Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Bu biyo-kaydırma prosedürünün genel hedefleri, peptit yakalama ajanlarını ilgilenilen belirli bir protein hedefine hızlı bir şekilde izole etmek ve spesifik olmayan adayları daha sonraki aşağı akış analizinden hızlı ve etkili bir şekilde ortadan kaldırmaktır. Bu yöntem, biyolojik tehditlerin tespitinden hastalık teşhisine kadar çeşitli uygulamalar için sağlam peptit afinite reaktiflerinin keşfi için kullanılabilir. Bu tekniğin ana avantajı, peptit afinite reaktiflerinin, önemli miktarda eğitim olmaksızın yaklaşık bir hafta içinde hızlı bir şekilde izole edilebilmesidir.

Bu yöntem, hücre dışı kullanım için peptit afinite reaktiflerini keşfetmek için kullanılabilse de, peptitler canlı materyaller olarak da kullanılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler için en zor yön, burada gösterilen deneysel protokollerle yoğun bir şekilde etkileşime giren adayların aşağı akış dizi analizi olacaktır. Bakteriyel teşhir kitaplıklarının biyo-kaydırılması, boncuk malzemesine veya herhangi bir bağlı yakalama proteinine özgü olmayan bağlayıcıları çıkarmak için manyetik boncukların kendilerine karşı negatif sıralama ile başlayan döngüsel bir işlemdir.

Manyetik boncukları bağlamayan negatif fraksiyon korunmalıdır. Herhangi bir potansiyel çapraz reaktif protein hedefine karşı ek negatif sıralama yapılabilir ve manyetik boncukları bağlamayan negatif fraksiyon tekrar korunur. Sonraki pozitif sıralama adımları, bir protein hedefine karşı negatif sıralamaya çok benzer, ancak bu sefer manyetik boncuk bağlı pozitif fraksiyon korunur.

Bakteriyel teşhir kütüphanesinin pozitif olarak sınıflandırılması için, önce kloramfenikol veya LBCM-25 ile takviye edilmiş 500 mililitre Luria Broth Miller'ı, negatif sıralama ile istenmeyen peptitlerden önceden tükenmiş çeşitli bir bakteri teşhir sıralama kütüphanesinin yaklaşık bir kez 10 ila 11. hücreleri ile aşılayın. Kültür 0,5 ila 0,55 arasında bir OD 600'e ulaşana kadar kütüphaneyi 225 RPM'de 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra çalkalama ile 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca% 0.04 L-arabinoz ile peptit ekspresyonunu indükleyin.

İndüksiyon periyodunun sonunda, kültürü buzun üzerine yerleştirin. Ve santrifüjleme ile 11. bakteri hücresine iki kez on toplayın. Peleti hafif döndürme ile 1,5 mililitre PBS'de yeniden askıya alın.

Ve bakterileri ikinci bir santrifüjleme için gerektiği gibi birden fazla mikro santrifüj tüpüne bölün. Peletleri, dönen bir platform üzerinde dört santigrat derecede 45 dakikalık bir inkübasyon için ilgilenilen biyotinilasyon hedefi ile desteklenen bir mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin. Bu arada, 100 mikrolitre Streptavidin kodlu boncukları, santrifüjleme ile sığır serum albümini veya BSA ile desteklenmiş bir milimetre PBS'de yıkayın.

Yıkanmış boncukları bir tezgah üstü manyetik parçacık ayırıcıya yerleştirin ve peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek süper nadenti dikkatlice çıkarın. Dönen inkübasyonun sonunda, süper nadentteki herhangi bir bağlanmamış hedefi toplamak için hücreleri santrifüjleyin ve hedef proteine bağlı bakteri hücresi peletini bir mililitre PBS artı BSA'da yeniden askıya alın. Boncuk peletini yeniden askıya almak için tüm bakteri hücresi hacmini kullanın.

Dönen bir platform üzerinde dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından boncuk ve bakteri solüsyonunu buzun üzerine yerleştirin. Sistemi başlatmak için otomatik maksimum cihazını açın ve şimdi yıkayın, durulayın ve satırları sırasıyla üreticinin yıkama ve çalıştırma tamponlarıyla doldurmak için ayırma menüsünde çalıştırın.

Yıkamanın sonunda, PBS artı BSA tamponu kullanarak hatları bir kez daha astarlayın. Cihaz hazır olduğunda, bakteri ve boncuk karışımını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü ilave 500 mikrolitre taze PBS artı BSA ile durulayın. Bakteri ve boncuk karışımıyla yıkamayı çekin ve tüpü dört santigrat derece konik boru rafının numune yuvasına yerleştirin.

