Name: Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Öğrenin primer serebral korteks hücrelerinde sinir kök hücrelerinden nöron ve glial hücrelere doğru soy hattı ilerlemesini canlı görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem, sinir gelişimi süreçlerini uzun süreli gözlemleyerek araştırmacılara hücre davranışları hakkında detaylı bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), BURUNLARI (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) tarafından desteklenen ve FAPERN (Fundação de Amparo Pesquisa Rio Grande do Norte).

Bu protokolde açıklanan canlı hayvanları içeren tüm deneyler, Ulusal ve Uluslararası yasalara göre yürütülür ve 009/2014 lisansı altında yerel Üniversite Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (CEUA/UFRN) tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki protokol steril bir ortamda gerçekleştirilir. Temel hücre kültürüne aşinalık beklenir.
1. Dorsolateral Telencefalon Mikrodiseksiyonu
<ol>
	<li>Diseksiyon ortamını hazırlayın (100 mL): 98.5 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 0.5 mL 5 M HEPES pH 7.4, 1 mL penisilin / streptomisin (10.000 birim / mL ve 10.000 μg / mL).</li>
	<li>Diseksiyon ortamını filtreyle sterilize edin.</li>
	<li>İzofluran ile anestezi altında hamile bir fare C57 / Bl6'dan (Mus musculus) embriyonik gün 14 (E14) embriyolarını çıkarın. 
	NOT: E0'ı vajinal tıkaç tespit günü olarak düşünün. Diseksiyon, hamile fareden çıkarıldıktan sonra en geç 1 saat içinde tamamlanmalıdır. Bu protokol aynı zamanda E11-E17 embriyoları için de geçerlidir.</li>
	<li>Steril koşullar altında histerektomi ile embriyoları çıkarın.</li>
	<li>Embriyoları soğuk diseksiyon ortamı (4 °C) olan bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Uzunlamasına çatlak boyunca keserek beyinleri kafatasından çıkarın. Embriyo sayısı genellikle beş ila on arasında değişir. Her E14 beyni, progenitörler ve postmitotik nöronlar (1: 1 oranı) dahil olmak üzere yaklaşık 2 x 106 hücre verir 
	NOT: Aşağıdaki adımlar için stereomikroskobu kullanın.</li>
	<li>Diseksiyon forsepsleri kullanarak meninksleri çıkarın. Yarım küreleri ayırmak için telensefalonu ortadan bölün. Dorsolateral telensefalonu izole etmek için, diseksiyon forsepsleri kullanarak dorsomedial eğri ve pallial-subpallial sınır boyunca kesin. Dorsolateral telensefalonu, tüm beyinler diseke edilene kadar soğuk diseksiyon ortamı (4 ° C) olan 2 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
</ol>
2. Hücre Ayrışması ve Kaplaması
<ol>
	<li>Proliferasyon ortamını hazırlayın (50 mL DMEM +% 10 FCS): 44 mL Dulbecco Modifiye Eagle's Medium (DMEM), 5 mL Fetal Buzağı Serumu (FCS), 0.5 mL% 40 glikoz, 0.5 mL penisilin / streptomisin (10.000 ünite / mL ve 10.000 μg / mL). Proliferasyon ortamını filtreyle sterilize edin.</li>
	<li>Farklılaşma ortamı hazırlayın (50 mL DMEM +% 2 B27): 48 mL DMEM, 1 mL B27, 0.5 mL% 40 glikoz, 0.5 mL penisilin / streptomisin (10.000 birim / mL ve 10.000 μg / mL). Farklılaştırma ortamını filtreyle sterilize edin.</li>
	<li>Dorsolateral telensefalonun E14 farelerinden alınan mikro diseksiyonundan sonra, dokuyu çökeltmek için tüpü toplanan doku ve soğuk diseksiyon ortamı (4 ° C'de 5 dakika, 340 x g) ile santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle çıkarın ve kimyasal sindirim için 1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) Tripsin-EDTA (% 0.05) ekleyin. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Tripsin aktivitesini durdurmak için 2 mL proliferasyon ortamı ekleyin.</li>
	<li>Diyaframı biraz daraltmak için bir cam Pasteur pipetinin ucunu bir gaz brülörü veya Bunsen brülörü üzerinde birkaç saniye parlatın. Pipeti, ucu kaplamak için FCS'yi aspire ederek yıkayın. Kabarcıklardan kaçınarak, hücreleri ateşle parlatılmış ve FCS kaplı bir Pasteur pipeti ile mekanik olarak ayırın.</li>
	<li>Hücreleri santrifüjleyin (4 ° C'de 5 dakika, 340 x g). Süpernatanı bir pipetle çıkarın. 1 mL proliferasyon ortamı ekleyin ve bir pipet kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>% 0.4 Tripan Mavisi çözeltisi kullanarak hücre süspansiyonunun 1: 1 oranında seyreltilmesini hazırlayın. Canlı olmayan hücreler mavi olacaktır. Bir Neubauer odası kullanarak canlı hücrelerin (boyanmamış) sayısını sayın.</li>
	<li>106 hücre / mL elde etmek için hücreleri proliferasyon ortamında seyreltin. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna (yaklaşık 2.5 × 105 hücre /cm2) 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 CO2. 'de inkübe edin
	NOT: Deney sırasında hareket edebilecekleri ve gözlem alanını değiştirebilecekleri için cam lameller kullanmayın. Alternatif olarak, cam alt doku kültürü plakaları kullanın. 
	NOT: Hücre kültürü ile işlem görmüş çok tabaklı kullanmıyorsanız, plakalarınızı 37 °C'de 2 saat Poli-D-Lizin (50 μg/ml) ile ön işleme tabi tutmanız önemlidir. PDL ile muamele edilmiş plakalar, damıtılmış su ile yıkandıktan sonra 4 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>
