Name: Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin azot kavitasyonu ve diferansiyel santrifüj kullanarak kültürlü hücrelerde periferik membran proteinlerinin dağılımını deterjan kullanmadan analiz etmeyi. Bu yöntem endojen proteinlerin membran ve sitozolik fraksiyonlarda güvenilir şekilde tespit edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser, GM055279, CA116034 ve CA163489 tarafından finanse edildi.

1. tampon ve ekipman ürünleri <ol><li>4'te 45 mL hücre bozulma bomba, 15 mL tüpler ve ultrasantrifüj tüpler Chill ° C.</li>
	<li>Hazırla ve chill başına 2 x 10 7 hücreleri 4 ° C. Ekle bir proteaz inhibitörü tablet kullanmadan önce homojenizasyon arabellek 25 mL. 
	Not: Hücre içi tuz kompozisyon NaCl daha iyi yansıtmak yerine homojenizasyon arabellekleri genellikle KCl içerir. Bu protokol için kullanılan homojenizasyon arabellek 10 mM HEPES pH 7.4, 10 mM KCl ve 1.5 mM MgCl 2 (aşağıda Hipotonik homojenizasyon arabellek anılacaktır) oluşur. Çoğu arabellekleri azot kavitasyon için adapte edilebilir (konuya bakın).</li>
	<li>Hazırla ve 6 mL 1 x 4 ° C. Ekle proteaz inhibitörü tablet kullanmadan önce yeni, örnek başına Phosphate-Buffered serum fizyolojik (PBS) arabellek chill. 
	Not: Bu protokol için kullanılan PBS arabellek 10 mM Na 2 HPO 4 pH 7.4, 1.8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl ve 2.7 mM KCl oluşur.</li>
	<li>Hazırla ve chill solubilization arabellek 4 ° C. Ekle bir proteaz inhibitörü tablet kullanmadan önce örnek başına 4 mL. 
	Not: Bu protokol için kullanılan Solubilization arabellek 25 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, % 0,1 SDS, % 0.5 sodyum deoxycholate ve % 1'oluşur 1 x Radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek olduğunu NP-40. 4.6 Not bkz.</li>
</ol> 2. Hücre hasat <ol><li>Grow 2 x 10 7 -10 x 10 9 doku kültürü hücreleri ile önerilen kültür medya hücre türü için. Genellikle, bir 15 cm çanak 2 x 10 7 DMEM içinde % 90 confluency ( şekil 1) kültürlü HEK-293 hücreleri verimleri.</li>
	<li>Vakum tarafından büyüme orta kaldırmak.</li>
	<li>Yapışık hücreleri için kültür yemekleri Buza koyun, kültür yemekleri yavaşça soğutulmuş homojenizasyon arabellek iki kez (15 cm çanak yıkama başına başına 10 mL arabellek) ile doğrudan hücrelerdeyse yıkama ve uygun bir hacmine büyük hücreli sıyırıcı ile hücre hasat homojenizasyon arabellek; Süspansiyon hücreleri, toplar ve hücre Pelet soğutulmuş homojenizasyon arabellek iki kez (50 mL kültür yıkama başına başına 10 mL arabellek) 500 x g spin 5 min için 4 ° C'de ile yıkayın ve yıkanmış hücre Pelet homojenizasyon arabellek buz üzerinde uygun bir hacmine resuspend. Not: birim hücre bozulma bomba içinde izin verilen en az/en büyük birim yanı sıra hedeflenen deneyler protein konsantrasyonu için gereksinimleri temel almalıdır. Genel bir kılavuz 2-10 x 10 7 hücre/mL, ya da yaklaşık 10 birim hücrenin cips. Bu iletişim kuralı homojenizasyon arabelleğinin 2 mL HEK-293 hücrelerinin üç 15 cm yemekler için optimize edilmiştir.</li>
</ol> 3. Azot kavitasyon <ol><li>bir heyecan transferinde hücre süspansiyon bir buz banyosu temiz ve soğutulmuş bomba için plaka. 
	Dikkat: Bomba vardır yüksek basınç, düşük sıcaklık, azot gazı &#8211; uygun kişisel korumak .</li>
	<li>Bir mikro manyetik heyecan bar içinde bomba yerleştirin ve süspansiyon homojenliği korumak için heyecan plaka açın.</li>
	<li>Bir proteaz inhibitörü tablet için süspansiyon ekleyin ve üretici başına bomba yakın &#39; s eğitimi.</li>
	<li>Yavaş yavaş bomba bir azot gaz tank üreticisi başı ile sıkmak &#39; s öğretim bomba basınç göstergesi kadar 300-600 PSI okur. Bütün vanaları kapatın ve azot tankı çıkarın. 
	Not: gerekli basınç ile hücre türü değişebilir. Burada HEK-293, NIH 3T3 ve Jurkat hücreler için 350-400 psi, kavitasyon gerçekleştirilen.</li>
	<li>Azot dağıtılması ve denge hücrelerindeki ulaşmak izin vermek 20 dk bekleyin.</li>
