Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

Bu prosedürlerin genel amacı, normal gelişim sırasında embriyonik ve perinatal aort duvarlarının oluşumunu ve hastalık sırasında bu süreçteki bozulmaları incelemektir. Bu yöntem, embriyonik ve perinatal vasküler ortama katkıda bulunan hücrelerin kaynağının ne olduğu gibi vasküler gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniklerin temel avantajı, gelişimin embriyonik ve perinatal aşamalarında ortaya çıkan düz kas patogenezi ve morfogenezinin değerlendirilmesine izin vermesidir.

Bu tekniklerin anlamı, aşırı sumo hücre üretimine neden olan periyodik hastalığın supravalvüler aort darlığı gibi vasküler hastalıkların tedavisine yöneliktir. Mini pompa yerleştirme prosedürü, bir mikrocerrahi çekirdeğini ve Yale Üniversitesi'ni yöneten bir araştırma bilimcisi olan Dr.Jiasheng Zhang tarafından gerçekleştirilecektir. Cre ER ile iki ila altı aylık fareler ve bir cre raportörü ile fareler arasında çiftleşme çiftleri kurarak başlayın.

Metal bir prob kullanarak, her sabah vajinal tıkaç olup olmadığını kontrol edin ve bir tıkaç tespit edildiğinde dişiyi erkekten ayırın. Erken embriyonik indüksiyon için, hamile neme intraperitoneal olarak tamoksifen enjekte edin. Orta ila geç gebelik döneminde hücreleri işaretlemek ve doğum sonrası farede kaderlerini veya klonalitelerini izlemek için, progesteronu hamile nemin intraperitoneal boşluğuna bir ila iki doz oranında tamoksifen ile yetersiz bir şekilde enjekte edin.

Embriyoları uygun embriyonik tarihte toplamak için, hamile nemin karnını %70 etanol ile temizleyin ve rahmi çıkarmak için karnı açmak için makas kullanın. Embriyoları plasenta ve yumurta sarısı kesesinden dikkatlice ayırmak için forseps ve stereo mikroskop kullanarak uterustan toplayın. Embriyoları iki saat boyunca dört santigrat derecede% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.

Ardından fazla fiksatifi çıkarmak için PBS'de üç yıkama yapılır. Üçüncü yıkamadan sonra, embriyoları PBS'de% 30 sükroz içinde, embriyolar batana kadar 15 mililitrelik tüplerde ayrı ayrı inkübe edin. Daha sonra, plastik dondurma kalıplarını maksimum hacmin üçte ikisine kadar optimum kesme sıcaklığı bileşiği ile doldurun ve her kalıba dikey olarak bir embriyo yerleştirin.

Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, dokuları kuru buz% 70 etanol banyosunda dik olarak dondurun ve kriyostat sıcaklığını 22 santigrat dereceye ayarlayın. Her bir aortun tamamı boyunca 10 ila 20 mikrometre kalınlığında enine doku dilimleri oluşturmak için doku bloklarını bölümlere ayırın ve her bir bölümü elde edilirken bir cam mikroskop lamı üzerinde yakalayın. Tüm numuneler alındığında, 80 santigrat derece saklamadan önce slaytları oda sıcaklığında 30 dakika kurutun.

Doku örneklerini lekelemek için, slaytları oda sıcaklığında çözdürün, florofor ağartımını önlemek için ışıktan koruyun ve slaytları %0,1 PBS ikiz 20'de yıkayın. Klonal analiz için, dokuları uygun bir nükleer boya ile boyayın ve gökkuşağı cre raportörünün diğer fluroforlarını bir floresan mikroskobunda doğrudan görüntüleyin. Kader haritalaması için, mTmG cre raportörü ile, immün boyama ile veya immün boyama olmadan doğrudan görüntüleme ile GFP ifadesini görselleştirin.

Embriyonik bir aortu kültürlemek ve eksplant etmek için, embriyoyu sırtüstü pozisyona yerleştirin ve uzatılmış uzuvları stereo mikroskop altında bir diseksiyon tahtasına sabitleyin. Makas kullanarak, karından sternumdan üst göğsüne dikey bir kesi yapın. En ince trakeal akciğerleri, yemek borusunu, karaciğeri ve bağırsağı inceleyin.

