Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, enzim bazlı seçici bir hidroliz ve tahlil kullanarak siyanobakterilerdeki glikojen içeriğini belirlemektir. Bu yöntem, araştırılan farklı siyanobakteri suşlarının fizyolojisi, moleküler genetiği ve biyomühendisliği gibi siyanobakteri alanındaki önemli bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, küçük bir ölçeğe uyarlanmış olması, gerçekleştirmesinin kolay olması ve glikojene karşı oldukça hassas ve spesifik olmasıdır.

Bu yöntem siyanobakteriler hakkında bilgi sağlayabilse de, E.Coli, maya, mikroalgler ve çeşitli heterotrofik ve fototrofik mikroorganizmalar gibi glikojen veya nişasta biriktiren diğer mikroorganizmalara da uygulanabilir. Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi siyanobakteri kültürlerinin hazırlanması ile başlayın. Bir mililitre siyanobakteri kültürünü veya hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Daha sonra 10 dakika boyunca 6.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Peletin bir mililitrelik 50 milimolar Tris-HCL pH sekizde yeniden süspanse edilmeden önce süpernatanı atın. Yeniden askıya alınan peleti daha önce olduğu gibi santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve hücre peletini Tris-HCL tamponunda ikinci kez yeniden süspanse edin. Tüpleri daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra peleti 500 mikrolitre 50 milimolar Tris-HCL tampon pH sekizde iyice yeniden süspanse edin.

Etkili bir lizis için peletin iyi bir şekilde askıya alınması çok önemlidir. Yeniden süspansiyonu buzda tutun. Yeniden askıya alınan hücreleri, maksimum genliğe sahip 20 kilohertz frekansında 30 saniyeden oluşan her döngü ile 30 döngü ile 30 santigrat derecede ultrasonikasyon ile parçalayın, ardından 90 saniye olmadan.

Lizat içeren tüpü 6.000 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, pelet esas olarak büyük hücre kalıntıları olmalıdır ve süpernatant daha fazla analiz için kullanılır. Bu noktada, protein tahlil kitini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.

900 mikrolitre etanol ve elde edilen süpernatantın 100 mikrolitresini 1.5 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpte karıştırarak klorofil a'yı hücre lizatından çıkarın. Kapağı kapattıktan sonra, standart bir laboratuvar ısıtma bloğu kullanarak tüpü 90 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Ardından, tüpü 30 dakika boyunca buzda inkübe edin.

Daha sonra, tüpü 30 dakika boyunca 20.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı dikkatlice çıkarın. Pelet glikojen içerir.

Fazla etanolü çıkarmak için peleti havada hafifçe kurutun. Zor çözünmesini önlemek için peleti aşırı derecede kurutmayın. Klorofil a içeriğini belirlemek için elde edilen süpernatantın 666 nanometresindeki absorbansı ölçün.

Değer, glikojen içeriğini normalleştirmek için kullanılabilir. Peletleri 100 mikrolitre 50 milimolar sodyum asetat pH beşinde çözün. Bir girdap kullanarak bu malzemeleri iyice karıştırın.

Karışım viskoz olduğu için pipetleme ile karıştırılması önerilmez. Ayrıca mililitre amiloglukozidaz başına 50 mikrolitre sekiz birim ve mililitre alfa-amilaz başına 50 mikrolitre iki birim ekleyin. Daha sonra, glikojenin glikoz moleküllerine sindirilmesini sağlamak için karışımı 60 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda iki saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, numuneyi beş dakika boyunca 20.000 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın. GOD-POD reaktifini kullanarak enzimatik hidrolizi takiben süpernatanttaki glikoz konsantrasyonunu ölçün. 100 mikrolitre süpernatanı glikojen çökeltme adımından 96 oyuklu bir plakadaki bir kuyuya aktarın.

Negatif kontrol olarak, 100 mikrolitre 50 milimolar sodyum asetat pH beş kullanın. Kalibrasyon eğrisini oluşturmak için glikoz standart çözeltilerini de ölçün. Her numuneye 150 mikrolitre GOD-POD reaktifi ekleyin ve pipetleyerek hızlı bir şekilde karıştırın.

Plakayı 25 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, bir plaka okuyucu kullanarak absorbans değerini 510 nanometrede kaydedin. Glikoz standartlarından elde edilen bir kalibrasyon eğrisi kullanarak glikoz eşdeğeri olarak glikojen miktarını hesaplayın.

Synechocystis'teki glikojen içerikleri burada gösterilmiştir. Glikojeni aşırı biriktirdiği bilinen iki mutant suş, delta pmg A ve delta pmg R, vahşi tip suşla karşılaştırıldı. Beklendiği gibi, mutant suşlar yüksek seviyelerde glikojen gösterdi.

Tersine, glikojen sentazı olmayan bir mutant glikojen biriktirmedi. Burada kullanılan suşlar mannitol üretmek için tasarlanmıştır. Özellikle, glikojen sentaz mutantı, kontrol suşundan daha fazla mannitol üretti, bu da fotosentez ile sentezlenen karbonhidratın, glikojen sentezleme yeteneğinden yoksun mutant suşta mannitol'e yönlendirildiğini düşündürmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, siyanobakterilerdeki glikojen içeriğini beş saat içinde kantitatif olarak belirleyebilmelisiniz. Bu prosedürü gerçekleştirirken, güvenilir sonuçlar elde etmek için hücreleri tamamen yeniden askıya almayı ve glikojen peletlerini çözündürmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, siyanobakterilerde karbonhidrat metabolizmasının nasıl düzenlendiği gibi ek soruları yanıtlamak için kalan hücre lizatları kullanılarak metabolik enzim aktivitesi deneyleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.