	<li>Bir bez havlu kullanarak boşaltma vanası çevresinde aşırı su kaldırın. Yavaşça homogenate dropwise bir sürümü elde etmek ve bir önceden soğutulmuş 15 mL tüp içinde toplamak için deşarj Vanayı aç. 
	Not: koleksiyon sonuna yakın orada-ecek var olmak homogenate bir hamle ve gaz tıslayan ses ile ortaya çıkacak. Gaz değil emin olun daha önce toplanan neden cavitate tüp dışında ateş (1,5 mL tüpler yerine 15 mL kullanımı bu nedenle tüpler). Olağanüstü çaba başladı mı, deşarj vanayı kapat ve aniden bombayı basıncını ve kavitasyon bomba kalan hücreleri elde etmek için azot giriş Vanayı aç. Açık bombayı cavitate kurtarma ve derinlemesine temizlik. 
	Not: Son cavitate üstüne köpük ile sütlü bir görünüm olması gerekir. Santrifüjü önce çökmek köpük izin vermek için bir pipet ucu ile hafifçe karıştırın. 
	Not: cavitate faz kontrast mikroskobu tarafından homojenizasyon etkinliğini belirlemek için inceleyin. Bir 15 µL damla eklemek bir mikroskobu slayt ve bir coverslip ile kapak yüzeyine cavitate. 3.4-3.6 Eğer sadece çok fazla kırılmamış hücreleri bir 20 X amacı ile algılanır adımı yineleyin. 
	Not: homojenizasyon arabellek EDTA veya EGTA içermiyorsa, eklemek için toplanan bu 1 mM 5 dk içinde son bir konsantrasyon deşarj sonra cavitate.</li>
</ol> 4. Cytosolic ve membran kesirler ayrılması <ol><li>santrifüj cavitate 500 x g 4 ° C'de kırılmamış hücreleri ve hücre çekirdeği kaldırmak için 10 dk için. 
	Not: hiçbir görünür Pelet üretilen kadar aralıklarla tekrarlayın ve üstte yüzer köpük kaçınırken Post nükleer süpernatant (PNS) toplamak. Daha fazla toplamak ve PNS, birleştirmek için köpük gerekirse yeniden santrifüj kapasitesi ( şekil 1).</li>
	<li>PNS kesirler ilgi elde etmek için istediğiniz gibi işlemek. Sitozolik ayıran ve membran kesirler, amacıyla bir ultracentrifuge tüp PNS aktarmak ve ultrasantrifüj istediğiniz gibi gerçekleştirin. Bu iletişim kuralı için optimize edilmiş bir &#60; 3,5 mL örnek bir polikarbonat ultracentrifuge tüp ve ultrasantrifüj 350.000 x g 4 1 h için de için ° C.</li>
	<li>1 mL pipet kullanarak süpernatant (S kesir) toplamak.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde rahatsız etmeden Pelet 3 mL soğuk PBS ile yıkayın. PBS tarafından vakum kaldırmak. 
	Not: 3 ml soğuk PBS ve re-ultracentrifuge olduğu gibi adım 4.2 Pelet membran kısmı tarafından sitozolik protein kontaminasyonu örnek kaybı daha büyük bir endişe ise, resuspend. PBS tarafından vakum kaldırmak.</li>
	<li>Pelet tam olarak uygun birimlere deterjan içeren solubilization arabellek tercih resuspend. Hücre denklik elde etmek için aynı birimin solubilization arabelleği sitozolik kesir olarak kullanın. 
	Not: 1 x RIPA tampon solubilization tampon olarak verimli membran protein çıkarma için kullanmanızı öneririz. Aşağı akım yok tahlil membran kesir için gerekliyse, maksimal membran protein ayıklama için 1 x laemmli örnek arabellek kullanın. 
	Not: Biz kekii ve 4 ° C maksimal membran protein çıkarılması için bir tüp rotator temiz bir tüp içinde solubilization tampon Pelet aktarılması öneririz. 
	Not: Pelet (th verimli kaldırılacak çok yapışkan çok fazla lipidler) isee ultracentrifuge tüp solubilization arabelleği ek öneririz Pelet sıvı azot içinde dondurma ve ultracentrifuge tüp pelet pelet Tammy'nin önce bir mini metal spatula ile hızlı bir şekilde kekii. 
	Not: Alternatif olarak, membran granül olabilir sadece resuspended ve çözündürüldükten membran vezikül süspansiyon Santrifüjü adım içinde 4,6 durumda gerekli değildir, bir P kısmını üretmek için bir deterjan içeren arabellekte değil. Böyle P kesirler membran Derneği üzerinde bağımlı enzim aktiviteleri gibi fonksiyonlar soruşturma sırasında yararlıdır.</li>
	<li>Tamamen çözündürüldükten Pelet süspansiyon adım 4.5 20.000 x g masa üstü bir santrifüj 10 dk içinde de 4'te santrifüj kapasitesi ° C. 1 mL pipet (P kesir) kullanarak süpernatant toplamak ve Pelet (çözünmez lipidler) atın.</li>
	<li>Gerçekleştirmek istenen deneyleri Batı sitozolik ve/veya membran kesirler ile kurutma gibi veya ileride kullanmak üzere-80 ° C'de kaydedin.</li>
</ol>

