Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

Bu deneyin genel amacı, nöral kök hücrelerden nöronlara veya glial hücrelere soy ilerlemesi sırasında hücre davranışlarını gözlemlemektir. Bu yöntem, simetrik ve asimetrik hücre bölünmelerinin rolü, hücre döngüsü uzaması ve hücre büyüme hızları gibi nörogelişimsel alandaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre soyunun uzun süreler boyunca gözlemlenmesine izin vermesidir.

Bu, tek bir soy içinde nörojenezden glial geneze geçişin gözlemlenmesine ve sublineer nöral ve glial progenitörlerin doğrudan bir kombinasyonuna izin verir. Beyinleri 5 ila 10 e14 embriyosundan soğuk diseksiyon ortamı ile bir Petri kabında çıkararak başlayın. Cildi ve kafatasını dikkatlice çıkarmak ve beyinleri izole etmek için forseps kullanın.

Stereo mikroskop altında çalışırken, meninksleri çıkarmak için diseksiyon forseps kullanın. Ardından, yarım küreleri ayırmak için telensefalonu ortadan bölün. Dorsolateral telensefalonu izole etmek için, dorsomedial eğri ve pallio ve subpallium sınırı boyunca kesin.

Dorsolateral telensefalonları, tüm beyinler diseke edilene kadar buz üzerinde diseksiyon ortamı olan 2 mL'lik bir tüpe aktarın. Dorsolateral telensefalonun mikro diseksiyonundan sonra, dokuyu 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra, toplanan dokuyu içeren tüpü, dokuyu çökeltmek için dört santigrat derecede ve 340 kez G'de beş dakika boyunca soğuk diseksiyon ortamında santrifüjleyin.

Döndürmeden sonra, süpernatanı bir pipetle çıkarın ve kimyasal sindirim için 1 mL 37 santigrat derece %0.05 Tripsin-EDTA ekleyin. 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, Tripstik aktiviteyi inhibe etmek için 2 mL proliferasyon ortamı ekleyin.

Ardından, diyaframı biraz daraltmak için bir cam Pasteur pipetinin ucunu bir gaz brülörü veya bunsen brülörü üzerinde birkaç saniye parlatın. Pipetin ucunu kaplamak için FCS'yi sertleştirin. Ardından, kabarcık oluşturmamaya dikkat ederken yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ateşle parlatılmış ve FCS kaplı Pasteur pipeti ile mekanik olarak ayırın.

Ayrışmış hücreleri 340 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipetle çıkarın, ardından bir milimetre proliferasyon ortamı ekleyin ve bir pipet kullanarak hücreleri yeniden süspanse edin. PBS'yi Poli-D-Lizin ile ön işleme tabi tutulmuş plakadan çıkarın. Ardından, plakanın altına sıfır noktasını belirlemek için referans olarak kullanılabilecek bir işaret çizin.

Hücreleri proliferasyon ortamında ikinci kez yeniden süspanse ettikten sonra,% 0.4'lük bir tripan mavisi çözeltisi kullanarak hücre süspansiyonunun bire bir seyreltmesini hazırlayın. Sayma odası slaytlarına yükleyin ve boyanmamış canlı hücrelerin sayısını sayın. Canlı olmayan hücreler mavi olacaktır.

Milimetre başına 10 ila altıncı hücre elde etmek için hücreleri proliferasyon ortamında seyreltin. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Retrovirüs ile dönüştürülmüş hücreleri görüntülemek için, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit sabit koşullarında tutmak için doku kültürü plakasını sıcaklık ve karbondioksit kontrolörlerine bağlı bir görüntüleme odasına yerleştirin.

Sıfır noktası görevi görmesi için xy ekseninde bir konum seçin ve sıfır noktasını kalibre edin. 10 kat büyütmede görüntülenecek kuyu başına 10 ila 15 konum seçin. Yazılımı, fototoksisiteyi azaltmak için her beş dakikada bir faz kontrast görüntüleri ve her üç saatte bir floresan görüntüleri gerektirecek şekilde ayarlayın.

Deneyin ilk üç saatinde odağı kontrol edin ve ayarlayın, çünkü sıcaklık dengelenirken değişebilir. Yedi gün sonra, edinimi durdurun ve görüntüleme sonrası immünositokimyaya geçin. Hücre izleme yazılımını başlatın ve bir kullanıcı adı seçin.