3. Retroviral Aracılı Transfeksiyon
NOT: Bu, yalnızca progenitör hücreleri transfekte etmek için basit bir yöntemdir. Bununla birlikte, kültürlenmiş hücrelere ilgilenilen genleri eklemek için diğer viral vektörler veya kimyasal / elektriksel transfeksiyon kullanılabilir.
<ol>
	<li>Gen ekspresyonunu manipüle etmek ve hücreleri floresan raportör proteinlerle etiketlemek için, hücre kaplamasından 2 saat sonra ilgilenilen genlere sahip plazmitleri taşıyan retrovirüsleri ekleyin. 
	NOT: Retroviral vektörler yalnızca bölünen hücrelerin genomuna entegre olur. Bu nedenle, proliferasyonun yüksek olduğu durumlarda hücreleri enfekte etmek önemlidir. 
	NOT: Beta-aktin/CMV füzyon dizisini (CAG) ve bir dahili ribozomal giriş bölgesini (IRES) içeren bir plazmit ve ardından pCAG-IRES-GFP44 olarak adlandırılan yeşil floresan proteini (GFP) için kodlama dizisini kullandık. İlgilenilen genler, CAG promotörü ve IRES dizisi37 arasında klonlanabilir.</li>
	<li>İstenilen mL başına partikül sayısını elde etmek için retrovirüsü farklılaşma ortamında seyreltin. Her kuyucuğa retrovirüslü 500 μL farklılaşma ortamı ekleyin. 
	NOT: Kullanılan retrovirüslerin miktarı titresine bağlıdır ve oyuk başına 50 ila 100 enfekte hücre elde etmek için hesaplanmalıdır. Bu titre, izole edilmiş GFP eksprese eden klonların tanımlanmasına izin verir ve bunların ilişkisi, faz kontrast görüntülerinin izlenmesi ile daha da doğrulanabilir (bkz. bölüm 6). Retrovirüsün titrasyonu, aynı hücre popülasyonu45 kullanılarak gerçekleştirilmelidir.</li>
</ol>
4. Hızlandırılmış Video mikroskobu
NOT: Bu adım, inkübasyon hazneli ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu gerektirir (bkz. Malzeme Tablosu).
<ol>
	<li>Retrovirüs enfeksiyonundan sonra, doku kültürü plakasını sıcaklık ve CO2 kontrolörlerine bağlı bir inkübatöre yerleştirin. 
	NOT: Görüntülemeye başlamadan önce hazneyi 3 saat önceden ısıtmak, çekim sırasında kaymayı ve odak bozukluğunu en aza indirmeye yardımcı olabilir. 
	NOT: Oda, hücreleri 37 °C ve% 5 CO2 sabit koşullarında tutmalıdır.</li>
	<li>Sıfır noktası (XY = 0) görevi görecek XY ekseninde bir konum seçin. Bu, bir referansın gelecekte, örneğin görüntüleme sonrası immünositokimyadan sonra pozisyonları tekrar bulmasına izin verecektir (bkz. bölüm 5). 
	NOT: Plakaya sıfır noktasını belirlemek için referans olarak kullanılabilecek bir işaret çizilmesi tavsiye edilir.</li>
	<li>10X büyütmede görüntülenecek konumları seçin. 
	NOT: Retroviral olarak transfekte edilmiş hücreleri gözlemleme olasılığını artırmak için oyuk başına 10-15 pozisyon seçin. 
	NOT: Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için uzun mesafeli yüksek büyütme hedefleri (20X veya 40X) kullanılabilir. Hedeflerin çalışma mesafesine bağlı olarak, cam tabanlı plakalar gerekebilir.</li>
	<li>Fototoksisiteyi azaltmak için her 5 dakikada bir faz kontrast görüntüleri ve her 3 saatte bir floresan görüntüleri elde edin. Deneyin ilk 3 saatinde odağı kontrol edin ve ayarlayın, çünkü sıcaklık dengelenirken değişebilir. Odağı günlük olarak kontrol edin ve ayarlayın. 
	NOT: İlk 24 saatten sonra netlemenin stabil hale geldiğini gözlemliyoruz. Bununla birlikte, odağın izlenmesi tavsiye edilir. Alternatif olarak, yazılım tabanlı bir otomatik odaklama sistemi kullanın.</li>
	<li>7 gün sonra alımı durdurun ve görüntüleme sonrası immünositokimyaya geçin (bkz. bölüm 5).</li>
	<li>İmmünositokimyadan sonra, mikroskop inkübatöründeki plakayı değiştirin, sıfır noktasını bulun, XYZ = 0'ı sıfırlayın ve deneyi kaydedilen pozisyonlarla yeniden yükleyin. Uygun floresan filtreleri kullanarak her konumun floresan görüntülerini elde edin.</li>
</ol>
5. Görüntüleme Sonrası İmmünositokimya
<ol>
	<li>Kültürde 7 gün sonra, hücre kültürünü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 Paraformaldehit (PFA) fiksatif ile sabitleyin. 
	DİKKAT: PFA toksiktir ve kimyasal bir davlumbaz içinde kullanılmalıdır.</li>
	<li>0,5 mL PBS 0,1 M ile 5 dakika durulayın. 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>PBS 0.1 M. 'da% 0.5 triton ve% 10 normal keçi serumunda 4 ° C'de gece boyunca primer antikorlarda inkübe edin
	NOT: Nöronal fenotipi doğrulamak için anti-Mikrotübül İlişkili Protein 2 (MAP2) antikoru (fare IgG1, 1: 1,000) ve transdüksiyona uğrayan hücreleri etiketlemek için anti-GFP (tavuk antikoru, 1:500) kullanın. Progenitör veya glial hücreleri tespit etmek için başka antikorlar da kullanılabilir.</li>
	<li>0,5 mL PBS 0,1 M ile 5 dakika durulayın. 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>İkincil antikorları PBS 0.1 M'de% 0.5 triton ve% 10 normal keçi serumunda seyreltin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Önerilen seyreltme: 1: 1.000.</li>