<ol><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+on+the+move%3A+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li>
<li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li>
<li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li>
<li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li>
<li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells%3A+composition+and+intracellular+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li>
<li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li>
<li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li>
<li>Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li>
<li>Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li>
<li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li>
<li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1-interacting+adapter+molecule+%28RIAM%29+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li>
<li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li>
<li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li>
<li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature%2C+tubulin+concentration%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Manifold gibi diğer yöntemler üzerinde azot kavitasyon mekanik bozulma avantajları vardır. Belki de en önemli yararı yavaşça henüz verimli bir şekilde numuneler homojenize yeteneğidir. Dekompresyon cools örnekleri oluşturma Yerel Isıtma hasar yerine fiziksel prensipleri Ultrasonik gibi ve sürtünme/kesme teknikleri dayalı. Kavitasyon Ayrıca son derece plazma zarı bozan etkilidir. Azot kabarcıklar dekompresyon, kavitasyon işleminin üzerine tek tek her hücre içinde oluşturulan sınırlı olduğundan hücre boyutuyla daha az boyu...

Hücresel proteinler iki sınıfa ayrılabilir: membranlar ve olmayanlar ile ilişkili olan o. Sigara-membran ilişkili proteinler sitozol, nucleoplasm ve endoplazmik retikulum (ER) gibi organellerin lumina bulunur. Membran ilişkili proteinler, integral ve periferik iki sınıf vardır. Bir veya daha fazla parçadan polipeptid zinciri yayıldığı için membran, genellikle bir α-helix hidrofobik amino asitleri oluşur olarak integral membran proteinlerinin transmembran proteinler da verilir. Transmembran proteinler membran onların sentezi sırasında co-translationally takılan ve onlar catabolized kadar çok yapılandırılmış kalır. Periferik membran proteinlerinin ikincil olarak membranlar, genellikle bir sonucu olarak post-translational değişiklik lipidler hidrofobik moleküllerin ile tahrik edilmektedir. İntegral membran proteinlerinin, aksine periferik membran proteinlerinin dernek hücresel membranlar ile geri alınabilir ve düzenlenmiş olması. Birçok çevresel membran proteinleri işlev sinyal yolları ve membranlar ile düzenlenmiş Derneği etkinleştirme veya inhibe bir yol için bir mekanizmadır. Periferik membran proteinidir bir sinyal molekülü küçük GTPazlar, RAS örneğidir. Bir dizi değişiklik ile farnesyl lipid içeren translasyonel modifikasyonlar sonra değiştirilmiş C-terminus olgun bir RAS protein hücre membran sitoplazmik broşürü ekler. Özellikle, plazma zarı nerede onun aşağı akım efektör RAF1 RAS yürütmektedir olduğunu. Mitojenle-aktive protein kinaz (MAPK) aktivasyonu bünye önlemek için birden çok düzeyde denetimler RAS yerdesiniz. RAS etkin olmayan GTP GSYİH hidrolize tarafından render yanı sıra, etkin RAS da plazma zarı antenler, deðiþiklikler veya amil-e doğru sinyal inhibe çözücü ile etkileşimler tarafından azat edilebilir. Floresan canlı görüntüleme hücre biyologları protein öğesini floresan periferik membran protein1hücre altı lokalizasyonu gözlemlemek için fırsat tanıyor olsa da, orada kalır membran Derneği değerlendirmek için kritik bir ihtiyaç basit biyokimyasal yaklaşımlarla yarı kantitatif endojen proteinler.
