Şarj edilmiş veziküller Floresans mikroskobu ile izlenen simetrik ve asimetrik çözüm koşullarda davranışını faz
24 Ekim 2017
Ayrılmış faz dev unilamellar veziküller (GUVs) üzerinde deneyler sık fizyolojik çözüm koşulları ihmal. Bu çalışma yüksek tuzluluk arabellek etkisi ücret uygulamasının GUVs trans-membran çözüm asimetri ve sıcaklık sıvı-sıvı faz ayrılmaya bir fonksiyonu olarak çalışmaya yaklaşımlar sunar.
Bu protokolün genel amacı, fizyolojik koşullarda bulunan yüksek tuzluluk oranlı ortamların ve transmembran çözelti asimetrisinin membran faz durumları üzerindeki etkisini kantitatif olarak değerlendirmektir. Hücre içindeki ve hücre dışındaki çözeltiler çok farklıdır. Yöntemlerimiz, çözelti asimetrisinin membran özellikleri ve faz davranışı üzerindeki etkisini anlamaya yardımcı olur.
Yaklaşımımızın temel avantajı, veziküllerin fizyolojik tampon koşullarında hazırlanabilmesi ve mikroakışkan cihazın asimetrik tampon koşulları oluşturmak için kullanılabilmesidir. Prosedüre başlamak için, bir PTFE plakanın bir tarafını ince zımpara kağıdı ile pürüzlendirin. Plakayı, 15 mililitrelik bir cam şişeyi ve kapatılabilir bir cam kabı ticari bulaşık deterjanı, etanol ve kloroform ile yıkayın.
Kloroformda 10 ila 15 mikrolitre lipid stoğunu temiz, kuru PTFE plakanın pürüzlü tarafına bırakmak için 25 mikrolitrelik bir cam şırınga kullanın. Düzgün bir lipit filmi oluşturmak için lipit stoğunu şırınga iğnesi ile yayın. Plakayı 15 mililitrelik şişeye aktarmak için cımbız kullanın.
Plakayı 60 santigrat derecede ısıtın ve çözücüyü buharlaştırmak için iki saat kurutun. Ardından, bir cam kaba yaklaşık bir santimetre yüksekliğe kadar deiyonize su ekleyin. Şişeyi plaka ile kabın içine yerleştirin, sabit ve dik kaldığından emin olun ve kabı kapatın.
Lipid çift tabakasının dört saat boyunca 60 santigrat derecede önceden şişmesine izin verin. Ardından, şişeyi kaptan çıkarın. Plastik bir şırıngaya beş mililitre şişme solüsyonu çekin ve şırınga ucuna 0.45 mikrometrelik bir filtre takın.
Lipid filmi nemlendirmek için filtrelenmiş şişme solüsyonunu şişeye ekleyin. Şişeyi kapatın ve şişeyi plastik parafin filmi ile kapatın. GUV agregasını elde etmek için şişeyi gece boyunca 60 santigrat derecede saklayın.
Vezikülleri ocaktan alındıktan sonra bir saat içinde oda sıcaklığına soğutun. 200 mikrolitrelik plastik mikro pipet ucunun ucunu kesin, böylece GUV agregası uca çekilebilir. Agregayı ve 50 mikrolitre şişme solüsyonunu temiz, kuru iki mililitrelik bir şişeye aktarmak için kesilmiş pipet ucunu kullanın.
Sırasıyla simetrik veya asimetrik çözelti koşulları elde etmek için şişeye 950 mikrolitre taze şişme çözeltisi veya izotonik bir çözelti ekleyin. Karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından GUV'leri yeniden süspanse etmek için şişeyi birkaç kez hafifçe ters çevirin. Değerlendirmeye başlamak için, bir mikroskop lamındaki bir silikon izolatöre bir GUV süspansiyonu alikotu yerleştirin.
Hazneyi bir lamel ile kapatın. Numunenin beş dakika boyunca yeniden dengelenmesine izin verin. Ardından, slaydı bir floresan mikroskobunun numune aşamasına yerleştirin ve parti başına en az 30 GUV'luk görüntüler elde edin.
