Name: Nakli Schwann hücreleri kopuk sıçan Spinal Kord kütükleri arasında boşluk Axon rejenerasyon teşvik için köprü için PVDF-TrFE borular içinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin sıçan spinal kord yaralanmalarında PVDF-TrFE borular ve Schwann hücreleri kullanarak tam kesik arası köprü oluşturma yöntemini. Bu teknik akson rejenerasyonunu teşvik ederek fonksiyonel iyileşme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Viral vektör ve hayvan çekirdek tedavi felç için Miami Projesi'nde lenti-GFP-virüs ve sağlayan hayvan bakımı, sırasıyla, üreten ve Histoloji ve çekirdek görüntüleme için cryostat, confocal mikroskop, kullanım için teşekkür etmek istiyorum ve Stereo araştırmacı ile floresan mikroskop. Finansman NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) ve NSF (DMR-1006510) tarafından sağlandı. M.B. Bunge Christine E Lynn ayırt edici Profesör of Neuroscience olduğunu.

dişi yetişkin Fischer rats (180-200 g vücut ağırlığı) NIH ve USDA kurallarına göre yer alır. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Miami Üniversitesi tüm hayvan prosedürleri onayladı.
 1. transplantasyon öncesi hazırlık <ol><li>boru hazırlık.
	<ol><li>5 mm uzunluğunda bir diseksiyon mikroskop altında #10 bıçak kullanarak için Boru kesme. 
		Not: Boru iç çapı 2.4-2.7 mm arasında olduğunu; dış çapı 2,5-2,8 mm arasında olduğunu.</li>
		<li>Boru yavaşça sol tarafındaki boyuna ( şekil 1A) katlayın. Dört küçük kesiler 0.4 mm uzun ve en az 1 mm boru açıklıklar üzerinden ve yaklaşık 1 mm ayrı düz kenarlı kenasen makas ( şekil 1B) kullanarak hakkında kesin.
		<ol><li>( şekil 1 c) boru açılmak ve iki pencereyi yan yana oluşturma aynı tarafında iki insizyon arasında ( şekil 1 d) kesti. Windows açılabilir ve düzgün kesilmemiş kenarı boyunca kapalı olun.</li>
		</ol></li> <li>Kablo kanalları % 75 etanol için 10 cm Petri kabına 25 dk içinde sterilize. Bir kez 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 4 dk için kanalların durulama ve kablo kanalları ile steril forseps için yeni 10 cm Petri kabına aktarın. Kablo kanalları için 25 dk 1 x PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Saklamak kablo kanalları 1 x PBS kadar ameliyat. 
		Not: Birçok kanallarını hemen sterilize. Kablo kanalları onları steril tutmak için ayrı steril 1,5 mL santrifüj tüplerde depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Yeşil flüoresan protein (GFP)-Schwann hücresi (SC) hazırlık <ol><li>yetişkin kadın Fischer tibial sinir arıtılmış SC kültürler sıçan yukarıda açıklanan 43 hazırlamak. Bu adım bitiminde, Poli-L-lizin (PLL) üzerinde SCs plaka-kaplı 10 cm Petri yemekler ve korumak D10/3 M ortamda; Bu SCs geçit 0 tanımlanan. 
		Not: D10 / 3M orta aşağıdakilerden oluşmaktadır: % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 penisilin-streptomisin (kalem/strep), 20 µg/mL hipofiz özü, 2 µM forskolin, 2.5 nM heregulin Dulbecco içinde &#39; s modifiye kartal &#39; s orta (DMEM).</li>
		<li>Taze D10/3 M orta (7 mL/10-cm Petri kabına) ile 3-4 günde doldurmak.</li>
		<li>% 70-80 izdiham ulaştıktan sonra Split SC kültür.
		<ol><li>Kaldır orta ve durulama Hank ile iki kez &#39; s dengeli tuz solüsyonu (HBSS) kalsiyum ve magnezyum.</li>
			<li>5 mL % 0.25 tripsin/EDTA her 10 cm Petri kabına ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.</li>
			<li>D10 orta (% 10 FBS ve % 1 kalem/strep DMEM içinde) 5 mL tripsin nötralize etmek için 50mL santrifüj tüpüne ekleyin.</li>
			Petri <li>yavaşça damlalıklı tripsin/EDTA çözümde SCs. Kaldır ayırmak için birkaç kez hücre süspansiyon çanak dan çanağı ve önceki adımda hazırlanan santrifüj tüpü yerleştirin. D10 orta 5 mL ile çanak durulayın ve hücre hasat maksimize etmek için santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
			<li>370 x g 4 o C. Kaldır süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve 4 mL D10/3 M orta her Petri kabına split için hücrelerde resuspend.</li>
			<li>1 mL SC süspansiyon ve D10/3 M orta 6 mL 10 cm Petri kabına dağıtmak; her Petri kabına bölünmüş 4 Petri yemeklerinde neden olur. Bu SCs geçiş 1 tanımlanan.</li>
			<li>Taze D10 / 3M orta gün sonra kaplama ve her 3-4 gün sonra kaplama ile Replenish.</li>
			<li>Bir kez SCs % 70-80 izdiham ulaşmak, 1.2.3.1-1.2.3.6 olan adımları yineleyin. SCs geçit 2 oldular.</li>
		</ol></li> <li>Transduce bir kez % 50 izdiham ulaşan SCs, GFP içinde D10/3 M kodlama lentiviral bir vektör ile orta gecede 30 enfeksiyon çokluğu, daha önce 44 , 45 açıklandığı gibi .</li>
		<li>Ertesi gün ve her 3-4 gün sonra kaplama ile taze D10/3 M orta doldurmak.</li>