Membran ve çözünür kesirler arasında protein bölümleme doğru biyokimyasal değerlendirme eleştirel iki faktöre bağlıdır: hücresel homojenizasyon ve membran ve çözünür kesirler verimli ayrılması. En yaygın olarak kullanılan ticari kitleri dahil olmak üzere bazı iletişim kuralları üzerinde deterjan tabanlı cep homojenizasyon bağlı olsa da, bu yöntemlerin çözünür aşama2membran proteinlerinin ayıklayarak analiz karartmak. Buna göre deterjan bazlı, mekanik yöntemler hücre bozulma temiz sonuçlar sağlar. Hücre kültüründe yetiştirilen veya kan ya da organ hasat mekanik bozulma birkaç yöntem vardır. Bu Dounce Homojenizasyon, ince iğne bozulma, rulman Homojenizasyon, sonication ve azot kavitasyon içerir. Burada azot kavitasyon değerlendirmek ve diğer yöntemler için karşılaştırın. Azot kavitasyon yüksek basınç altında hücre sitoplazma içinde çözünmüş azot kullanır. Öyle ki onların coşku bir sonucu olarak hücre açık gözyaşı sitoplazmada azot kabarcıklar oluşur denge sonra hücre süspansiyon aniden atmosferik basınca maruz kalmaktadır. Basınç yeterince yüksek ise azot neşesinden çekirdeği3 bozabilir ve membran organelleri gibi organellerin4bağlı. Ancak, eğer basınç yeterince düşük tutulur, dekompresyon plazma zarı ve ER ama değil diğer organelleri böylece sitozol ve bozulmamış sitoplazmik organelleri cavitate5atanır homogenate dökülüp, bölebilir. Bu nedenle, azot kavitasyon organelleri gibi organellerin ve mitokondri izole için tercih yöntemdir.
Ancak, membran ve çözünür kesirler kolayca ayrılabilen bir homogenate hazırlama mükemmel bir şekilde de öyle. Bir tank ve bir çıkış bağlantı noktası bir Ayarlanabilir deşarj Vana ile azot gazı teslimi için bir giriş ile yüksek basınç dayanıklı kalın paslanmaz çelik kasa, kavitasyon sırasında kullanılan (bundan böyle "bomba" olarak da adlandırılır) basınç gemi oluşur.
Azot kavitasyon hücre homojenizasyon 1960'larda6beri kullanılmaktadır. 1961 yılında, avcı ve Commerfold7 memeli doku bozulması için uygun bir seçenek olarak azot kavitasyon kurdu. O zamandan beri araştırmacılar çeşitli hücre ve dokulara başarı ile tekniği adapte olması ve azot kavitasyon membran hazırlık8,9, çekirdek ve organel dahil olmak üzere birden çok uygulama bir elyaf haline gelmiştir Hazırlık10,11ve değişken biyokimyasal çıkarma. Şu anda, hücre biyologları daha sık hücre homojenizasyon diğer yöntemleri azot homojenizasyon faydaları değil yaygın olarak reklamı, azot bomba pahalıdır ve hücre nispeten büyük bir sayıdır bir yanlış anlaşılma olduğunu çünkü istihdam Gerekli. Boş hücre homogenates olduğu gibi çekirdek ile elde etmek azot kavitasyon protokollerde yayınlanmadı ve en Yayınlanan değerlendirme hücre süspansiyon, 20 mL hacimli kullanılmıştır. Küçük ölçekli örnekler ile çalışma geçerli uygun için klasik bu tekniği adapte, azot kavitasyon kültürlü hücreler için özel olarak tasarlanmış değiştirilmiş bir protokol mevcut. Azot kavitasyon sonra homogenate çözünür (S) ve membran (P) kesirler fark Santrifüjü tarafından ilk çekirdeği ve kesilen hücreleri kaldırmak için bir düşük hızlı spin ile ve sonra bir yüksek hızlı spin ile ayrılır (&#62; 100.000 x g) ayırmak için membranlar çözünür kesir üzerinden. Biz immunoblots ile ayırma verimliliğini analiz ve azot kavitasyon diğer mekanik bozulma teknikleri ile karşılaştırın. Azot kavitasyon sırasında Ayrıca homojenizasyon arabellek ozmotik etkisini araştırmak.