Kullanıcı adınızı seçin ve devam edin'e tıklayın. Köken ağaçlarını, istatistikleri ve dışa aktarılan görüntüleri kaydetmek için tTt çalışma klasörüne göz atın ve seçin. Ardından, analiz edilecek ve yüklenecek denemeyi seçin.

Görüntüler daha önce tTt dönüştürücü tarafından dönüştürüldüyse, günlük dosyası dönüştürücüsüne tıklayın ve günlük dosyası dönüştürücü penceresinde ardışık iki zaman noktası arasındaki saniye sayısını belirtin. Tüm deney için günlük dosyalarını dönüştür'e tıklayın. İstediğiniz görüntüleri manuel olarak veya programda görüntülenen seçeneği kullanarak seçin ve yükleyin.

Dosya, aç, yeni koloniyi seçin. İzlemeyi seçilen bir konumda başlatmak için izlemeye ve ardından izlemeye başla'ya tıklayın. Bir film penceresi açılacaktır.

İzleme dairesini kullanarak hücreyi seçin ve sıfır tuşuna basın. Yazılım bir sonraki kareye geçecektir. Fareyi kullanarak izleme çemberini izleme hücresinin etrafına yerleştirmeye devam edin ve hücreye bir izleme işareti eklemek için her karede sıfıra tıklayın.

Önceki veya sonraki kareye geçmek için birinci ve üç tuşlarını kullanın. Bir parça işaretini silmek için, işaretlemek üzere doğru konuma tıklayın ve sıfıra basın. Hücre bölünmüşse, izleme, durdurma nedeni, bölme'yi seçin ve hücre düzenleyicisi penceresindeki hücrelerden birini seçerek bir ek hücreyi izlemeye devam edin, ardından izlemeyi seçin, izlemeye başlayın.

İkinci ek hücreyi izlemek için, hücre düzenleyicisinde hücreyi seçin ve F2 tuşuna basın. Hücre video mikroskobu sırasında öldüyse, apoptozu seçin. Hücre gözlem alanından çıkarsa veya komşu hücrelerle karışarak izlemeyi engellerse, kayıp'ı seçin. İzlemeyi durdurmak ve daha sonra devam etmek için kes'e tıklayın.

Hücre düzenleyici penceresinde, izleme sırasında bir ağaç oluşturulacaktır. Köken ağacını kaydetmek için, hücre düzenleyici penceresinde dosya, kaydet, geçerli ağaç'ı seçin. Filmi izleme verileriyle birlikte dışa aktarmak için izleme modunu kapatın ve film penceresinde filmi dışa aktar'ı seçin.

Kare biçim aralığını, saniyedeki kare sayısını ve bit hızını ayarlayın. Dışa aktarmayı başlat'a tıklayın. Aşağıdaki fotomikrograflar, birincil serebra korteks hücre kültürünün GFP floresan görüntülerinde faz kontrastını göstermektedir.

Görüntülemenin ilk saatlerinde GFP ekspresyonu yoktur. GFP eksprese eden hücrelerin sayısı zamanla artar ve bu görüntülerde sarı okla gösterildiği gibi GFP floresansının yoğunluğu artar. Önceki görüntünün kutulu bölgesindeki bu daha yüksek büyütmeli görüntü, GFP ifade eden hücreleri ayrıntılı olarak göstermektedir.

Bu faz kontrast görüntüleri, hücre bölünmesinin bir örneğini göstermektedir. Burada progenitörlerin hücre yuvarlanması görülür, bunu hücre zarı daralması ve son olarak mitoz bölünmesi izler. Bu, tek hücreli bir soy ağacı örneğidir.

Renkli oklar farklı hücre bölünmesi modlarını gösterir, simetrik proliferatif bölünme sarı okla gösterilir. Asimetrik bölünme mavi okla gösterilir. Simetrik terminal bölünmesi kırmızı okla gösterilir ve X hücre ölümünü gösterir.

Sayılar, progenitör hücrelerin hücre döngüsü uzunluğunu gösterir. Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa bir ila iki saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, kök hücrelerin nöronlara veya glial hücrelere hücre soyunun ilerlemesi sırasında hücre davranışlarını nasıl göstereceğinizi iyi anlamış olmalısınız.