		% 70-80 izdiham, GFP SCs ulaştıktan sonra <li>adımları 1.2.3.1-1.2.3.5 tekrar ama GFP SCs 6 mL D10 orta yerine resuspend. 15 µL GFP-SC süspansiyon, bir 1,5 mL santrifüj tüpüne dağıtmak ve 15 µL % 0,4 trypan mavi çözüm ekleyin. Santrifüj tüpü yavaşça fiske ve karışımı 10 µL Hücre sayımı slayt odasına dağıtmak.
		<ol><li>Bir otomatik hücre sayaç slayta yerleştirin ve hücre yoğunluğu belirlemek.</li>
		</ol></li> <li>370 x g 4 o C. Kaldır süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, her 3 x 10 6 GFP dondurucu orta 1,5 mL ile resuspend-SCs. besleme GFP-SC süspansiyon kriyojenik flakon ve donma-80, içine 1.5 mL o C için sıvı azot depolanmasında geçmeden önce en az 24 h için. 
		Not: Orta dondurma: DMEM % 25 FBS ve % 8 Dimetil sülfoksit.</li>
		<li>Çözülme GFP-SCs ameliyattan önce bir hafta.
		<ol><li>Ekleyin 10 mL D10 orta içine 50 mL santrifüj tüpü.</li>
			<li>Çözülme donmuş GFP-SCs 37 o kısmen çözdürülen kadar C de su banyosunda şişeleri.</li>
			<li>GFP-SC süspansiyon kriyojenik şişeyi çıkarın ve 1.2.8.1 içinde hazırlanan 50 mL santrifüj tüpü içine yerleştirin. Yavaşça damlalıklı çözüm yukarı ve tekrar tekrar aşağı.</li>
			<li>370 x g 4 o C. Kaldır süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve 4 mL D10/3 M orta çözdürülen her şişe için hücrelerde resuspend.</li>
			<li>2 mL GFP-SC süspansiyon ve D10/3 M orta 5 mL 10 cm Petri kabına dağıtmak; her şişe 2 Petri yemeklerinde sonuçlanmalıdır. GFP SCs passage 3 tanımlanır. 
			Not: 10 cm Petri kabına genellikle bir hafta sonra yaklaşık 8 x 10 6 GFP-SCs verimleri.</li>
		</ol></li> <li>Ameliyat günü, adımları yineleyin 1.2.6. Kullanım hücre yoğunluğu hesaplanan adım 1.2.10.</li>
		<li>Besleme aliquots 3 x 10 6 GFP-SCs içine steril 1,5 mL santrifüj tüpleri hücre yoğunluğu üzerinde temel adım 1.2.9 yükleme hesaplanır. GFP-SC aliquots 370 x g 4 o C, 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Her aliquot ve santrifüj, 370 x g. DMEM/F12 orta 1 mL ekleyin 
		Not: 3 x 10 6 GFP her hayvan alır-SCs. orta serum ile bu adım kadar GFP-SCs ile kullanılan.</li>
		<li>Tutmak GFP-SCs nakli zaman kadar buzda.</li>
	</ol></li></ol> 2. Torasik Level 8 (T8) adlı transeksiyon tamamlamak <ol><li>ameliyat için hayvan hazırlık <ol><li>Anesthetize bir kadın Fischer fareyle ketamin (60 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (5 mayi enjeksiyonu (180-200 g) mg/kg vücut ağırlığı). Parmak pinching kontrol ederek bir sonraki adıma devam etmeden önce anestezi derinliği izlemek ve göz yanıp sönen yanıt.</li>
		<li>Bir elektrik kesme makinesi fareyle arkası tıraş ve % 70 etanol ile cildinizi silin. Oftalmik yağ her iki gözde için geçerlidir. Hayvan vertebra erişim kolay böylece bir rulo yaklaşık 37 o C. yer hayvan, vücut ısısını korumak için bir Isıtma yastık üzerinde ameliyat tablosuna transfer. 
		Not: Rulo kağıt havlu veya 2 ' x2 sterilize gazlı bez içinde yapılabilir. Daha büyük rulo T7-T9 düz rulo üstüne koydu gerektiğinde önerilir.</li>
	</ol></li> <li>T7 T9 laminektomi için <ol><li>T9-T11 spinöz işlemleri için dönüm noktası bulun. 
		Not: T9 ve T10 T11 arasındaki boşlukları diğer kesimlerine göre küçük benn bölge. Fare roll üzerine koyduktan sonra T9-T11 spinöz işlemler deri yoluyla küçük bir üçgen şişlik gibi hissedeceksiniz.</li>
		<li>4-5 cm Ensizyon T4 T11 bir #10 bıçak kullanarak deri olun. Küçük bir insizyon attım fat kopyalayabilmek için künt biter kavisli makasla yüzeysel yağ katmanıyla olun. 
		Not: Diğer türleri araçların yağ ayırmak için kullanılabilir ancak künt biter kavisli makasla etkinleştirmek şişman ayrılması için en etkili ve az invaziv yöntem.</li>
		<li>T9 spinöz işlemlere T7 #10 bıçak arkası kullanarak bulun. Künt Forseps ile T4 hakkında kas sık ve kesik vertebra her iki tarafında boyunca kas T6-T10. Omurga gibi temiz bir açılış yapmak ve hayvan için en az yaralanmalara neden mümkün olduğunca yakın kesme olun.</li>
		<li>Her bireysel spinöz proses T7 dan kas ve bağ T6 T7, T7 ve T8, T8 ve T9, arasında kesim tarafından T9 ve T9 ve T10 #10 bıçak ile yalıtmak.</li>
		<li>Bir rongeur herhangi bir kas ve bağ lamina üzerinde T9 için T7 kaldırmak için kullanın. T7 T9 enine işlemlere arasındaki boşlukları görünür hale gelene kadar kas ve bağ mümkün olduğunca yanal kaldırmak.</li>
		<li>Bir rongeur ile T9 spinöz proses kaldırın. T8 spinöz proses künt forseps ve yavaşça küçük açılışında T9 lamina T9 ve T10 süreçler arasında yükseltmek için Asansör ile tutun.</li>
		<li>Ve rostrally ile bir rongeur T9, hareket--dan açılış başlangıç lamina kaldırın. Mümkün olduğunca yanal lamina Kaldır; dorsal kökleri laminektomi sonra görünür olmalıdır.</li>