<table><tbody><tr><td>Hücre Bozulma Kabı (45 mL)</td><td>Parr Aleti</td><td>4639</td><td>Azot kavitasyon Bombası</td></tr><tr><td>Dounce homojenizatör (2 mL)</td><td>Kontes</td><td>885300-0002</td><td>Dounce havaneli ve tüp</td></tr><tr><td>U-100 İnsülin Şırıngası 28G&frac12;</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td>İğne</td></tr><tr><td>Atg12 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltme&</td></tr><tr><td>beta;-aktin antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>47778'de</td> kullanım <td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltme&</td></tr><tr><td>beta;-tubulin antikoru</td><td>DSHB</td><td>E7-s</td><td>Fare antikoru, 1:5000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Calnexin antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>23954</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Calregulin antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>373863</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Katalaz antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>271803</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>CIMPR antikoru</td><td>Abcam</td><td>124767</td><td>Tavşan antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>EEA1 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede</td></tr><tr><td>kullanım EGFR antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>F0-ATPaz antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>F1-ATPase antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Fibrillarin antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>374022</td><td>Fare antikoru, 1:200 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Golgin 97 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>59820</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>HDAC1 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>81598</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Hekzokinaz 1 antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>2024S</td><td>Tavşan antikoru, 1:1000 seyreltmede</td></tr><tr><td>kullanım Lamin A/C antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>376248</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>LAMP1 antikoru</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Na+/K+ ATPase antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Rab7 antikoru</td><td>Abcam</td><td>137029</td><td>Tavşan antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Rab9 antikor</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>RCAS1 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>398052</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>RhoGDI antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>360</td><td>Tavşan antikoru, 1:3000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Ribozomal protein S6 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>Fare antikoru, 1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>Sec61a antikorunda</td> kullanın<td>Santa Cruz</td><td>12322</td><td>Keçi antikoru, 1:1000 seyreltmede kullanım</td></tr><tr><td>Kalın duvar Polikarbonat ultrasantrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Ultrasantrifüjleme için numune tüpü</td></tr><tr><td>TLK-100.3 rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td>ultrasantrifüjleme için rotor</td></tr><tr><td>Optima MAX Yüksek Kapasiteli Kişisel Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>364300</td><td>ultrasantrifüj</td></tr><tr><td>cOmplete proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>proteaz inhibitörleri</td></tr><tr><td>25cm Saplı ve 3.0cm Bıçaklı Hücre Sıyırıcılar</td><td>Corning</td><td>353089</td><td>büyük hücreli sıyırıcı</td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırma Çubuğu Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-513-57SIX</td><td>mikro karıştırma çubuğu</td></tr><tr><td>Seramik Üstü Manyetik Karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>S504501AS</td><td>manyetik karıştırıcı</td></tr></tbody></table>

