Yüksek Çözünürlüklü Episkopik Mikroskopi (HREM) - Organik Malzemelerin İşlenmesi ve Görselleştirilmesi için Basit ve Sağlam Protokoller

Bu prosedürün genel amacı, organik malzemelerin dijital hacim verilerini oluşturmaktır. Örnekler, biyomedikal model organizmaların embriyoları ve embriyo dokuları, deri veya kas biyopsileri dahil olmak üzere yetişkin hayvanlardan ve insanlardan toplanan doku blokları ve kaplanmamış kağıt ve deri ikameleri gibi materyallerdir. HREM, tıp ve biyomedikal araştırma alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur.

Örneğin, genetiği değiştirilmiş fare embriyolarının veya manipüle edilmiş civciv embriyolarının organ ve dokularının üç boyutlu analizine ve görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca kanser modellerinin yanı sıra insan veya hayvan dokularından alınan biyopsilerin analizine de izin verir. HREM'in ana avantajı, histolojik kaliteye yakın görüntü yığınları oluşturmak için basit bir yol sağlamasıdır.

Bu tekniğin anlamı, hayvan modelleri kullanılarak yara iyileşmesinin araştırılmasına ve ayrıca insanlarda doku patolojilerinin eğirilmesine ve onarılmasına kadar uzanır. Prosedürü gösteren BMR Marlene Rodler ve Johannes Gunther olacak. Her ikisi de Viyana Tıp Üniversitesi, Anatomi Anabilim Dalı'ndan.

Sabit embriyolar veya 5 x 5 x 5 kübik mililitreden büyük olmayan embriyonik doku ile başlayın. Sabitleyiciyi çıkarın. Ve PBS ekleyin.

Dört santigrat derecede 24 saat boyunca sürekli sallanarak yıkayın. Dokuyu içeren tüplere% 70 etanol ekleyin ve numuneleri dört santigrat derecede bir döndürücüye yerleştirin. İki ila üç saat sonra, numuneleri her seferinde iki ila üç saat boyunca artan konsantrasyondaki etanol çözeltilerinde kurutmaya devam edin.

Numuneler susuz kalırken, bir beherde 25 mililitre A çözeltisine 0.3125 gram benzoil peroksit ve 0.1 gram ESN ekleyerek infiltrasyon çözeltisi hazırlayın. ESN ve katalizör tamamen çözülene kadar iki ila üç saat boyunca dört santigrat derecede manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Numuneleri infiltrasyon solüsyonuna yerleştirin.

Ve numuneleri dört santigrat derecede 12 ila 24 saat boyunca sallayın veya döndürün. Gömme çözümü hazırlayarak başlayın. 25 mililitre taze sızma çözeltisine bir mililitre veya B çözeltisi ekleyin.

Kalıplama kabı tepsilerini hazırladıktan sonra, kalıpların derin boşluğunu gömme solüsyonu ile doldurun. Numuneleri bir kaşık kullanarak kalıplara aktarın. Havanın sıkışmasını önlemek için numunenin gömme solüsyonu ile tamamen kaplandığından emin olun.

İğneler veya forseps kullanarak numuneyi kalıbın içine yönlendirin. Gömme sırasında numunenin oryantasyonunu optimize etmek ve blok yüzeyindeki kesin konumunu işaretlemek çok önemlidir. Bu şekilde ilgi alanı küçük tutulabilir ve mümkün olan en yüksek büyütme oranına sahip objektif kullanılabilir.

Gömme çözeltisi viskoz hale gelmeye başlar başlamaz, kalıbın üstüne bir blok tutucu yerleştirin ve gömme çözeltisi blok tutucunun tabanının bir ila iki milimetre üzerine çıkana kadar blok tutucunun merkezi deliğinden gömme çözeltisi ekleyin. Kalıplama kabı tepsisini sıvı parafin mumu ile kaplayarak kapatın ve hareket ettirmeden önce sertleşmesini bekleyin. Kapalı kalıplama kabı tepsilerini oda sıcaklığında bir ila iki gün saklayarak blokların polimerizasyonu bitirmesine izin verin.