		Lamina kaldırılır bir kez <li>T7 ve T8 için işlemi yineleyin. 
		Not: laminektomi sırasında emme spears laminektomi ile devam ederken kan kaldırmak için kullanın. Aşırı kanama meydana gelirse, sıkıştırılmış bir sünger kanama sitesinde yer ve kan pıhtılaşma ile yardımcı olmak için serum ekleyin.</li>
	</ol></li> <li>Transeksiyon T8, <ol><li>Retraktörü T7 T9 için çevresinde yer. Bir kez tüm lamina kaldırılır, enine süreçler arasındaki boşluklar özellikle T8 görünür olduğundan emin olun. Ayrıca kemik uzunluğu arasında T7 T9 dışa doğru çıkıntılı kemik parçaları yok emin olmak için her iki tarafında boyunca inceleyin. 
		Not: Bu boşluğu T8, tam transeksiyon gerçekleştirmek için önemlidir. Uzunluğu boyunca omurga daha kolay boru sokmak için kaldırılmalıdır.</li>
		<li>Dorsal kesme ve ventral kökleri yukarıda ve T8 kullanarak aşağıda bahar makas açılı. Spinal kord tuz ekleyin ve kan pıhtısı. için bekleyin Not: uygun boru sokmak için önemli bir adımdır.</li>
		<li>Yukarıda Medulla Spinalis açılı bahar makas T8, enine süreçler arasındaki boşluklar yerleştirin ve omurilik tamamen koparmaya bir kesim yapmak. Sıkıştırılmış köpük küçük bir parça elde edilen 2-2,5 mm boşluk yerleştirin ve salin alanı hemen ekleyin.</li>
	</ol></li></ol> 3. Boru ekleme <ol><li>kesik kordon yükün hemostaz ulaşmak beklerken, bir kanal 1 x PBS alın. Emme üçgenler ince uzun parçalar halinde kesilmiş ve aşırı PBS kaldırmak için boru koyun. Önceden kesilmiş windows açık olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kaldır serum ve kan emme üçgen ince uzun parçalar kullanarak. Omurilik iyi ayırma emin olmak için bir microspatula kullanarak iki kütükleri kaldır. Yavaşça rostral güdük microspatula ile Asansör ve boru üzerinde güdük kendini karşı karşıya windows ile kayma. Tüm güdük takılı ve hiçbir fazla boru kanama olun.</li>
	<li>Yavaşça Kaudal güdük kaldırın ve conduit diğer ucunu güdük üzerinde kayma. Emin olun tüm güdük eklenir ve dorsal yüzeyi ( şekil 2A) pencerelerdir.</li>
</ol> 4. Schwann hücresi / enjekte edilebilir matris (tablo malzemeleri görmek) hazırlık ve enjeksiyon <ol><li>kopmuş bir kablonun hemostaz ulaşmak beklerken, orta (1.2 adımda hazırlanan) GFP-SC Pelet yukarıda kaldırmak. GFP SCs soğuk DMEM/F12 10 µl içinde resuspend. Soğuk enjekte edilebilir jel 10 µl hücre süspansiyon ve de tarafından pipetting tekrar karıştırın. Boru ekleme tamamlanıncaya kadar GFP-SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris karışımı buz üzerinde devam.</li>
	<li>( şekil 2A) açık pencere eşiği sırt belgili tanımlık yüzey are üzerinde kontrol ettikten sonra 20 µl GFP-SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris karışımı içine boru önceden kesilmiş windows 46 biri ile enjekte İpucu ve bir micropipette yükleme bir Batı leke kullanarak. SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris karışımı conduit bantlayın, emme üçgenler ile aşırı kaldırın. Windows enjeksiyon sonra kapatır; dikiş değildir ( şekil 2B) gerekli.</li>
</ol> 5. Yaranın kapanması ve ameliyat sonrası bakım <ol><li>dikiş kas katmanları ve yüzeysel yağ katmanları. % 70 etanol ve sonra elyaf (yara klip kullanarak Örneğin,) ile cildi temiz cilt kapa. Kendine gelmek kadar hayvanlar termal olarak düzenlenmiş bir kuluçka makinesine sakla. Hayvanları geri kafesler aktarın. Su ile uzun besleme borusu sağlamak ve yataklar kolay erişim için yiyecek parçaları yerleştirin.</li>
	<li>Yönetici buprenorfin (0.1 mg/kg vücut ağırlığı) günde 3 gündür subkutan hemen ameliyat sonrası ağrı azaltmak için başlangıç. Viomisin (5 mg/kg vücut ağırlığı) subkutan bir kez bir gün 7 gün sonra hemen ameliyat önlemek ve enfeksiyon azaltmak için enjekte. Subkutan günde hidrasyon için 7 gün için 10 mL lactated Ringers çözeltisi enjekte.</li>
	<li>Boş mesane el ile iki kez bir gün mesane kadar işlevini döndürür. Mesane enfeksiyonu ortaya çıkarsa, idrar açık hale gelinceye kadar sonra 10 mL serum fizyolojik subkutan yönetmek. İki gün içinde hiçbir gelişme ise, idrar açık hale gelene kadar da, subkutan viomisin (5 mg/kg vücut ağırlığı, bir kez her gün) enjekte.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bir etkili transeksiyon model oluşturmanın en kritik adımı omurilik bir ya da iki kesim severing. Rostral ve Kaudal omurilik kütükleri arasında bir 2-2.5 mm boşluk transeksiyon sitede bulunması gerekir. Böyle bir boşluk değil gözükmek için üç en olası nedenleri (1) dorsal/ventral kökleri düzgün kaldırılmadı, ventral (2 dura yeterince kaldırılmadı ve/veya (3 hayvan düzgün onu yerleştirilen tekerleği yerleştirildi değil vardır.
Bir etkili boru ekleme kütükleri arasında gerçekleştirmek için: Boru...

