyarlamasını sunuyoruz. Bu nispeten basit değişikliklerin temel samana dahil edilmesiTegy bazı güçlü avantajlar sağlar. Özellikle yatay masaüstü biçimi, düzinelerce numuneyi eşzamanlı olarak analiz etmeye yardımcı olur 4 . Ayrıca, Bicaudal-C proteini ile RNA substratı arasında oluşan RNA-protein kompleksleri için, yatay bir jelde elektroforez farklı RNA-protein komplekslerini çözmek ve bağlanmamış RNA substrattan ayırmak için artan bir yeteneğe sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Yatay Jel Kutusu</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Ürün artık üretilmiyor. Benzer jel kutuları Thermo Scientific, A serisi jel kutularında da bulunabilir. Katalog Numarası: A2-BP</td></tr><tr><td>24 kuyulu büyük büyük yatay jel elektroforez tarakları</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Ürün artık üretilmiyor. Benzer jel kutuları Thermo Scientific, A serisi jel kutu taraklarında da bulunabilir. Katalog Numarası: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II Elektroforez Hücresi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 %40 19:1 Akrilamid/Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>Maya tRNA'ları</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>Floresein etiketli RNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Sipariş, uzunluk ve istenen sıraya göre özel olarak yapılabilir</td></tr><tr><td>EDTA tetrasodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Baz Ultra Saf</td><td>ABD Biyolojik</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>3483 12 3 Sığır</td><td></td></tr><tr><td>Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-rna komplekslerinin geliştirilmiş algılaması için yatay jel elektroforezi

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Yerli poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerinin biyokimyasal analizi için kapsamlı bir şekilde kullanılan moleküler biyolojinin temel bir araçtır. Bu etkileşimler geleneksel olarak iki cam levha arasında üretilen poliakrilamid jelleri ve numuneler dikey olarak elektroforez ile analiz edilmiştir. Bununla birlikte, tepsilerde dökülen ve yatay olarak elektroforez edilen poliakrilamid jeller çeşitli avantajlar sunmaktadır. Örneğin, flüoresans RNA substratları ve spesifik proteinler arasındaki kompleksleri analiz etmek için kullanılan yatay jeller, elektroforez ilerledikçe birçok kez görüntülene edilebilir. Bu, deney sırasında RNA-protein komplekslerini çeşitli noktalarda izlemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Buna ek olarak, yatay jel elektroforezi birçok numuneyi paralel olarak analiz etmeyi mümkün kılar. Bu, farklı bileşenleri ve koşulları karşılaştırmak için zamanlama deneylerini büyük ölçüde kolaylaştırabilir ve aynı anda birden fazla reaksiyonu analiz edebilir. İşte biz prRNA-Protein etkileşimlerini analiz etmek için yatay doğal jel elektroforezi üretmek ve kullanmak için ayrıntılı bir protokolü inceleyin.

Yatay doğal jel elektroforezinin gücü ve çok yönlülüğünü göstermek için Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) proteininin bir Bicc1 bağlanma yeri içeren floresanla işaretlenmiş bir RNA&#39;ya bağlandığını analiz ettik. Bicc1 proteinleri, hayvanlarda gelişme 9 , 10 , 11 , 12&#39;nin maternal evreleri boyunca hücre akıbeti kararlarını kontrol etmek için mRNA&#39;ya...

Doğal poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için temel bir araçtır. Geleneksel olarak çoğu deney dikey jel kullanmıştır. Bununla birlikte, yatay jeller elektroforez sırasında kompleksleri izleme fırsatı gibi birçok avantaj sağlar. Yatay doğal jel elektroforezinin üretilmesi ve kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