	<li>0,5 mL PBS 0,1 M ile 5 dakika durulayın. 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Çekirdek boyama için, hücreleri PBS 0.1 M'de 0.1 μg / mL 4 "6" -diamino-2-fenilindion (DAPI) ile 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>0,5 mL PBS 0,1 M ile 5 dakika durulayın. 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri PBS 0.1 M'de tutun ve ışıktan koruyun (örneğin, plakayı folyo ile sarın).</li>
</ol>
6. Hücre İzleme
NOT: Burada, Malzeme Tablosu'nda verilen bağlantıda bulunan İzleme Aracı (tTt) yazılımını kullanarak hızlandırılmış video mikroskobu verilerini analiz etmek için ana adımları kısaca açıklıyoruz.
NOT: Görüntü alımı başka bir yazılımla gerçekleştirilirse, görüntü verilerini tTt yükleyicisinde bulunan tTt Converter ile içe aktarın (bağlantı Malzeme Tablosunda verilmiştir). Yalnızca png, tif veya jpg resim formatları kabul edilir. tTt Dönüştürücüyü başlattıktan sonra Şekil 1 A - B'de gösterilen adımları izleyin.
<ol>
	<li>tTt yazılımını başlatın ve bir kullanıcı adı seçin. "Kullanıcı ekle" ve "devam" düğmesine tıklayın (Şekil 2A). "TTTWorkFolder" (Şekil 2B) öğesini bulun ve seçin. Soy ağaçları, istatistikler ve dışa aktarılan görüntüler bu klasöre kaydedilecektir. Ardından, analiz edilecek deneyi seçin ve yükleyin (Şekil 2B).</li>
	<li>Görüntüler daha önce tTt Converter tarafından dönüştürülmüşse, "LogFileConverter" (Şekil 3A) üzerine tıklayın ve LogFileConverter penceresinde iki ardışık zaman noktası arasındaki saniye sayısını belirtin. "Tüm deney için günlük dosyalarını dönüştür" (Şekil 1C) üzerine tıklayın.</li>
	<li>tTt penceresinde görünen bir görüntü listesinde, manuel olarak yükleyerek veya programda görüntülenen seçeneği kullanarak istediğiniz görüntüleri seçin. Görüntüleri yükleyin (Şekil 3).</li>
	<li>Dosya > Yeni koloni > aç'ı seçin. İzlemeyi seçilen bir konumda başlatmak için "İzleme"ye ve ardından "İzlemeye Başla"ya tıklayın.</li>
	<li>Bir film penceresi görünecektir (Şekil 4). İzleme dairesini kullanarak hücreyi seçin ve 0 tuşuna basın. Yazılım bir sonraki kareye geçecektir. Fareyi kullanarak izleme çemberini izlenen hücrenin etrafına yerleştirmeye devam edin ve hücreye bir izleme işareti eklemek için her karede 0'ı tıklayın.</li>
	<li>Sırasıyla önceki veya sonraki kareye geçmek için 1 ve 3 tuşlarını kullanın. Bir parça işaretini silmek için, işaretlemek üzere doğru konuma tıklayın ve 0'a basın.</li>
	<li>Hücre bölünmüşse, "bölme" düğmesini seçin (Şekil 4'teki kırmızı dikdörtgen). Shift + D tuşlarına basarak bir alt hücreyi izlemeye devam edin. İkinci ek hücreyi izlemek için, hücre düzenleyicisinde hücreyi seçin ve F2 tuşuna basın.</li>
	<li>Hücre video mikroskobu sırasında öldüyse, "apoptoz" u seçin (Şekil 4'teki mavi dikdörtgen). 
	NOT: Yazılım olayı "apoptoz" olarak etiketlese de, hücre ölümünden başka mekanizmalar sorumlu olabilir.</li>
	<li>Hücre gözlem alanından ayrılırsa veya komşu hücrelerle karışırsa ve izlemeyi engellerse, "kayıp"ı seçin (Şekil 4'teki yeşil dikdörtgen).</li>
	<li>İzlemeyi durdurmak ve daha sonra devam etmek için "kesme"ye tıklayın (Şekil 4). 
	NOT: Hücre düzenleyici penceresinde, izleme sırasında bir ağaç oluşturulacaktır. Köken ağacını kaydetmek için Dosya'yı seçin > Geçerli ağaç > Kaydet'i seçin (Hücre düzenleyicisi penceresinde).</li>
	<li>Farklı bir hücreyi izlemeye başlamak için, farenin sağ tuşunu kullanarak hücreye tıklayın veya farenin sol düğmesini kullanarak hücreyi seçin ve İzlemeye Başla'> tıklayın.</li>
	<li>Filmi izleme verileriyle dışa aktarmak için yazılımın "izleme modunda" olmaması gerekir. İzleme modunu kapatmak için 6.10 adımını uygulayın. Film penceresinde Filmi Dışa Aktar>ı seçin. Biçimi, kare aralığını, saniyedeki kare sayısını ve bit hızını ayarlayın. "Dışa aktarmayı başlat" ı tıklayın.</li>
</ol>
7. Nicelikler
NOT: Video mikroskobu data46 kullanılarak çeşitli ölçümler yapılabilir. Burada, daha sonra "temsili sonuçlar" bölümünde örneklenen üç olasılığı açıklıyoruz.
<ol>
	<li>Farklı zaman noktalarında canlı olan hücre sayısını, bu zaman noktalarına ulaşılmadan önce üretilen toplam hücre sayısına tek tek clones37 içinde bölerek her hücre soyu için hücre sağkalımını ölçün.</li>
	<li>Simetrik progenitör (SP, her iki yavru hücre de çoğalmaya devam eder), asimetrik (A, bir yavru hücre çoğalmaya devam eder ve diğeri postmitotik olur) veya simetrik terminal (ST, her iki yavru hücre de postmitotik hale gelir) oranını ölçün15,38.</li>
	<li>Çoğalan hücrelerin nesilleri ve bölünmeleri arasındaki zaman aralığını hesaplayarak hücre döngüsü uzunluğunu ölçün15.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Gerçek zamanlı gözlem Primer serebral korteks hücre hücre çoğalması analizi, hücre bölünmesi, hücre döngüsünün uzunluğu, hücre farklılaşma ve hücre hayatta kalma3,14,15,37modu sağlar. Daha da önemlisi, bu tek hücreli soy, NSCs üzerinden ilerleme nöronlar3sırasında yürürlüğe giren ara aşama tanımlaması için önde gelen çalışma izin verir. Son olarak, gen ekspresyonu işleme...