Omurilik yaralanma onarım olduğunu içeren, örneğin bir birleşimsel tedavi stratejisi gerektiren karmaşık ve zorlu bir sorun, hücreleri ve Transplante hücre işlevi ve akson olumlu bir microenvironment sağlamak için biomaterial kullanımı yaralanma rejenerasyon sitesinde. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 ve tam transeksiyon10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelleri sık sık biomaterial tabanlı köprüleme terapiler etkilerini değerlendirmek için kullanılır. Hemisection manken kullanmanın avantajı için tam transeksiyon karşılaştırıldığında köprüleme inşa etmek için daha fazla istikrar sağlar olduğunu. Ancak, hemisection modellerinde, kararlara dokusunun varlığı nedeniyle uygulanan tedavi yöntemi bir sonucu olarak axon rejenerasyon kanıtlamak zordur. Tam transeksiyon modeli axon rejenerasyon göstermek için en titiz bir yöntemdir.
Çeşitli doğal ve sentetik malzeme enjekte edilebilir bir jel olarak kullanmak için inceledik, önceden biçimlendirilmiş jel kontüzyonu veya hemisection modelleri ya da yapısal bir iletken olarak hemisection yerleştirilen veya transeksiyon modelleri (ayrıntılı değerlendirmeleri23 ' tamamlamak , 24 , 25). in situ bir enjekte edilebilir matris/SC karışımı gelling nakli ve ana bilgisayar kablosu önceden genellikle matris/SC implantlar için karşılaştırıldığında axon geçiş26,27 arasında fazla izin veren bir arabirim oluşturur 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelling izin daha sert ve yapılandırılmış bir kanal ya da daha az bomba önceden biçimlendirilmiş jel olamazdı, ancak düzensiz konak arayüzlerinin kontur matris. Yapılandırılmış bir kanal kez enjekte edilebilir bir matris aksine iletişim rehberlik ve implant istikrar sağlar. Burada sunulan iletişim kurallarını (Örneğin, matrigel, enjekte edilebilir matris olarak Malzeme tablo başvurulan bakınız) bir enjekte edilebilir membran matris ve yapılandırılmış bir kanal için yararlanır bir cerrahi açıklayınız Axon rejenerasyon en titiz omurilik yaralanma modelinde değerlendir.
Electrospun Poli-vinylidenedifluoride-hizalanmış fibröz içi boş boru deneysel yaklaşımımız kullanılan trifluoroethylene (PVDF-TrFE). PVDF-TrFE olduğunu ne zaman mekanik olarak deforme geçici bir ücret oluşturur ve neurite uzantısı ve akson rejenerasyon teşvik için gösterilen bir piezoelektrik polimer vitro29,30 ve içinde vivo 31. Electrospinning olduğunu hızla fiber hizalama, lif çapı ve İskele için kalınlığı gibi kontrol edilebilir özellikleri polimerler çeşitli kullanarak güvenilir fibröz iskele üretebilir ortak bir iskele imalat yöntemi Sinirsel ve diğer uygulamalar32,33,34.
Çok sayıda çalışma sıçan spinal kord yaralanması siteleri nakledilen SCs tedavi etkinliği5,9,18,19,20,21 göstermiştir ,26. Bu nakli nöroprotektif lezyon çevreleyen doku için vardır, lezyon boşluğu boyutunu küçültmek ve rejenere aksonlar myelination ve lezyon/nakli site içine axon rejenerasyon teşvik. İnsan SCs autologously nakledilen, zaman için diğer birçok ilgili sinirsel göre bir avantaj24hücreleri. Periferik sinir biyopsi sonra SCs izole ve saf ve insanlar içine nakli için istediğiniz miktarı için çoğalırlar. Otolog SC nakli omurilik yaralı hastalar için Iran35,36,37,38, Çin39,40, güvenli olması için kanıtlanmış ve Amerika Birleşik Devletleri41,42. SCs bilinen çok sayıda Nörotrofik faktörler ve hücre dışı matriks proteinlerinin axon büyüme için önemli salgılar ve akson yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra periferik sinir yaralanma önemli bir rol oynamaktadır. Amacımız burada SC nakli tam sıçan spinal kord transeksiyon modeli sonucunu iyileştirmek için boru tasarımlar araştırabilirsiniz yöntemleri tarif etmektir.