Görüntü GUV'lerinin faz durumlarını belirlemek için görüntüleri inceleyin. Tek bir sıvı faz durumundaki GUV'ler, membran boyunca homojen olarak dağılmış bir floresan etiket ile küresel ve pürüzsüz olacaktır. Sıvı, düzenli ve düzensiz iki fazlı durumdaki GUV'ler, zar içinde düzgün sınırlara sahip alanlara bölünmüş bir floresan etiket ile küresel olacaktır.
Etki alanlarının vezikül yüzeylerine yayılma özgürlüğüne sahip olduğunu ve birleşebildiğini doğrulayın. İki fazlı veya üç fazlı katı sıvı faz halindeki GUV'ler, bazı açısal sınırlarla yuvarlanacaktır. Katı bir arka plan üzerindeki sıvı alanlar difüzyon göstermemelidir, ancak katı alanlar sıvı bir arka plan üzerinde serbestçe yayılmalıdır.
Her bir GUV görüntüsünün faz durumu tanımlandıktan sonra, parti için baskın faz durumunu belirleyin. Baskın faz durumu dar bir çoğunluk ise, işlemi bağımsız örneklerle tekrarlayın. Mikroakışkan cihazı kullanmadan önce, her biri en az beş mililitre sakaroz ve tuz şişirme solüsyonları hazırlayın.
Her çözeltiyi 0,45 mikrometrelik bir filtreden süzün. Ardından, 200 mikrolitrelik plastik pipet ucunun uçlarını kesin ve cihazın her kanalına bir pipet ucu yerleştirin. Cihaz haznesine, GUV'leri hazırlamak için kullanılan aynı tipte 100 mikrolitre taze filtrelenmiş şişme solüsyonu ekleyin.
Her pipet ucuna beş mikrolitre şişme solüsyonu ekleyin. Cihaz kanallarını doldurmak için cihazı 10 dakika boyunca 900 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, bir mililitrelik bir cam şırıngayı aynı filtrelenmiş şişme çözeltisiyle doldurun.
Şırıngaya uzun bir boru bağlayın. Pistona tamamen bastırılana ve boru çözelti ile dolana kadar şişme solüsyonunu borunun içinden itin. Ardından, boruyu çıkış kanalına bağlayın ve şırıngayı bir şırınga pompasına monte edin.
Ardından, basınç kontrol ünitesini mikroakışkan kanal girişlerine bağlayın. Valflerin kapalı olduğundan emin olun ve ardından basıncı üç bara ayarlayın. Mikroakışkan cihazı, ters çevrilmiş bir konfokal mikroskobun numune aşamasına yerleştirin.
Şişme solüsyonunu cihaz haznesinden sadece 25 ila 50 mikrolitre solüsyon kalana kadar çıkarmak için bir pipet kullanın. Hazneye 150 mikrolitre GUV süspansiyonu ekleyin ve süspansiyonu hafif pipetleme ile karıştırın. Şırınga pompasını 20 dakika boyunca veya cihaz tuzaklarının% 90'ından fazlası dolana kadar dakikada 10 mikrolitre çekme modunda çalıştırın.
Ardından, mikroakışkan cihazdaki halka valfleri kapatmak için basınç kontrol ünitesi valflerini açın. Şırınga pompasını durdurun ve cihazdaki GUV'lerin konfokal görüntülerini almadan önce cihazın bir saat oturmasına izin verin. Ardından, yalnızca 25 ila 50 mikrolitre bırakmak için GUV süspansiyonunu rezervuardan çıkarmak için bir pipet kullanın.
Hazneye 150 mikrolitre diğer filtrelenmiş şişme solüsyonu ekleyin ve karışımı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Rezervuardaki çözeltiyi tamamen değiştirmek için bu işlemi en az beş kez tekrarlayın. Mikrokanallardaki çözeltiyi değiştirmek için şırınga pompasını 10 dakika boyunca dakikada 10 mikrolitre çekme modunda çalıştırın.