Aortu torasik ve abdominal boşlukların dorsal yönünden uzaklaştırmak için makas kullanarak kalbi ventral olarak nazikçe çekmek için forseps kullanın. Aortu proksimal kökten ve distal karın pozisyonlarından kesin ve serbest bırakmak için hasat edilen aortu steril buz gibi PBS'ye bir hücre kültürü başlığına yerleştirin. Kısa bir yıkamadan sonra, aortu %0.5 PBS ile takviye edilmiş DMEM ortamı içeren 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna aktarın ve plakayı 24 saate kadar bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

İnkübasyonun sonunda, aortu PBS ile iki kez yıkayın ve dokuyu 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Üç PBS yıkamasından sonra, aortu doku batana kadar% 30 sukrosin PBS içeren 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Perinatal aort düz kas hücresi izolasyonu için, doğum sonrası gün 0.5 farenin sol ventrikülünü delmek için 23 gauge bir iğne kullanın ve iğneyi steril bir PBS içeren şırıngaya bağlamak için plastik boru kullanın, dikey olarak yüksek bir pozisyonda tutulur, böylece PBS yerçekimi ile sol ventriküle akar.

Karaciğer ağardığında, aortun dışındaki adventisyel dokuyu çıkarmak için forseps kullanın ve aortu gösterildiği gibi hasat edin. Aort dokusunu 500 mikrolitre sindirim solüsyonunda her beş ila 10 dakikada bir manuel çalkalayarak ayırın. 45 dakika sonra, tüpü steril bir hücre kültürü başlığına aktarın ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar doku bulamacını ezmek için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve ardından iki mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri üç mililitre düz kas hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri 35 milimetrelik bir kültür plakasına tohumlayın. Ardından, plakayı 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve hücre kültürü ortamını her üç günde bir yenileyin.

Deri altı ozmotik bir mini pompa yerleştirmek için, anestezi uygulanmış bir farenin alt sırtını makasla tıraş ederek başlayın ve fareyi ısıtılmış bir cerrahi plaka üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Sırtını betadin ve izopropil alkolle ovalayın ve fareyi stereo mikroskop altına yerleştirin. Ardından, alttaki kası yaralamadan, kuyruğun tabanına yaklaşık üç ila beş santimetre rostral 0,5 ila bir santimetre yatay cilt kesisi yapmak için bir neşter kullanın.

Kesizyona bir hemostat yerleştirin ve deri altı bir cep oluşturmak için hemostat çenelerini açıp kapatın. İlgilenilen ajanla dolu bir ozmotik mini pompayı cebe yerleştirin ve kesiyi kapatmak için 6 o emilmeyen sütür kullanın. Ardından, sternal yaslanma elde edilene kadar farenin izleme ile iyileşmesine izin verin.

Hücre dışı matriks proteini olan elastini kodlayan gen için mutant olan embriyolar, embriyonik gün 15.5'ten sonra başlayarak aortun iç katmanlarında fazla düz kas hücreleri biriktirir. Bu işlem sırasında düz kas hücrelerinin çok renkli cre raportör ile klonal analizi, hücrelerin çok renkli olduğunu ve dolayısıyla poliklonal olduğunu gösterir. İmmün boyama, ekekilen aort bölümleri, elastin mutant embriyonik gün 15.5 aortlarının, kültürden sonraki 18 saat içinde hiper müsküler ve stenodik hale geldiğini ortaya koymaktadır, bu süreç, bir anti antegrin beta üç bloke edici antikorun eklenmesiyle zayıflatılır.

Doğum günü 0.5'ten sonra vahşi tip farelerin aortundan izole edilen düz kas hücreleri, düz kas hücresi belirteçlerini eksprese eder, ancak CD31'i eksprese etmez. Embriyonik gün 13.5'ten itibaren hamile nemlere bir integrin beta üç inhibitörünün sürekli infüzyonu, hücre dışı matriks proteini elastin için mutant farelerde aort darlığını ve hiper kaslaşmayı önemli ölçüde azaltır. Ancak vahşi tip farelerin aortlarını değiştirmeyin.

Bir kez ustalaştıktan sonra, ozmotik mini pompa yerleştirme tekniği, uygun şekilde yapılırsa 10 dakikadan daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürleri takiben, bu yaklaşımlar, gastrointestinal sistem dokusu veya akciğer bölgeleri gibi düz kas kodlu, vasküler olmayan çalışmaları incelemek için de tahmin edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, in-vivo embriyonik uyum haritalama ve klonal analizin nasıl yapılacağını, ekilen embriyonik aortların, perinatal aort düz kas hücrelerinin ve eksplant subkutan ozmotik mini pompaların nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Fareler, tamoksifen ve sabit bir redüktör ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek ve ekstra özen göstermek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.