Sinir kök hücreleri (NSC) serebral korteks geliştirme sırasında neurons ve macroglial hücreleri oluşturur. Erken-corticogenesis, NSCs birkaç tur simetrik hücre bölünmesi geçmesi ve progenitör havuzu genişletin. Sonra NSCs nöronlar ara ürün1ile doğrudan veya dolaylı olarak oluşturmak için asimetrik olarak bölün. Sadece orta - için geç-corticogenesis,2,3,4astrocytes ve oligodendrocytes oluşturmak için ataları geçin. Ancak, hücre çoğalması ve farklılaşma gibi kader tarafından kısıtlanmış ataları benzersiz türde nöronlar ve macroglial hücreleri nesil katkısını kontrol tam mekanizmaları meselesi yoğun tartışmalar4,5,6kalır. Nöronlar, astrocytes ve oligodendrocytes oluşturmak için bireysel kortikal NSCs potansiyelini kapsamlı bir şekilde okudu vitro ve in vivo gibi sayısız teknikler kullanarak olmuştur: tek hücre kültürleri7,8,9,10,11,12,13; görüntüleme yaşamak yüksek yoğunluklu kültürler kültürler3,14,15' te görüntüleme canlı; dilim kültürler16,17,18içinde görüntüleme canlı; viral vektör-aracılı genetik yüksek yoğunluklu kültürler14,15,19,20,21' etiketleme klonal analizi; klonal analiz vivo içinde retrovirüsü22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33kullanarak; ve Transjenik hayvanlar34klonal analiz vivo içinde kullanma.
Bu tekniklerin herbirini artılarını ve eksilerini sunar. Örneğin, in vivo soy izleme bireysel kortikal ataları potansiyeli hakkında çelişkili sonuçlar için önde gelen topaklanmasını bölme hataları ve3, duyarlı olduğunu. Ayrıca, hem içinde in vitro ve in vivo çalışmalar progenitör hücrelerin erken zaman noktalarda etiketleme üzerinde temel ve posterior analizi hücre soy soy-ilerleme35sırasında hücre ölümü tespit edilmeden oluşumu tarafından etkilenebilir. Bu nedenle, tek NSCs potansiyelini analiz etmek için uygun bir sistem tüm hücreleri oluşturulan tanımlaması, hem de hücre kaderi lineage içinde uygun karakterizasyonu izin vermesi gerekir. Birincil hücre kültürü ve canlı görüntüleme bu ayarı sağlar. Tek hücre kültür ve hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak, tapınak ve ark. göstermiştir geçiş gliogenesis11neurogenesis üzerinden bireysel serebral korteks ataları soyundan içinde. Daha sonra nöronların farklı türleri tek kortikal progenitör12den oluşturulur göstermek için aynı sistem kullanılır. Ancak, bu sistemi önemli bir uyarı sunar: %1 kortikal ataları erken corticogenesis izole klonlar 4 veya daha fazla döl9oluşturmak sadece. FGF2 eklenmesinden sonra 8-%109' a 4 veya daha fazla hücre üreten hücreleri sıklığı artar. Yine de, bu hemen hemen tüm kortikal ataları proliferatif bu aşamada düşünüldüğünde çok küçük bir sayıdır. Ayrıca, kader-teknik FGF2 potansiyel etkileri36yönetilen olamaz. Bu sınırlamaları aşmak için biz hızla çoğalmak-in her ikisi Ventriküler (Pax6 ifade etme) destek yüksek yoğunluklu hücre kültürlerinde kullanılan ve subventricular (Tbr2-ifade) kortikal ataları15. Ayrıca, gerçek zamanlı gözlem bu kültürlerin çeşitli özellikler NSC lineage progresyon3,15bu koşullar altında hücre bölünmesi, hücre döngüsü uzatma, sinir hücreleri ve glia, diğerleri arasında oluşturmak için potansiyel tek hücre modu gibi çoğaltılabilir göstermiştir. Son zamanlarda, biz de CREB sinyalli fareler37nöronlarda olgunlaşmamış serebral korteks hücre yaşama etkiler göstermek için bu sistemi kullandık. Böylece, biz inanıyoruz Bu hızlandırılmış video mikroskobu birincil fare serebral korteksin yüksek yoğunluklu yetiştirilen hücrelerin hücre döngüsü progresyon hücresel ve moleküler mekanizmaları, hücre bölünmesi, hücre hayatta kalma ve hücre kader belirtimi modu çalışmaya bir araçtır güçlü ve erişilebilir. İkinci Transjenik hayvanlar, belirli hücre kaderi gerçek zamanlı38,39,40 tanımlaması veya immunocytochemistry3,38,41,42sonrası Imaging kullanım izin kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Burada, Primer serebral korteks hücre kültürü destekleyen NSCs yayılması ve nöronlar ve macroglial hücreleri sonraki nesil hazırlamak için adım adım bir protokol sağlar. Biz de tespit ve hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak tek hücre düzeyinde izlenen bireysel hücrelerin gen ekspresyonu işlemek için transfection retroviral aracılı kullanımı tartışıyorlar. Bu protokolü en başından sonuna kadar corticogenesis Rodents izole Primer serebral korteks hücreleri çalışma için kullanılabilir, ama bir kaç ayarlama göre sahne14gerekli olabilir. 2D kültürlerin time-lapse video mikroskobu kullanarak diğer kaynaklardan izole NSCs da okudu olabilir ama uygun kodlamayla sistemi cep davranışları vitro ve in vivo38,43karşılaştırarak tespit edilmelidir.