azot kavitasyon ve diferansiyel santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Kültürlü hücrelerin periferik zar proteinleri de dahil olmak üzere proteinlerin hücre altı dağıtım eğitimi için yararlıdır. Genetik olarak kodlanmış fluorescently tagged proteinler hücre altı protein dağıtım çalışmanın devrim. Ancak, özellikle proteinler kısmen sitozolik olduğunda floresan mikroskopisi, dağılımıyla ölçmek zordur. Ayrıca, bu kez endojen proteinler çalışma önemlidir. İmmunoblots miktar protein dağıtım sonra hücre altı ayırma için altın standart kalır gibi biyokimyasal deneyleri. Sitozolik veya belirli membran kesirler ayırma amacı ticari kitleri olmakla birlikte, bu kitleri çoğunu ayıklama membranlar kolayca ayıklanır periferik membran proteinlerinin eğitim için uygun olmayan deterjanlar ile temel alır. Burada bir deterjan-Alerjik protokol hücresel homojenizasyon için azot kavitasyon ve sonraki ayrılması sitozolik ve membran bağlı proteinler tarafından ultrasantrifüj tarafından mevcut. Biz hücre altı organelleri çözünür içinde ayrılması ve Pelet kesirler farklı hücre türleri arasında onaylayın ve protein ayıklama birkaç ortak mekanik homojenizasyon deterjan tabanlı olmayan yöntemler arasında karşılaştırın. Azot birkaç avantajları arasında kavitasyon hassas organelleri en az fiziksel ve kimyasal zarar ile hücresel bozulma üstün verimliliği olduğunu. Ultrasantrifüj ile birlikte, azot kavitasyon sitozolik arasındaki periferik membran proteinlerinin kayma incelemek için mükemmel bir yöntem olduğunu ve membran kesirler.

Şekil 2 hücresel PNS çözünür sitozolik kesir (S) veya membran Pelet kesir (P) proteinler bölümleme gösterir. Biz farklı hücre türleri üç temsilcisi hücre satırlarından muayene: HEK-293 (epitel), NIH-3T3 (fibroblast) ve Jurkat (lenfosit). Rho guanin ayrılma inhibitörü (RhoGDI) ve katyon bağımsız mannoz-6-fosfat reseptör (CIMPR) için pozitif kontrol olarak kullanılan sitozolik ve membran kesirler, anılan sıraya göre. Azot kavitasyon sonra sitozol ve membran ayı...

Burada iletişim kuralları için deterjan-Alerjik homojenizasyon kültürlü memeli hücrelerinin azot kavitasyon ve sonraki sitozolik ve membran bağlı proteinler ayrılması ultrasantrifüj tarafından dayalı mevcut. Bu yöntem periferik membran proteinlerinin çözünür arasındaki bölümleme izlemek için idealdir ve membran kesirler.

