S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama

Bu yüksek verimli maya fenotiplemesinin genel amacı, protein bazlı kalıtım için bir vekil olarak, geçen ifadenin kalıcı bir fenotipik hafızasını yasadışı hale getiren proteinleri taramaktır. Bu yöntem, maya Prion alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin, bu türden kaç proteini yasadışı kalıtım yapabilir. Bu tekniğin ana avantajı, birçok proteini ve yolu tarafsız bir şekilde tarayabilmenizdir.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi, uygun maya hücrelerini 96 oyuklu bir plakada 30 santigrat derecede büyüterek başlayın. Kültürlerin doymuş olduğunu doğrulamak için kültürleri görsel olarak inceleyin, hücreler her oyuğun dibinde gözle görülebilmelidir. Kuyucuk başına 45 mikrolitre uygun ortam içeren 384 kuyulu plaka hazırlamak için bir sıvı işleme robotu kullanın.

İlk olarak, Scal-URA'yı 384 kuyulu bir plakanın kuyularına dağıtın. Daha sonra Scal-URA artı ilgilenilen stresörü ikinci bir plakanın kuyucuklarına dağıtın, bu deneyde stres etkeni olarak 20 milimolar manganez klorür kullanılır. Üçüncüsü, plazmit ekspresyonunu indüklemeyecek olan SD-URA'yı ve manganez klorürü başka bir plakaya dağıtın.

Kültürleri içeren 96 oyuklu plakayı sıvı işleme robotuna indirin ve 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan bir ila dört mikrolitrelik bir diziyi, farklı bir ortamla doldurulmuş her 384 oyuklu plakanın dört ayrı oyuğuna aşılayın. Hücreli plakaları hemen oda sıcaklığında ve atmosferik karbondioksitte bir mikroplaka istifleyiciye yerleştirin. Mikroplaka okuyucu ile optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçerek 72 saatlik sürekli döngü için protokolü ayarlayın.

Büyüme ölçümlerinden sonra, aşırı protein ekspresyonu yaşayan SCal-URA ile indüklenen kültürlerin oyuk başına bir mikrolitresini, plazmidin protein ekspresyonuna izin vermeyen ST-URA ortamının oyuğu başına 45 mikrolitre içeren yeni 384 kuyucuklu plakaya aktarın. Paralel olarak, stresör varlığında ST-URA'da yetiştirilen kültürlerden ST-URA oyuğu başına 45 mikrolitre içeren ikinci bir 384 oyuklu plaka setinin benzer aşılamalarını gerçekleştirin. Plakaları nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve plakaları 30 santigrat derecede doygunluğa kadar 48 saat büyütün.

48 saat sonra, ST-URA kuyusu başına 45 mikrolitre içeren 384 oyuklu plakada kuyu başına bir mikrolitreyi yeniden aşılamak için plakaları kullanın. Daha sonra, aynı kaynak plakasından, stresör ile ST-URA oyuklu başına 384 mikrolitre içeren ayrı bir 45 oyuklu plakaya kuyu başına bir mikrolitrelik ayrı bir yeniden aşılama gerçekleştirin. Mikro istifleyicinin hücrelerinin bulunduğu plakaları hemen oda sıcaklığında ve atmosferik karbondioksitte yerleştirin ve protokolü 48 saatlik sürekli bir döngü için ayarlayın ve optik yoğunluğu bir mikroplaka okuyucu ile 600 nanometrede ölçün.

Büyüme ölçümleri tamamlandığında, 600 nanometre ölçümlerinde optik yoğunluğa karşı zamanı bir XY tablosu olarak dışa aktarmak için plaka okuyucu yazılımını kullanın. Her biyolojik kopya için optik yoğunluk ölçümlerinin sütunlarını gruplayın ve ortalamayı hesaplayın. Büyüme eğrileri oluşturmak için 600 nanometrede optik yoğunluğa karşı bir XY zaman grafiği oluşturun.