<table><tbody><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Canlandırıcı Yaşam Teknolojileri</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>tripsin-EDTA (% 0.05)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2, fare</td><td>Sigma</td><td>M4403</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP tavuk</td><td>Aves</td><td>0511FP12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavuk alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTt</td><td>ETH Zürih</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre gözlemci mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzleme Aracı (tTt) yazılımı</td><td></td><td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td><td>indirme bağlantısı</td></tr></tbody></table>

primer serebral korteks hücre bir 2d kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Serebral korteks geliştirme sırasında progenitör hücrelerin yeni ataları veya postmitotic nöronlar oluşturmak için simetrik ve asimetrik hücre bölümler birkaç tur tabi. Daha sonra bazı ataları gliogenic kadere bağlı, astrocyte ve oligodendrocyte nüfus ekleme geçin. Primer serebral korteks hücre kültürleri, hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak, hücre bölünmesi modu ve progenitör hücre hücre döngüsü parametreleri kontrol hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek mümkündür. Benzer şekilde, kader postmitotic hücrelerinin hücre özgü floresan muhabir proteinler kullanarak veya immunocytochemistry sonrası Imaging incelenebilir. Daha da önemlisi, tüm bu özellikler belirli hücre tiplerinin üretimi için taahhüt ataları tanımlaması sağlayan tek hücreli düzeyinde analiz edilebilir. Gen ifadesinin manipülasyon da hücre özerk ve hücre özerk olayların çalışma izin transfection, viral aracılı kullanarak gerçekleştirilebilir. Son olarak, seçili proteinler simetrik ve asimetrik dağıtım sırasında bölünme ve kızı hücreleri kaderi ile korelasyon çalışma füzyon floresan proteinler kullanımına izin verir. Burada, birkaç gün kadar Primer serebral korteks fare hücreler için görüntü ve hücre bölünmesi, hücre döngüsünün uzunluğu ve kader yeni oluşturulan hücre modu çözümlemek için hızlandırılmış video-mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz de genlerin ilgi yönetmek veya sadece muhabir proteinler hücrelerle etiket için uygulanan progenitör hücre transfect için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