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, kültüre edilmiş hücreleri optimal şekilde homojenize etmek ve hücresel proteinlerin membran ve çözünür fraksiyonlar arasındaki dağılımını analiz etmektir. Bu yöntem, hücre biyolojisindeki temel zorluklardan biri olan membran periferik proteinlerinin hücresel kompartmanlaşması konusuna çözüm sağlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deterjan kullanmadan, endojen proteinlerin katı ve membran fraksiyonları içindeki dağılımını yüksek doğrulukla ve tekrarlanabilir şekilde tespit edebilmesidir.Başlamak için, HGK293 hücrelerini 37 °C sıcaklıkta, %5 CO₂ içeren DMEM içerisinde, 15 cm'lik bir kapta hücre verimi yaklaşık 2 x 10⁷ hücre olacak şekilde %90 konfluense ulaşana kadar kültüre edin. Ardından, büyüme ortamını vakumla aspire edin. Sonrasında, kültür kaplarını buza yerleştirin ve kaplardaki hücreleri, kap başına 10 mL soğutulmuş homojenizasyon tamponu ile nazikçe iki kez yıkayın.Yıkama işleminden sonra, uygun hacimde homojenizasyon tamponu kullanarak hücreleri toplamak için büyük bir hücre kazıyıcı kullanın. Şimdi, hücre süspansiyonunu, bir manyetik karıştırıcı üzerinde buz banyosuna yerleştirilmiş, temiz ve önceden soğutulmuş bir hücre

nitrogen-cavitation-differential-centrifugation-allows-for-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, hücre içi nükleotid ikinci haberci bağlayıcı proteinlerin sistematik yüksek verimli taraması için bir teknik olan ligand testinin diferansiyel radyal kılcal etkisini göstermektedir. Bu teknik, habercilerin hücre lizatındaki aşırı eksprese edilen hedef proteine doğrudan bağlanmasına izin verir - protein saflaştırma ihtiyacını atlar.

Ligand Testinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi: Bakteriyel Nükleotid İkinci Haberci Bağlayıcı Hücre İçi Proteinleri Tanımlamak İçin Yüksek Verimli Bir Teknik

Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Burada, bir proteinin floresan yoğunluğunu uygun bir iç standardınkine normalleştirerek, özellikle sentrozomlarda bir proteinin seviyesindeki değişiklikleri ölçmek için yeni bir kantitatif floresan testi geliştirilmiştir.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

Bu makalede, caenorhabditis elegans hücre dışı veziküller üretmek, arındırmak ve ölçmek için yöntemler sunar.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

Burada, elektron mikroskopisi ile birlikte yerli hücreli membran nanopartikül sistemini kullanan membran proteinlerinin oligomerik durumunun belirlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

Bu protokol, kapsüllenmiş insan hücrelerini 72 saate kadar canlı tutmak için bir NMR biyoreaktörünün kurulumunu ve ardından zamanla çözülmüş hücre içi NMR veri toplama ve analizini açıklar. Metodoloji, hücre içi protein-ligand etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak izlemek için uygulanır.

İnsan Hücrelerinde Protein-Ligand Etkileşimlerinin Yüksek Hücre Yoğunluklu Biyoreaktör Kullanarak Gerçek Zamanlı Kantitatif Hücre İçi NMR ile İzlenmesi

Bu makalede lipid membranlarının nötron spin eko (NSE) çalışmalarında örnek hazırlama, veri azaltma ve veri analizi protokolleri açıklanmaktadır. Lipitlerin judicious döteryum etiketlemesi, üzerinde hayati biyolojik süreçlerin meydana geldiği mezoskopik uzunluk ve zaman ölçeklerinde farklı membran dinamiklerine erişim sağlar.

Lipid Membran Dinamiği ve Membran-Protein Etkileşimleri için Benzersiz Bir Prob Olarak Nötron Spin Eko Spektroskopisi

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Öğrenin azot kavitasyonu ve diferansiyel santrifüj kullanarak kültürlü hücrelerde periferik membran proteinlerinin dağılımını deterjan kullanmadan analiz etmeyi. Bu yöntem endojen proteinlerin membran ve sitozolik fraksiyonlarda güvenilir şekilde tespit edilmesini sağlar.

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için (Video) | JoVE Journal

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

Daha fazla video keşfet