Ardından, akış hızını dakikada bir mikrolitreye düşürün. Basınç kontrol ünitesi valflerini iki saniye kapatın ve ardından valfleri açın ve şırınga pompasını durdurun. Konfokal görüntüleri kaydetmeden önce cihazın bir saat oturmasına izin verin.
Sıcaklık kontrol odasını hazırlamaya başlamak için, önce dikenli boru bağlantı parçalarını iki milimetre kalınlığında lamel pencereli bir alüminyum ısı akış tertibatına takın. Gözlem odasını oluşturmak için lamellerden birine kauçuk bir ara parça takın. Gözlem odasına 100 mikrolitre GUV süspansiyonu yükleyin ve odayı bir lamel ile kapatın.
Düzeneği yavaşça ters çevirin. Alüminyum hazneyi harici bir su banyosuna bağlayın. Düzeneği bir mikroskop üzerine monte edinamptage.
Harici su banyosunu istenen en düşük sıcaklığa ayarlayın ve sistemin 10 ila 15 dakika dengelenmesine izin verin. GUV'lerin görüntülerini elde edin ve çeşitli sıcaklıklarda faz durumlarını belirleyin. GUV'ler, simetrik sükroz veya tuz çözeltilerinde değişen oranlarda DOPG ve yumurta sfingomyelin ve kolesterolden hazırlandı.
Baskın faz durumları floresan mikroskobu ile belirlendi. Seçilen bileşimler daha sonra faz davranışı üzerindeki etkili çözelti koşullarını değerlendirmek için seyreltme yoluyla asimetrik koşullara aktarıldı. Asimetrik çözeltilerde GUV faz davranışını daha fazla araştırmak için, GUV'ler, harici çözeltinin tam olarak değiştirilmesine izin vermek için mikroakışkan bir cihazda hapsedildi.
Sıkışan GUV'lar, sıvı değişimi öncesi ve sonrası konfokal mikroskopi ile değerlendirildi. Homojen ila faz ayrılmış GUV'lerin fraksiyonu, GUV faz davranışı üzerindeki etkili sıcaklığı değerlendirmek için bir dizi sıcaklık boyunca izlendi. Verilerde sigmoidal bir model gözlendi ve bunlar daha sonra bir Boltzmann modeline uygun hale getirildi.
Faz ile ayrılmış GUV'lerin fraksiyonunun 0.5 olduğu sıcaklık, takılan eğriden belirlendi. Bu yöntemler zar fazı davranışı hakkında fikir verebilse de, uygulamalar fizyolojik koşullarda biyomoleküllerdeki zarlar arasındaki etkileşimleri incelemek gibi diğer deneyler için de kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, yüksek tuzluluk tampon koşullarının yüklü çok bileşenli dev tek tabakalı zarlı veziküllerde (GUV) sıvı-sıvı faz ayrımı üzerindeki etkisini araştırmaktadır. Araştırma, zar özelliklerini anlamak için zar boyunca çözelti asimetrisi ve sıcaklığın önemini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Zar Biyolojisi
Arka Plan
- Dev tek tabakalı zarlı veziküller (GUV), zar dinamiğini incelemek için model sistemlerdir.
- Fizyolojik koşullar genellikle deneysel kurulumlardan önemli ölçüde farklıdır.
- Zarlardaki faz davranışı anlamak, hücresel süreçler hakkında bilgi edinmek için kritik öneme sahiptir.
- Yüksek tuzluluk ortamları zar özelliklerini ve faz durumlarını değiştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Yüksek tuzluluk ve zar boyunca çözelti asimetrisinin zar faz durumları üzerindeki etkilerini nicel olarak değerlendirmek.
- Fizyolojik tampon koşullarında GUV hazırlamak için yöntemler geliştirmek.
- Çözelti asimetrisinin zar özellikleri ve faz davranışı üzerindeki etkisini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- PTFE plakaların üzerine lipid filmlerinin hazırlanması ve ardından GUV oluşturmak için hidrasyon.
- Asimetrik tampon koşulları oluşturmak için mikroakışkan araçların kullanımı.
- GUV faz durumlarını değerlendirmek için floresan mikroskobu.