E14 embriyolarından izole edilen serebral korteks hücrelerinin primer kültürleri hem progenitör hem de nöronal hücreler içerir. Görüntüleme süreci boyunca progenitörler birkaç tur hücre bölünmesi geçirerek hücre sayısını artırırlar (Şekil 5 ve Video Şekil 1).
Birkaç progenitör hücrenin retroviral aracılı transfeksiyonu, hücre klonlarının tanımlanmasını kolaylaştırır (<strong class="...

Canlı görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel davranışlarını incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, hızlandırılmış video-ayrıntılı bir inceleme, birincil sinir kök hücreleri farklı nöronlar ve glia lineage ilerleme sırasında yürürlüğe giren aşamaları sağlayan mikroskobu Primer serebral korteks hücre için bir protokol açıklayın.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Bu deneyin genel amacı, nöral kök hücrelerden nöronlara veya glial hücrelere doğru soy hattı ilerlemesi sırasında hücre davranışlarını gözlemlemektir. Bu yöntem, simetrik ve asimetrik hücre bölünmelerinin rolü, hücre döngüsünün uzaması ve hücre büyüme hızları gibi nörogelişimsel alandaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre soy hattının uzun süreler boyunca gözlemlenmesine olanak tanımasıdır.Bu durum, tek bir soy hattı içerisinde nörojenezden glial geneze geçişin gözlemlenmesine ve sublineer nöral ile glial öncü hücrelerin doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır. Soğuk diseksiyon ortamı içeren bir Petri kabı içerisinde 5 ila 10 adet e14 embriyosunun beyinlerini çıkararak başlayın. Deriyi ve kafatasını dikkatlice çekip çıkarmak ve beyinleri izole etmek için pens kullanın.Stereo mikroskop altında çalışırken, meninges'leri çıkarmak için diseksiyon pensi kullanın. Ardından, hemisferleri ayırmak için telensefalonu ortadan ikiye bölün. Dorsolateral telensefalonu izole etmek için, dorsomedial eğri ile pallium ve subpallium sınırı boyunca kesin.Tüm beyinler diseke edilene kadar, dorsolateral telensefalonları buz üzerinde diseksiyon ortamı içeren 2mL'lik bir tüpe aktarın. Dorsolateral telensefalonun mikro-diseksiyonundan sonra, dokuyu 15mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Ardından, dokuyu çöktürmek için soğuk diseksiyon ortamındaki toplanmış dokuyu içeren tüpü, dört derece santigrat sıcaklıkta ve 340 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüj işleminden sonra, süpernatanı bir pipetle alın ve kimyasal sindirim için 1mL 37 °C'de %0,05 Trypsin-EDTA ekleyin. 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, Trypsin aktivitesini inhibe etmek için 2mL proliferasyon medyumu ekleyin.Ardından, açıklığı hafifçe daraltmak için bir cam Pasteur pipetinin ucunu bir gaz brülörü veya bunsen brülörü üzerinde birkaç saniye boyunca ısıtın. Pipetin ucunu kaplamak için FCS aspire edin. Daha sonra, kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek, ateşle cilalanmış ve FCS ile kaplanmış Pasteur pipetiyle yukarı-aşağı pipetleme yaparak hücreleri mekanik olarak ayrıştırın.Ayrıştırılmış hücreleri 4 °C'de 340 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı bir pipet yardımıyla uzaklaştırın, ardından 1 mL proliferasyon medyumu ekleyin ve hücreleri pipet kullanarak tekrar süspande edin. Poly-D-Lysine ile ön işlem görmüş plakadaki PBS'yi uzaklaştırın. Daha sonra, sıfır noktasını belirlemek için referans olarak kullanılabilecek bir işareti plakanın altına çizin.Hücreleri ikinci kez proliferasyon ortamında resüspanse ettikten sonra, %0,4 trypan blue çözeltisi kullanarak hücre süspansiyonunun bire bir dilüsyonunu hazırlayın. Sayım odası lamlarına yükleyin ve boyanmamış canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Canlı olmayan hücreler mavi renkte olacaktır.Milimetre başına 10⁶ hücre elde etmek için hücreleri proliferasyon ortamında seyreltin. 