Boş 15 mililitrelik toplama tüplerini rafın pozitif ve negatif seçim yuvalarına yerleştirin ve rafı cihaz platformuna aktarın. Raftaki her numune için bir ayırma programı atayın, her numune arasına ve son numuneden sonra bir durulama adımı ekleyin. Hücre ayrımını başlatmak için çalıştır'ı seçin ve yeterli arabelleğin kullanılabilir olduğunu onaylamak için Tamam veya Devam Et'i seçin.

Program tamamlandığında, rafı çıkarın ve hem bakterileri hem de boncukları içeren pozitif fraksiyonu buzun üzerine yerleştirin. Hatları az önce gösterildiği gibi astarladıktan sonra, üreticinin çalıştırma ve yıkama tamponları ile, cihazı kapatmak için güç ve evet'i seçin ve dekontaminasyon için depolama çözeltisi şişesinde %70 etanol olduğunu onaylayın. Sistemin kapatılması tamamlandığında şişeler mor renkte olacaktır.

Makine kapatılabilir. Daha sonra, çalkalama ile 37 santigrat derecede gece boyunca kültür için D glikoz ile takviye edilmiş bir litre LBCM25'i aşılamak için tüm pozitif sıralama fraksiyonunu kullanın. Her sıralama turundan sonra afinite reaktif izolasyon başarısını analiz etmek için, sıralama sonrası peptit indüksiyonunun sonunda, tabloda gösterildiği gibi 25 mikrolitre çözeltiye beş mikrolitre indüklenmiş hücre ekleyin.

Buz üzerinde 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra, her çözeltideki bakterileri santrifüjleme ile toplayın ve her numuneden süper nadent'i aspire edin. Numune tüpleri buz üzerindeyken, FAX cihaz yazılımında yöneticiyi seçin ve uygun analiz klasörünü açın. Yeni deneme'yi tıklayın.

Ardından, denemeyi yeniden adlandırmak için sağ tıklayın ve genel çalışma sayfaları'nı tıklatın. Yeni bir dağılım grafiği oluşturmak için genel çalışma sayfası elektronik tablosundaki nokta grafiği simgesini tıklayın. Ardından nokta grafiğinin kendisini seçin ve denetçi simgesini seçin.

Eksenleri iki üstel bir görünüme ayarlamak için açık pencerede X ve Y eksenlerinin yanındaki kutuları tıklatın ve denetçi penceresini kapatın. Deneye tıklayın ve yeni bir örnek oluşturun, örneği deneysel olarak uygun şekilde yeniden adlandırmak için sağ tıklayın. Ardından, örneği genişletmek ve örneği yeniden adlandırmak için artı işaretine tıklayın.

Negatif bir kontrol numunesi çalıştırmak için, yalnızca PBS peletini 500 mikrolitre buz gibi soğuk FAX çalışan tamponda pippetting ile iyice karıştırarak yeniden süspanse edin. Numuneyi bir FAX tüpüne aktarın, hücreleri çözelti içinde tutmak için hafifçe vurun ve numuneyi cihazın numune enjeksiyon tüpüne veya SIT'e yükleyin. Mevcut numune tüpüne çift tıklayın ve elde edilen verilere tıklayın.

Ardından, olayları önceden hazırlanmış yan saçılma alanına karşı ileri saçılma alanı nokta grafiğinde görüntüleyin, negatif kontrol hücreleri merkeze yakın düşecek şekilde eşik sekmesinin altındaki foto çarpan tüp voltaj eşiğini gerektiği gibi ayarlayın. Örnek düzgün bir şekilde okunduğunda, akış hızını saniyede 200-2.000 olay gösterecek şekilde ayarlayın ve en az 10.000 olay yakalamak için kayıt verilerine tıklayın. Tüm olaylar elde edildiğinde, numune tüpünü SIT'ten çıkarın.

Çokgen geçidi simgesini seçin ve dağılım grafiğindeki hücre popülasyonunun çoğunluğunun etrafına bir geçit çizin. Nüfus hiyerarşisini göster'i seçmek için nokta grafiğine sağ tıklayın ve popülasyon hiyerarşisinde P1'e tıklayın ve P1 popülasyonunu görüntülemek için yeni bir nokta grafiği oluşturun. Y eksenini FITC alanına ve X eksenini ileri saçılma alanına değiştirmek için her eksene sağ tıklayın ve eksenleri iki üstel bir ekrana ayarlayın.