<table><tbody><tr><td>Kriyojenik şişeler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri kabı</td><td>VWR</td><td>25382-428</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium: besin karışımı F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039-021</td> <td>"DMEM/F12" protokolünde.</td></tr><tr>Protcol'de <td>penisilin-streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td> <td>"Kalem / Strep".</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Hyclone</td><td>SH300-70-03</td> <td>"FBS" protokolünde.</td></tr><tr><td>Hipofiz özü</td><td>Biyomedikal Teknolojiler</td><td>BT-215</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin</td><td>R& D Sistemleri</td><td>396-HB / CF</td><td></td></tr><tr><td>Poli L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td> <td>"PLL" protokolünde.</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td> <td>"DMEM" protokolünde.</td></tr><tr><td>Hank'in dengeli tuz çözeltisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td> <td>"HBSS" protokolünde.</td></tr><tr><td>Tryspin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Dişi Fischer sıçanı (160-180g)</td> <td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas makas, düz</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Vedco Inc</td><td>5098976106</td><td>100 mg / ml</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc</td><td>AnaSed</td><td>20 mg / ml</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>APP İlaç</td><td>NDC 63323-010-02</td><td>Herhangi bir marka seçim olabilir.</td></tr><tr><td>Mikro Spatula</td><td>FST</td><td>10089-11</td><td>Herhangi bir marka seçim olabilir.</td></tr><tr><td>Kör uçlu kavisli makas</td><td>FST</td><td>14017-18</td><td>Herhangi bir marka seçim olabilir.</td></tr><tr><td>Künt forseps</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td>Herhangi bir marka seçim olabilir.</td></tr><tr><td>rongeur</td><td>FST</td><td>16121-14</td><td>Herhangi bir marka seçim olabilir.</td></tr><tr><td>Açılı yaylı makas</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td>Herhangi bir marka seçim olabilir.</td></tr><tr><td>Absorpsiyon üçgenleri</td><td>FST</td><td>18105-03</td><td>Herhangi bir marka seçim olabilir.</td></tr><tr><td>Jel köpük</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td> <td>Protokolde "Sıkıştırılmış köpük".</td></tr><tr><td># 10 bıçaklar</td><td>Sklar</td><td>06-3010</td><td>Herhangi bir marka seçim olabilir.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td> <td>protokolde "Enjekte edilebilir matris".</td></tr><tr><td>Tavuk anti-yeşil floresan protein antikoru</td><td>Millipore</td><td>AB16901</td><td></td></tr><tr><td>Fare RT97 hibridoma antikoru</td><td>DSHB</td><td>RT97</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-nörofilament antikoru</td><td>Encor Biotechnology, Inc</td><td>PRCA-NF-H</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal Tavşan anti-Glial Fibriler Asidik Protein antikoru</td><td>Dako</td><td>Z033401</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-tavuk IgG (H + L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 keçi tavşan önleyici IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 keçi tavşan önleyici IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21244</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 keçi anti-fare IgG (H+L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskopi</td><td>Nikon</td><td>clsi</td><td></td></tr></tbody></table>