24 kuyucuklu bir doku kültürü plağının her kuyucuğuna 500 µL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksitte inkübe edin. Retrovirüsle transdukse edilmiş hücreleri görüntülemek için, hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit sabit koşullarında tutmak amacıyla doku kültürü plağını sıcaklık ve karbondioksit kontrolörlerine bağlı bir görüntüleme odasına yerleştirin.Sıfır noktası olarak hizmet edecek bir xy ekseni konumu seçin ve sıfır noktasını kalibre edin. Kuyu başına, 10 kat büyütmede görüntülenmek üzere 10 ila 15 konum seçin. Fototoksisiteyi azaltmak için yazılımı her beş dakikada bir faz kontrast görüntüleri ve her üç saatte bir floresan görüntüleri alacak şekilde ayarlayın.Sıcaklık dengelenirken odak değişebileceği için deneyin ilk üç saatinde odağı kontrol edin ve ayarlayın. Yedi gün sonra görüntülemeyi durdurun ve görüntüleme sonrası immünositokimyaya geçin. Hücre takip yazılımını başlatın ve bir kullanıcı adı seçin.Kullanıcı adınızı seçin ve devam edin. Soy ağaçlarını, istatistikleri ve dışa aktarılan görüntüleri kaydetmek için tTt çalışma klasörüne göz atın ve bu klasörü seçin. Ardından, analiz edilecek ve yüklenecek deneyi seçin.Görüntüler daha önce tTt dönüştürücü ile dönüştürüldüyse, günlük dosyası dönüştürücüye tıklayın ve günlük dosyası dönüştürücü penceresinde iki ardışık zaman noktası arasındaki saniye sayısını belirtin. Tüm deney için günlük dosyalarını dönüştür seçeneğine tıklayın. İstenen görüntüleri manuel olarak veya programda görüntülenen seçeneği kullanarak seçin ve yükleyin.Dosya seçin, açın, yeni koloni. Seçilen konumda izlemeyi başlatmak için önce izleme (tracking) seçeneğine, ardından izlemeyi başlat (start tracking) seçeneğine tıklayın. Bir video penceresi açılacaktır.İzleme dairesini kullanarak hücreyi seçin ve sıfır tuşuna basın. Yazılım bir sonraki kareye geçecektir. Fareyi kullanarak izleme dairesini izlenen hücrenin etrafına yerleştirmeye devam edin ve hücreye bir izleme işareti eklemek için her karede sıfır tuşuna tıklayın.Önceki veya sonraki kareye geçmek için bir ve üç tuşlarını kullanın. Bir takip işaretini silmek için, işaretlenecek doğru konuma tıklayın ve sıfır tuşuna basın. Eğer hücre bölünmüşse, takip (tracking), durdurma nedeni (stop reason), bölünme (division) seçeneklerini seçin; ardından hücre düzenleyici penceresindeki hücrelerden birini seçerek bir yavru hücreyi takip etmeye devam edin ve takip (tracking), takibi başlat (start tracking) seçeneklerini seçin.İkinci kız hücreyi takip etmek için, hücre düzenleyicide bu hücreyi seçin ve F2 tuşuna basın. Eğer hücre video mikroskopi sırasında öldüyse, apoptosis seçeneğini belirleyin. Hücre gözlem alanından çıkarsa veya takip edilmesini engelleyecek şekilde komşu hücrelerle karışırsa, lost seçeneğini belirleyin. Takibi durdurup daha sonra devam etmek için interrupt seçeneğine tıklayın.Hücre düzenleyici penceresinde, izleme sırasında bir soy ağacı oluşturulacaktır. Soy ağacını kaydetmek için hücre düzenleyici penceresinden dosya, kaydet, mevcut ağaç seçeneklerini belirleyin. İzleme verileriyle birlikte videoyu dışa aktarmak için izleme modunu kapatın ve video penceresinden videoyu dışa aktar seçeneğini belirleyin.Kare format aralığını, saniyedeki kare sayısını ve bit hızını ayarlayın. Dışa aktarımı başlat'a tıklayın. Aşağıdaki fotomikroğraflar, primer serebral korteks hücre kültürünün GFP floresan görüntülerindeki faz kontrastını göstermektedir.Görüntülemenin ilk saatlerinde GFP ekspresyonu görülmez. GFP eksprese eden hücrelerin sayısı zamanla artar ve bu görüntülerdeki sarı okla belirtildiği üzere GFP floresansının yoğunluğu artış gösterir. Önceki görüntüdeki kutu içine alınmış bölgenin bu yüksek büyütmeli görüntüsü, GFP eksprese eden hücreleri detaylı olarak göstermektedir.Bu faz kontrast görüntüleri, hücre bölünmesine dair bir örneği göstermektedir. Burada öncül hücrelerin yuvarlaklaşması, ardından hücre membranı daralması ve son olarak mitozun tamamlanması görülmektedir. Bu, tek bir hücre soy hattı ağacı örneğidir.Renkli oklar farklı hücre bölünme modlarını göstermektedir; sarı ok simetrik proliferatif bölünmeyi belirtir. Asimetrik bölünme mavi ok ile gösterilmiştir. Simetrik terminal bölünme kırmızı ok ile gösterilmiştir ve X hücre ölümünü ifade eder.Sayılar, progenitör hücrelerin hücre döngüsü uzunluğunu belirtmektedir. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kök hücrelerin nöronlara veya glial hücrelere dönüşüm sürecindeki hücre davranışlarının nasıl gösterileceğine dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