Negatif kontrol hücrelerini popülasyonun üst ve sol taraflarından mümkün olduğunca sıkı bir şekilde geçmek için çokgen kapısını kullanın ve popülasyon hiyerarşisinde P2'yi seçin, ters kapıyı seçmek için sağ tıklayın. Nüfusun% 1'inden daha azı kapının dışına çıkmalıdır. Popülasyonları göster'i seçmek için P2 kapısıyla nokta grafiğine sağ tıklayın ve görüntülenmek üzere P2 popülasyonlarını değil P2'yi seçin.

Ardından, istatistik görünümü oluştur'u seçmek için P2 kapısıyla nokta grafiğine sağ tıklayın ve istatistik görünümünü düzenle'yi seçmek için istatistik görünümü penceresine sağ tıklayın. Popülasyonlar sekmesi altında, P1 üst popülasyonu da dahil olmak üzere popülasyonları uygun şekilde ekleyin veya kaldırın. P2 ve P2 zaten gösterilmelidir.

Ardından istatistikler sekmesinin altında, FITC alan ortamını ve diğer ilgilenilen istatistikleri ekleyin ve pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklayın. P2 dağılım grafiğine sağ tıklayın ve PE alanı ile FSC alanı için benzer bir nokta grafiği oluşturmak için çoğalt'ı seçin. Y eksenini ayarlayın ve P3 popülasyonunu geçit etmek için tek başına PBS örneğini kullanın.

Ardından kapıyı ters çevirin. Ve uygun popülasyonları görüntüleyin. Uygun kapıların tümü ayarlandığında, tüp başına yaklaşık 10.000 olay kaydeden tüm örnekleri çalıştırmak için elektronik tabloyu kullanın.

Bu temsili deneyde olduğu gibi, Ypet Mona'nın sabit bir pozitif kontrol peptidine bağlanması, popülasyon içindeki indüklenmiş peptit kütüphanesinin ekspresyon seviyesinin izlenmesine yardımcı olabilir. Yüzeyde görüntülenen peptitlerden yoksun hücreler, genellikle üçüncü ve dördüncü turlarda gözlemlendiği gibi sıralama işlemi sırasında elimine edilir. İlgilenilen spesifik hedefe bağlanan peptitler için kütüphanenin zenginleştirilmesi tipik olarak üç pozitif sıralama turunda elde edilir.

Üçüncü turda zaten mevcut olan en yüksek afiniteli peptit dizilerinin dördüncü turda daha da zenginleştirilmesi ve potansiyel adayların seçimine yardımcı olması muhtemel olduğundan, dördüncü bir sıralama turuna devam etmek faydalı olabilir. Özgüllük, hedeflenen hedefe bağlanmayı, negatif sıralama için kullanılanlar gibi herhangi bir potansiyel çapraz reaktif hedefe bağlanma ile karşılaştırarak değerlendirilir. Dördüncü turdaki dizilerin analizi, tipik olarak, afinite ve özgüllük analizleri için mükemmel başlangıç noktaları olan tekrar eden dizileri ortaya çıkarır.

Tekrar eden dizilerin dizi hizalama analizi, adayların aşağı seçimine yardımcı olabilecek bir konsensüs dizisinin varlığını ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Her tekrar eden diziden temsili bir koloni daha sonra, hedef ve çapraz reaktif proteinlere peptit bağlanmasını değerlendirmek için hücre içi afinite ve özgüllük gerçekleri ile daha fazla analiz edilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, ilk afinite ve özgüllük analizi ile tam bir biyo deney, düzgün bir şekilde yürütülürse iki haftadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.

Tam prosedürü gerçekleştirirken, bağlama afinitesinde yer alan geçişi tam olarak anlamak için bağlama değerlendirmesi ve dizi analizleri arasında birkaç kez geçiş yapmanız gerekebileceğini unutmamak önemlidir. Peptit analizinin çoğunu otomatikleştirmek ve aday seçimini daha da kolaylaştırmak için geliştirdiğimiz ek bir makro dosyası dahil edildi. Bu videoyu izledikten sonra, peptit yakalama ajanlarının bir bakteri görüntüleme kütüphanesinden nasıl hızlı bir şekilde izole edileceğini ve spesifik olmayan adayların daha sonraki aşağı akış analizlerinden nasıl eleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü izledikten sonra, hücre bağlanma afinitesini ve özgüllüğünü doğrulamak için ALIZA gibi diğer yöntemler uygulanabilir.