CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

Sıçrama yönteminin genel amacı, embriyogenez için gerekli olan genler için mutant hatların oluşturulmasını kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, Gelişimsel Genetik ve diğer alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, temel genlerdeki mutantların F1 neslinde elde edilebilmesidir.

Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde, tek hücreli aşamadaki Xenopus embriyolarına Cas9-sgRNA komplekslerini mikroenjekte edin. Embriyolar döllenme sonrası 4,5 saate ulaştığında, yani erken blastula aşaması dokuzda, oda sıcaklığında gelişmeye devam etmelerini sağlamak için onları 25 derece Celsius'lik inkübatörden çıkarın. Döllenme sonrası beşinci saatte transplantasyona başlamak için, greft alıcısı olarak hizmet edecek olan, oyuklar içeren 60 milimetrelik bir agaroz kaba bir adet enjekte edilmemiş embriyoyu aktarmak için bir pasteur pipeti kullanın.

Ayrıca, kaba bir PGC donör embriyosunu da kaba aktarın. Her bir embriyodan vitellin zarları manuel olarak çıkarmak için pens kullanın. Ardından, her iki embriyoyu da vegetal kutupları görünür ve cerrahi müdahale için erişilebilir olacak şekilde döndürün.

Ardından, alıcı embriyoyu saç döngüsüyle sabitleyerek, bir kaş kılı bıçağının keskin ucunu vejetal kutba, yüzeyin hemen altına yerleştirin. Ve hızlı, yukarı doğru kesme hareketleriyle, blastoporu işaretleyen gelecek şişe hücrelerinin oluşacağı bölgeye, kare şeklinde dört sığ kesi yapın. Karenin dört kenarı belirlendikten sonra, benzer kesme hareketlerini kullanarak her bir kesiyi blastosol tabanına olan mesafenin yaklaşık 1/3 ila 1/2'si derinliğe kadar kaş kılı bıçağıyla derinleştirin.

Derin vegetal bölgede bir veya daha fazla yatay kesi yaparak vegetal doku eksplantını alıcı embriyodan ayırın. Ardından, hızlı hareket ederek, transplantasyon için benzer büyüklükte bir vegetal doku fragmanı oluşturmak üzere bu işlemi PGC donör embriyoda tekrarlayın. PGC'leri içeren doku donör embriyodan çıkarıldıktan sonra, eksplantı alıcı embriyoda oluşturulan açıklığa yerleştirmek için kaş kılı bıçağını ve kıl halkasını kullanın.

Greftin yüzeyine paralel tutulan kaş alma bıçağının gövdesini kullanarak, grefti alıcı embriyonun vegetal yüzeyindeki açıklığa hafifçe bastırın. Donör embriyonun gövdesini agaroz yüzey boyunca nazikçe kaydırarak bir kuyucuğun içine yerleştirmek için saç döngüsünü kullanın. Gövdenin açık yarasının sıvı kütleye baktığından emin olun.

Alıcı embriyoyu bitişik bir kuyuya kaydırın ve aynı şekilde, nakledilen vezikal kutup dokusunun sıvı kütlesine baktığından emin olun. Embriyolar yaklaşık olarak erken gastrula evresi 10'a ulaşana kadar, nakiller yapılırken embriyoları boş kuyulara aktararak daha fazla transplant gövde çifti oluşturmak için PGC'lerin transplantasyonunu ek embriyolarla tekrarlayın. Greftler yerleşip iyileştikten sonra, genellikle transplantasyondan 30 ila 45 dakika sonra, embriyoları çukurlardan agaroz kaplı 24 kuyucuklu bir plakadaki bireysel kuyucuklara çok nazikçe aktarmak için bir pasteur pipeti kullanın.

Embriyoları, vegetal kutup yukarı bakacak ve ana çözeltiye yönelecek şekilde döndürün. Embriyo çiftlerini takip etmeyi kolaylaştırmak için donör gövdeleri ve greft alıcılarını yan yana kuyucuklara yerleştirin ve bu bilgileri kaydedin. Ardından, embriyoları içeren 24 kuyucuklu plakayı gece boyunca 25 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.

Ertesi gün, şu an erken kuyruk tomurcuğu evresinde olan her bir greft alıcısını, taze, agaroz kaplı, altı kuyucuklu bir plakadaki ayrı kuyucuklara aktarın. Sıçrama yöntemiyle (leapfrog) elde edilen embriyoları büyütün ve kadavralardan elde edilen donör DNA analizlerini metin protokolüne uygun şekilde gerçekleştirin. Sıçrama yöntemi, germ hattının mutant alellerle verimli bir şekilde yer değiştirdiği hayvanlar ürettiği için, mutant fenotipler F1 neslinde elde edilebilir.

Bu tabloda sunulduğu üzere Blitz ve ark., melanosit ve retinal pigmentasyon için gerekli olan tirozinaz lokusunu hedefleyen F0 hayvanlarının çoğunluğunun, tyr minus albino hayvanlarla yapılan dış çaprazlamalarla ölçüldüğü üzere, donör kaynaklı mutant genomların %100 germ hattı iletimini gösterdiğini bildirmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, Xenopus primordial germ hücrelerinin nasıl nakledileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.