live-imaging-primary-cerebral-cortex-cells-using-2d-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Organel ticareti dinamiklerini inceleyerek canlı hücre görüntüleme özellikle yardımcı programı. Burada geniş alan floresan mikroskobu kullanarak kültürlü nöronların yoğun çekirdekli veziküller canlı görüntüleme için bir protokol. Bu protokol, esnek ve diğer organeller gibi mitokondri gibi görüntü adapte edilebilir, endosomes ve peroksizomlara.

İlköğretim Kültür Hipokampal Nöronlar Yoğun çekirdekli veziküller Canlı Görüntüleme

Burada kültür sıçan kortikal nöronların glial besleyici tabakasının varlığı için bir protokol sağlar. Kültürlü nöronlar polarite kurmak ve sinapslar oluşturmak ve glia elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme, hücre sağkalım deneyleri, immünhistokimya ve RNA / DNA / protein izolasyonu gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmak üzere ayrılabilir.

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Bu video, fare embriyolarının dorsolateral telensefalonundan birincil serebral korteks hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için bir protokolü göstermektedir.

Fare Embriyo Dorsolateral Telenefalonlarından Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Source: Gómez-Villafuertes, R., et. al., canlı görüntüleme ve ardından hücre biyolojisini ve çoklu nöral popülasyonların soy ilerlemesini izlemek için tek hücre izleme. J. Vis. Exp. (2017) Video, hücresel çalışmayı incelemek için yetişkin nöral kök hücreleri gerçek zamanlı olarak hazırlama, görüntüleme ve izleme sürecini göstermektedir bölme ve farklılaşma dahil olmak üzere davranışlar.

 Yetişkin Nöral Kök Hücrelerde Nöral Kökeni İzlemek için Canlı Görüntüleme ve Tek Hücreli İzleme

Kaynak: Landeira, B. S.,et al., Primer Serebral Korteks Hücrelerinin 2D Kültür Sistemi Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017)Video, floresan etiketli kortikal progenitörleri izlemek, bölünmelerini ve farklılaşmalarını izlemek ve birincil serebral korteks hücrelerinde soy gelişimini incelemek için hızlandırılmış görüntülemenin kullanımını...

Transfekte Edilmiş Primer Fare Serebral Korteks Hücrelerinin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Karsinom hücreleri ile Organotipik beyin kesit kokültürü beyin dokusu karsinoma hücre istilası sürecinde floresan gibi parlak saha (video) mikroskopisi ile görselleştirme morfolojik değişiklikler sağlar. Bu model sistem ayrıca hücre değişimi ve ikmal yaklaşımlar sağlar ve manipülasyonlar ve analizlerin bir yelpazede sunuyor.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Sinirsel nüfus tarafından hızlandırılmış video mikroskobu esaslı bilgisayar yazılımı Post-processing takip izlemek için sağlam bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem canlı görüntüleme deneyler sırasında seçili bir popülasyondaki biyolojik olayları tanımlamak için güçlü bir araç temsil eder.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

Bu iletişim kuralı thalamocortical akson dallanma ve synapse oluşumu organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks eşzamanlı görüntüleme için bir yöntemi açıklar. Bireysel thalamocortical akson ve presynaptic onların terminalleri bir tek hücre çoğalmasıyla tekniği ile DsRed ve synaptophysin GFP öğesini tarafından görüntülenmiştir.

Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Öğrenin primer serebral korteks hücrelerinde sinir kök hücrelerinden nöron ve glial hücrelere doğru soy hattı ilerlemesini canlı görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem, sinir gelişimi süreçlerini uzun süreli gözlemleyerek araştırmacılara hücre davranışları hakkında detaylı bilgi sağlar.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

Daha fazla video keşfet