nakli schwann hücreleri kopuk sıçan spinal kord kütükleri arasında boşluk axon rejenerasyon teşvik için köprü için pvdf-trfe borular içinde

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

İnsan Medulla Spinalis Yaralanmalarında en yaygın türü olduğundan Medulla Spinalis Yaralanmalarında Sıçanlarda için çeşitli modeller arasında en sık kontüzyonu modeli kullanılır. Tam transeksiyon modeli olarak klinik kontüzyonu model olarak axon rejenerasyon değerlendirmek için en titiz yöntemi olsa da. Kontüzyonu modelinde, çöllerde veya masraftan aksonlar doku sonrası yaralanma kalan varlığını nedeniyle gelen rejenere ayırt etmek zordur. Tam transeksiyon modelinde köprüleme yöntemi boşluğu doldurmak ve süreklilik rostral Kaudal kütükleri tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için oluşturmak gereklidir. Güvenilir bir köprüleme ameliyat sonuç ölçümleri değişkenlik nedeniyle cerrahi yöntem azaltarak test etmek esastır. Burada açıklanan protokoller Schwann hücreleri (SCs) hazırlamak için kullanılır ve borular nakli, omurilik torasik düzeyde 8 (T8), tam transeksiyon önce boru yerleştirin ve SCs boru nakli. Bu yaklaşım aynı zamanda ana bilgisayar doku rostral ve Kaudal arabirimleriyle arasında geliştirilmiş axon büyüme sağlar SC nakli ile enjekte edilebilir membran Matrix in situ gelling kullanır.

Bu cerrahi tekniği kullanarak yapılandırılmış boru ve tamamlanan geçmiş spinal kordonlar içine nakli sonra SC fonksiyonu maksimize enjekte edilebilir matris kullanımını değerlendirmek için hedeftir. Üç hafta sonra nakli, hayvanların % 4 paraformaldehyde ile derin ve spinal sütunlar fena halde disseke ve başka bir 24 h için aynı sabitleştirici sabit. Spinal kord sonra disseke ve örnekleri cryostat sagittal bölümleri için cryoprotection için % 30 Sükroz çözüm içine yerleştirilir. 1-mm kalın...

Bu makalenin tam transeksiyon sonra spinal kord kütükleri ve dolgu Schwann hücreleri (SCs) ve köprü ve akson rejenerasyon arasında boşluk teşvik için enjekte edilebilir membran matris ile arasında içi boş bir kanal eklemek için bir teknik anlatılmaktadır.

Nakli Schwann hücreleri kopuk sıçan Spinal Kord kütükleri arasında boşluk Axon rejenerasyon teşvik için köprü için PVDF-TrFE borular içinde