Atalardan kalma protein aşırı ekspresyonuna bağlı olarak, belirli bir stres etkenine yanıt olarak önemli büyüme farklılıkları seçen kültürler için, her biyolojik kopyadan bir mikrolitre alın, 10 mililitre su ile seyreltin ve daha sonra 5-FOA içeren plakalara 50 mikrolitre plaka koyun. Üç gün boyunca 30 santigrat derecede büyütün. Bu, plaka başına çok fazla veya çok az koloni ile sonuçlanırsa, seyreltme faktörünü buna göre ayarlayın.

Plaka başına 100 ila 200 koloni idealdir. Otoklav kürdanları ile sekiz ila 32 tek koloni seçin ve bunları oyuk başına 150 mikrolitre SDCSM içeren 96 kuyucuklu plakaya sabitleyin. Plakaları nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve 30 santigrat derecede 48 ila 72 saat doygunluğa kadar büyütün.

Bu kültürleri, hem stresörlü hem de stresörsüz SDCSM oyuğu başına 150 mikrolitre içeren iki yeni 96 oyuklu plaka setini aşılamak için kullanın. Plakaları bir mikroplaka istifleyiciye yerleştirin ve 48 saatlik sürekli bir döngüde 600 nanometrede optik yoğunluğu ölçmek için protokolü ayarlayın. 48 saat sonra, verileri daha önce gösterildiği gibi analiz edin ve daha önce görülen önemli büyüme farklılıklarının plazmit kaybından sonra da korunduğunu onaylayın.

İndüklenmiş fenotipleri koruyan hücreler daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi protein bazlı kalıtımın klasik ayırt edici özellikleri için test edilir. Bu protein bazlı kalıtım ekranı, PSP1 açık okuma çerçevesinin geçici aşırı ekspresyonunu ortaya çıkardı, aşırı ekspresyon sona erdikten çok sonra, hücrelerde yüzlerce nesil boyunca korunan manganez klorüre karşı bir direnç gösterdi. Prion tahmin algoritmaları, PSP1'in son terminalini orta derecede Prion benzeri olarak puanladı.

Buna karşılık, algoritmalar, bu temsili analizde gösterildiği gibi, ekranda geri kazanılan çoğu indükleyici proteinden neredeyse hiçbir önemli Prion benzeri dizi özelliği öngörmedi. Manganez klorür ile suşların ve SDCSM'nin büyüme ölçümleri, karşılık gelen naif bir PSP1 eksi kontrolüne normalize edilmiş, HSP104 disaggregazın inhibisyonunun PSP1'e bağımlı manganez klorür direncini bozmadığını, HSP70 şaperon ve PSP1 geninin çıkarılmasının ise bu fenotipi kalıtsal olarak ortadan kaldırdığını göstermiştir. PSP1'e bağımlı fenotipik durumu ve naif suşları barındıran suşlar arasındaki tek tetradlı çaprazlamalardan gelen tüm sporlar, fenotipin mendel dışı kalıtımını gösteren manganez klorür direnci gösterir.

Sahte lizatlar ve bulaşıcı materyal olarak lizatları barındıran PSP1 arasındaki protein dönüşümü için enfektivitenin karşılaştırılması, tohumlanmış PSP1 ile dönüştürülen naif hücrelerin %53'ünden fazlasının karşılık gelen manganez klorür direnci fenotipini aldığını gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik inkübasyon adımları da dahil olmak üzere birkaç hafta içinde yapılabilir ve çoğu tarama adımının hazırlanması, çok sayıda plakayla bile günde iki saatten daha kısa bir sürede yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tam olarak neyi test etmek istediğinizi önceden planlamayı unutmamak ve deneyin ölçeğini akılda tutmak önemlidir.

Şimdi bu özellikle tekniğe yeni başlayanlar için önemlidir. Bu prosedürü takiben, taramada gözlemlenen fenotiplerin gerçek, Prion benzeri bir kalıtım modeli gösterip göstermediğini belirlemek için metin protokolünde açıklananlar gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, epigenetik alanındaki araştırmacıların, sacralis hizmet CI'sinde Prion biyolojisinin genişliğini keşfetmelerinin yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, mayada yeni protein bazlı kalıtım biçimleri için hem tarafsız hem de hedefli bir şekilde yüksek verimli bir ekranın nasıl tasarlanacağını iyi anlamalısınız.

DNA'ya zarar veren maddeler gibi bazı kimyasal stres faktörlerinin son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.