- Floresan dağılımına dayalı faz durumlarının nicel analizi.
Ana Sonuçlar
- GUV'ler, çözelti koşullarına bağlı olarak farklı faz durumları sergiler.
- Faz davranışı hem tuzluluk hem de zar boyunca asimetriden etkilenir.
- Geliştirilen yöntemler, fizyolojik koşullar altında kontrollü deneylerin yapılmasını sağlar.
- Sonuçlar, hücresel ortamlarla ilgili zar dinamiği hakkında bilgiler sunar.
Sonuçlar
- Çalışma, zar araştırmalarında fizyolojik koşulların önemini vurgulamaktadır.
- GUV'lerde faz ayrımının anlaşılması, hücresel zar çalışmalarına bilgi sağlayabilir.
- Gelecek araştırmalar bu yöntemler üzerine inşa ederek karmaşık biyolojik sistemleri keşfedebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding membrane phase behavior under physiological solution conditions is critical for de-risking target validation in membrane-associated drug discovery. This protocol enables assessment of how high-salinity and transmembrane asymmetry influence lipid domain stability, providing predictive confidence in early-stage mechanistic studies. By modeling physiologically relevant membrane environments, the approach supports translational continuity from discovery to preclinical evaluation of compounds targeting membrane proteins or lipid-dependent pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how solution conditions modulate lipid raft formation, informing hypotheses about membrane protein localization and signaling complex assembly.
- Operational Value: Enables controlled testing of transmembrane asymmetry effects, reducing false positives in target engagement assays conducted under non-physiological buffer conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates phase-separated GUVs as reproducible models for evaluating compound partitioning into liquid-ordered or liquid-disordered domains.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation under symmetric or asymmetric high-salinity conditions, improving assay robustness for fluorescence-based membrane interaction screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro phase behavior to physiological relevance, supporting risk-adjusted advancement of leads whose activity depends on membrane microenvironment.
- Operational Value: Provides a scalable method to assess temperature-dependent phase transitions, enabling correlation with preclinical efficacy or toxicity signals under varying physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where membrane target validation requires mechanistic de-risking of lipid-dependent mechanisms, particularly for targets implicated in lipid raft-mediated signaling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding how solution asymmetry influences domain formation and protein recruitment to specific lipid phases.
- Screening: Delivers assay-ready GUV populations with quantifiable phase states, enabling reliable comparison of compound effects across solution conditions.
- Analytics: Produces fluorescence-based domain partitioning metrics that help teams compare compound behavior in ordered versus disordered membrane phases.
- Translational Research: Connects GUV phase stability to physiological temperature and salinity ranges, informing preclinical model selection for membrane-targeted interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for evaluating membrane microenvironment effects across multiple projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by revealing how ionic strength and gradient conditions alter membrane material properties relevant to drug binding.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized GUV formation and solution exchange protocols, minimizing variability in membrane-based assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying compounds whose activity is sensitive to physiological solution conditions, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of membrane-associated targets based on validated phase behavior under realistic extracellular and intracellular milieus.
Implementation Considerations
- Expertise in lipid film hydration, vesicle formation, and fluorescence microscopy interpretation is required to ensure accurate phase state assessment.
- Access to microfluidic systems and temperature-controlled chambers is necessary for implementing asymmetric solution conditions and thermal variation studies.
- Standardization across teams depends on consistent lipid composition, vesicle size selection, and imaging parameters to maintain comparability of phase state data.
- Adaptation to other model systems (e.g., different lipid mixes or protein-reconstituted vesicles) should consider potential alterations in phase transition temperatures and domain stability.
- Practical limitations include the need for careful avoidance of vesicle dilution during solution exchange and potential photobleaching during prolonged fluorescence imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Giant Unilamellar Vescicle (GUV) Preparation
3:02
Phase State Assessment with Fluorescence Microscopy
4:33
GUV Observation and Imaging with a Microfluidic Device
7:35
GUV Observations at Varying Temperatures
8:29
Results: GUV Phase Behavior
9:42
Conclusion