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

Bu cerrahi müdahale prosedürünün genel amacı, tamamen kesilmiş omurilik kütükleri arasında, akson rejenerasyonunu desteklemek amacıyla Schwann hücreleri ve enjekte edilebilir matris ile doldurulmuş bir kanal kullanarak bir köprü kurmaktır. Hedefimiz, fonksiyonu geri kazandırmak için sıçandaki bir omurilik yaralanma bölgesini köprülemektir. Kullandığımız yaralanma modeli, tam bir transversiyon boşluğunun oluşturulmasıdır.Sadece bu tür bir yaralanma kullanarak, aksonları yaralanma bölgesinde bulduğumuzda onların yeniden rejenerasyon gerçekleştiğini güvenle söyleyebiliriz. Kullandığımız köprü, aksonların rejenerasyonu için çok önemli olan Schwann hücrelerini içeren bir polimer kanaldır. Bu videoda, böyle bir köprünün tam bir transversiyon boşluğuna nasıl yerleştirileceğini gösteriyoruz.Bu yöntemde yeni olan araştırmacıların pratik yapması gerekecektir; çünkü omuriliğin tamamen kesilmesi ve kanalın yerleştirilmesi yeni başlayanlar için zorlayıcı olabilir. Prosedüre başlamadan önce, kanalı beş milimetre uzunluğunda kesmek için 10 numara bir bistüri ucu kullanın. Tercih edilirse bu işlem bir diseksiyon mikroskobu altında da gerçekleştirilebilir.Kanalı boyuna tarafı boyunca nazikçe katlayın ve düz kenarlı Vannas makası kullanarak, açıklıklardan en az 1 mm uzakta ve yaklaşık 1 mm aralıklarla, yaklaşık 0,4 mm uzunluğunda dört küçük kesik atın. Ardından kanalı açın ve kesilmemiş taraf boyunca pencerelerin düzgün bir şekilde açılıp kapanabildiğinden emin olarak, aynı taraf üzerindeki iki kesik arasını keserek yan yana iki pencere oluşturun. T7-T9 laminektomisini gerçekleştirmek için, anestezi altındaki 180 ila 200 gram ağırlığındaki dişi Fischer sıçanında ayak parmağı sıkıştırmasına yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, T9-T11 spinöz çıkıntıları için referans noktasını belirleyin.Cilt üzerinden küçük üçgen bir çıkıntı şeklinde hissedileceklerdir. 10 numara bistüri kullanarak, T4'ten T11'e kadar orta hatta dört ila beş santimetrelik bir cilt insizyonu yapın ve ardından kavisli küt uçlu makasla yüzeysel yağ tabakasında küçük bir insizyon gerçekleştirin. Yağ dokusunu diseke ettikten sonra, T7-T9 spinöz çıkıntılarını belirlemek için 10 numara bistüri kullanın ve T4 civarındaki kası tutmak için küt pens kullanın. Temiz bir açıklık oluşturmak ve hayvana minimum düzeyde zarar vermek için, T6'dan T10'a kadar vertebraların her iki yanındaki kas boyunca, vertebralar mümkün olduğunca yakın olacak şekilde bir insizyon yapın.Ekartörü T7 ile T9 arasına yerleştirin. T6'dan T10'a kadar olan münferit çıkıntılar arasındaki kasları ve bağları kesmek için 10 numaralı bistüri bıçağını kullanın ve T7'den T9'a kadar olan laminalar üzerindeki tüm kas veya bağları mümkün olduğunca lateralden uzaklaştırmak için bir rongeur kullanın. T7'den T9'a kadar olan transvers çıkıntılar arasındaki boşluklar görünür hale geldiğinde, T9 ve T10 çıkıntıları arasındaki küçük açıklıktan T9 laminasını yükseltmek için T8 spinöz çıkıntısını küt uçlu bir forsepsle nazikçe kaldırarak rongeur yardımıyla T9 spinöz çıkıntısını çıkarın. Ardından, açıklıktan başlayarak T9'da rostral yöne doğru ilerleyerek rongeur ile laminayı mümkün olduğunca lateralden uzaklaştırın. Tüm laminalar çıkarıldığında, özellikle T8'de transvers çıkıntılar arasındaki boşlukların görünür olduğunu doğrulayın ve dışarı doğru çıkıntı yapan kemik fragmanları olmadığını teyit etmek için T7 ile T9 arasındaki her iki taraftaki kemikleri inceleyin; bu aşamada dorsal kökler görünür hale gelmelidir.Açılı yaylı makas kullanarak, T8'in üstündeki ve altındaki dorsal ve ventral kökleri kesin ve kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için spinal korda salin ekleyin. Ardından, açılı yaylı makası T8'deki transvers çıkıntılar arasındaki boşluklarda spinal kordun üzerine yerleştirin ve sinir dokusunu tamamen koparmak için tek bir kesi yapın. Oluşan 2 ila 2,5 milimetrelik boşluğa küçük bir parça sıkıştırılmış sünger yerleştirin ve bölgeye derhal salin ekleyin.Kesilen kord güdüklerinin hemostaza ulaşması beklenirken, absorbsiyon üçgenlerini ince uzun parçalar halinde kesin ve PBS depolama alanından bir konduit çıkarın. Fazla PBS'yi uzaklaştırmak ve önceden kesilmiş pencerelerin açık olduğunu doğrulamak için konduitin içine birkaç üçgen yerleştirin. Ardından, bir GFP Schwann Hücresi peletindeki medyumu uzaklaştırın ve Schwann Hücrelerini 10 µL soğuk DMEM/F-12 içinde yeniden süspande edin.Hücre süspansiyonuna 10 µL soğuk enjekte edilebilir jel ekleyin ve tekrarlı pipetleme ile iyice karıştırın. Ardından, hücre süspansiyonunu buza yerleştirin. Kordon güdükleri hazır olduğunda, sıkıştırılmış köpüğü çıkarın ve ardından laminektomi bölgesindeki salini ve kanı temizlemek için absorbe edici üçgenlerin uzun parçalarını kullanın.Ardından, rostral güdüğü nazikçe kaldırmak için bir mikro spatula kullanın ve pencereler yukarı bakacak şekilde kanalı güdüğün üzerine geçirin; 이때 tüm güdüğün yerleştirildiğinden ve kanal içine aşırı kanama olmadığından emin olun. Kaudal güdüğü nazikçe kaldırın ve kanalın diğer ucunu üzerine geçirin; tüm güdüğün yerleştirildiğinden ve pencerelerin dorsal yüzeyde olduğundan emin olun. Sonra, önceden kesilmiş pencerelerden biri aracılığıyla kanalın içine 20 µL GFP Schwann Hücresi enjekte edilebilir matris karışımını enjekte etmek için western blot yükleme ucu takılmış bir mikropipet kullanın ve pencereleri kapatın.Dikkat edilmesi gereken bir nokta. Kordon güdüklerinin mümkün olduğunca hızlı ve dikkatli bir şekilde ele alınması çok önemlidir. Bir gecikme, güdüklerin şişmesine neden olarak kanalın omuriliğin üzerine geçirilmesini zorlaştırabilir ve daha fazla yaralanmaya yol açabilir.Transplantasyondan üç hafta sonra, kriyostat sagittal spinal doku kesitlerinin konfokal floresan görüntüleri, Schwann hücrelerinin kanal boyunca ve kanal içerisinde eşit dağılımının yanı sıra köprünün merkezinde kan damarlarını ve miyelinli aksonları ortaya koymaktadır. Akson rejenerasyonu ayrıca Schwann hücrelerinin varlığıyla yakından ilişkilidir; bu durum, rostral ve kaudal stump'lar arasındaki köprü boyunca akson rejenerasyonunu teşvik etmek için yapılandırılmış bir kanal içinde Schwann hücresi köprüsü kullanmanın etkinliğini doğrulamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu prosedür doğru şekilde uygulandığında 45 dakika içinde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, ek soruları yanıtlamak için EndoRay izleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Örneğin, köprüye kaç adet akson rejenerasyon gösteriyor ve bunların kaçı omuriliğe yeniden girmek için köprüden çıkıyor? Bu videoyu izledikten sonra; akson rejenerasyonu ve diğer sonuç değerlendirmeleri için güvenilir bir köprü oluşturmak amacıyla omuriliğin nasılleineleceği, bir kanalın nasıl yerleştirileceği ve bir matris içine hücrelerin nasıl enjekte edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