Polimerizasyon sonrası işlem için, polimerize bloklarla birlikte kalıplama kabı tepsilerini standart bir laboratuvar fırınına yerleştirin ve en az bir ila iki gün boyunca 70 ila 80 santigrat derecede pişirin. Blokları kalıplardan çıkarın. Ardından, beyaz ışığı blok yüzeyine eğik olarak yönlendirerek görüş alanını tanımlayın.

Blok yüzeyindeki siyah işaretleyici ile gölgeyi ve numuneyi izleyin. Reçine bloğunu belirtilen görüş alanı ile mikrotom üzerine monte edin ve blok tutucuyu durma konumuna getirin. Dijital kamera ve veri oluşturma yazılımını başlatın ve canlı bir görüntü elde edin.

İlgilenilen bölgeyi kapsayacak şekilde uygun büyütme oranına sahip bir hedef seçin. İlgilenilen bölge bilgisayar ekranında görüntülenen görüş alanıyla eşleşene kadar optiği yukarı ve aşağı ve mikrotomu yanal olarak hareket ettirin. Numunenin ilk yapıları görünür hale gelene kadar bloğu bölümlere ayırın.

Blok yüzeyini optiğin odak düzleminde düzenlemek için mikrotomu hareket ettirin. 0,5 ila beş mikron arasında bir kesit kalınlığı seçin. Ardından, yazılımı üreticinin talimatlarına göre kurduktan sonra, yazılımı başlatın ve veri yakalamaya başlayın.

Bu HREM kesiti görüntüsü, embriyonik gün 9.5'te hasat edilen bir fare embriyosu aracılığıyla bir sagital kesiti göstermektedir. Bu hacim render edilmiş 3D model, bu embriyonun yüzeyini göstermektedir. Bu görüntü, embriyonik gün 15.5'te hasat edilen fare embriyosunun boynunun hacimle oluşturulmuş bir modeli aracılığıyla sanal bir sagital kesiti göstermektedir.

Yüzey modeli, gelişimsel bir Hamburger Hamilton Aşama 18 olan bir civciv embriyosunun tüm dokularının hacim görüntüsünde kardiyovasküler sistemin lümenini vurgular. Bu görüntü, bir insan sinirinden geçen bir HREM bölümünü göstermektedir. Kakma, bu görüntünün bölümünü büyütür.

Bu görüntü, domuz karaciğerinden geçen bir HREM kesit görüntüsünün bir kısmını göstermektedir. Bu görüntü, bir insan başparmak pedinden alınan bir biyopsinin hacimce işlenmiş bir 3D modelini göstermektedir. Bu görüntü, HREM verileri aracılığıyla sanal bir rezeksiyonun önünde dermal arterlerin, damarların ve sinirlerin yüzeyden oluşturulmuş modellerini göstermektedir.

Bu animasyon, bir insan başparmak pedinin kalın derisinin hacimle işlenmiş bir modelini gösterir. Farklı eşikler ve dolayısıyla kan damarları, sinir lifleri, ter bezleri ve ter bezlerinin kanalları gibi farklı dermal yapılar. HREM, lifli malzeme mimarisinin hızlı bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.

Bu görüntü, doğal dermal ikame malzemesinin hacimce işlenmiş bir modelini göstermektedir. Bu animasyon, dermal ikame malzemesinin hacimle oluşturulmuş modelini gösterir. Liflerin farklı şekline ve kalibresine dikkat edin.

Numunelerin kurutulması, sızması ve reçineye gömülmesi gerekir, bu nedenle tüm prosedür birkaç gün sürebilir, ancak çözeltilerin hazırlanması, çözeltilerin değiştirilmesi vb. için yalnızca iki ila üç saatlik operasyonel çalışmaları içerir. Veri üretiminin kendisi HREM cihazında tamamen otomatiktir ve iki ila üç saat içinde 1000 görüntü üretilebilir. Geliştirilmesinden sonra HREM, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların mutant fare embriyolarının fenotipini kesin olarak puanlamasının yolunu açtı.

Bir örnek, gelişimsel bozuklukların deşifre mekanizmaları veya HREM'in henüz bilinmeyen ayrıntılarda fenotipleme, embriyonik olarak ölümcül fare embriyoları için kullanıldığı DMDD projesidir. HREM'in ayrıca insan doku örneklerinde kan damarlarını, sinirleri veya lif mimarisini incelemek için pozisyonel ışık mikroskobuna mükemmel bir alternatif olduğu ortaya çıktı.