Bu protokolün genel amacı, yatay doğal jel elektroforezi kullanarak RNA protein etkileşimlerini analiz etmektir. Bu yöntem, belirli RNA protein etkileşimlerinin özelliklerinin tanımlanması gibi RNA biyokimyasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kompleks oluşumunun elektroforez sırasında birden fazla kez izlenmesine olanak tanımasıdır.Yatay jel düzeneği için, 27 santimetreye 21 santimetre boyutlarında döküm tepsisine sahip ve iki adet 24 kuyucuklu tarağa uygun bir jel kutusu kullanın. Bu düzenek, aynı anda analiz edilebilecek toplam 48 numune sağlar. 400 mililitre 5x TBE'yi 1.600 mililitre su ile seyrelterek ve karıştırarak iki litre 1x TBE yürütme tamponu hazırlayın.TBE tamponunu soğuması için soğuk odaya yerleştirin. Aşağıdaki reaktifleri standart prosedürleri takip ederek hazırlayın: %40 akrilamid (tercihen 19:1), 5x TBE, TEMED ve %10 amonyum persülfat. %10 natif akrilamid jel hazırlamak için 500 mililitrelik bir erlene şunları ekleyin: 80 mililitre 5x TBE, 100 mililitre %40 akrilamid ve toplam hacim 400 mililitre olana kadar su.Dört mililitre %10 amonyum persülfat ve 400 mikrolitre TEMED ekleyip iyice karıştırın. Karışımı yatay döküm tepsisine dökün ve jelin çeker ocak içinde 30 dakika boyunca polimerize olmasına izin verin. Polimerize olan jel yaklaşık iki santimetre kalınlığında olacak ve jelin üzerinde ince bir sıvı tabakası kalacaktır.Jeli jel kutusuna yerleştirin ve soğuk odaya alın. Ardından, sıvıyı boşaltın ve akış tamponu ile durulayın. Tarakları dikkatlice çıkarın, jel kutusuna iki litre soğuk akış tamponu ekleyin ve ardından kuyucukları akış tamponu ile durulamak için bir şırınga kullanın.Jeli, soğuk odada, 4 °C'de, 120 volt ile bir saat boyunca ön çalışmaya tabi tutun. Jel ön çalışması yapılırken bağlanma reaksiyonlarını hazırlayın. Aşağıdaki bağlanma reaksiyon bileşenlerini, her bir RNA içermeyen mikrosantrifüj tüpüne sırasıyla ekleyin: 5 µL 10 mM BSA, 5 µL 20 mM DTT, 5 µL 10 mM maya tRNA'ları, 10 µL 5x bağlanma tamponu, 50 µL içinde 250 nM final konsantrasyona gelecek şekilde bicaudal-c proteini, final hacmi 45 µL olacak şekilde DEPC ile işlem görmüş su ve 5 µL floresan işaretli RNA substratı.Tüpleri kapatın ve karıştırmak için hafifçe vurun, tüpleri kısa süreliğine santrifüjleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Bağlanma reaksiyonları tamamlandığında, her reaksiyona 15 µL %50 gliserol ekleyin ve nazikçe karıştırın. Her reaksiyondan 30 µL'yi dikkatlice jel kuyucuklarına yükleyin; tek bir kuyucuğa yüklenebilecek örnek miktarı, jelin kalınlığına ve kuyucukların boyutuna bağlı olarak değişiklik gösterir.Güç kaynağını jel cihazına bağlayın, gücü açın, voltajı 120 volt olarak ayarlayın ve jeli dört derece celsius sıcaklıkta çalıştırın. Floresan işaretli RNA'nın zarar görmesini veya renginin solmasını önlemek için elektroforezi karanlıkta gerçekleştirin. Elektroforez süreleri, analiz edilen RNA protein kompleksinin özelliklerine bağlı olarak değişiklik gösterecektir.Yatay elektroforetik mobilite kayması analizi yönteminin temel bir avantajı, elektroforezin çalışma tamamlanmadan önce jel görüntüsü üzerinde durdurulabilmesidir. Analizi, floresan substratları saptamak için tasarlanmış herhangi bir cihazla gerçekleştirin. Görüntüleme cihazı ayarlarını düzenleyin; floresan işaretli ligandlar için aşağıdaki ayarları kullanın.473 nanometre floresein dalga boyu, 750 volt fotomultiplier voltajı ve 100 mikrometre piksel boyutu. Görüntüyü yakalamak için jeli tarayın. Görüntüleme işleminden sonra jel tekrar cihaza yerleştirilebilir ve elektroforez daha uzun sürelerle devam ettirilebilir.Xenopus bicaudal-C veya Bicc1 proteininin, Bicc1 bağlanma bölgesi içeren floresan işaretli bir Cripto1 mRNA'sına bağlanması, hem dikey hem de yatay doğal jel elektroforezi ile analiz edildi; negatif kontrol olarak Bicc1, CyclinB1 mRNA'sından türetilmiş floresan işaretli bir RNA ile karıştırıldı. Her iki yöntemde de Bicc1'in Cripto1 RNA'sına bağlandığı ve spesifik bir kompleks oluşturduğu açıkça görüldü. Bununla birlikte, Bicc1-Cripto1 kompleksleri yatay jel ile analiz edildiğinde önemli ölçüde daha belirgin hale geldi, bu da saptanmalarını kolaylaştırdı ve protein-RNA komplekslerinin bağlanmamış RNA'dan ayırt edilmesine olanak tanıdı.Görüntüleme işleminden sonra jel, jel düzeneğine geri yerleştirilmiş, üç buçuk saat daha elektroforez uygulanmış ve yeniden görüntülenmiştir. Burada gösterildiği gibi, kompleksler daha ileriye göç etmiş ve hala kolayca tespit edilebilmişlerdir; bu durum stabilitelerini göstermektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülürse işlem dört ila beş saat içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, yatay doğal jel elektroforezi kullanarak RNA-protein etkileşimlerinin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kaynak: Stenum, T. S. ve diğerleri. Escherichia coli'de transfer RNA'larının bolluğu ve şarj seviyelerinin nicelendirilmesi. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, E. coli'de transfer RNA'larının şarj seviyelerini tespit etmek ve karşılaştırmak için jel elektroforezi ve kuzey blotlama kullanımını göstermektedir; aminoasillenmiş ve deasillenmiş formları ayırarak karşılaştırılır.

E. coli'de tRNA şarj seviyelerini tespit etmek için jel elektroforezi ve kuzey blotlama ile

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

Bu videoda, kızılötesi floresan etiketli DNA probları kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için elektroforetik hareketlilik kaydırma testini gösteriyoruz. Protein DNA probuna bağlandığında, yavaşça hareket eden ve jel üzerinde kaymış bir bant olarak görünen büyük bir kompleks oluşturur.

Transkripsiyon Faktörü-DNA Komplekslerinin Tespiti için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Bir sheathless gözenekli ucu arayüz tasarımı kullanılarak kapiler elektroforez-kütle spektrometrisi ile biyolojik numunelerin metabolik profil için bir protokol verilmektedir.

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

Bu makale, insan hücrelerinin lizatlarından elde edilen dinnamin benzeri GTPase MxA proteininin oligomerik durumunu, denatüre olmayan PAGE ile western blot analizinin bir kombinasyonunu kullanarak değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokolü açıklamaktadır.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

Öğrenin, yatay jel elektroforezi ile RNA-protein etkileşimlerini analiz etmeyi. Bu yöntem, elektroforez sırasında kompleks oluşumunu gerçek zamanlı izlemenizi sağlar ve RNA biyokimyası çalışmalarında 48 örneği aynı anda değerlendirir.

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Daha fazla video keşfet