transplantation-schwann-cells-inside-pvdf-trfe-conduits-to-bridge

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Spinal kord travması sonucu beyin ile iletişimi bozar. Kayıp bağlantısı geri yüklemek için uzun mesafe büyümeyi teşvik etmek için inhibitör molekülleri kaldırmak için nörotrofik faktörler ve matris-modüle enzimler ile kombinasyon halinde rejenere lifler için altyapısını sağlamak üzere bir periferik sinir grefti kullanmaktadır.

Periferik Sinir Aşılama ve Matrix Modülasyon birleştiren Yaralı Rat Spinal Kord Onarım

Bacak hareketini ve hissini kontrol eden, açıkta kalan sağlam bir sağ siyatik siniri olan anestezi uygulanmış bir sıçan alın.Bir sinir segmentini eksize edin, bir boşluk oluşturun, nöronal aksonları ayırın ve sinyal iletimini bozun.Kopmuş distal aksonlar bozulur, özelleşmiş sinir onarımı veya Schwann hücrelerini ayırır.Mikrokanallı yumuşak bir tüp olan biyonik iletken bir sinir iskelesini, her iki kesik uçta sinirin dış tabakası olan epineuriuma dikin.Sinir uçlarına yakın implant eşleştirilmiş...

Elektriksel Stimülasyon ile Birlikte Biyonik İletken İskele Kullanılarak Sinir Onarımı

Kaynak: Lee, Y., et.al. Boşluk boyunca akson rejenerasyonunu teşvik etmek için kesilen sıçan omurilik kütüklerini köprülemek için PVDF-TrFE kanalları içindeki Schwann hücrelerinin transplantasyonu. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, kesilen bir sıçan omuriliğinde akson rejenerasyonunu teşvik etmek için Schwann hücreleri ile tohumlanmış bir piezoelektrik polimer kanalının kullanımını göstermektedir. Kanal, yapısal rehberlik sağlarken, biyoelektrik özellikleri nörit büyümesini uyarır. Kanal içindeki...

Omurilik Yaralanması Sonrası Aksonal Rejenerasyon için Schwann Hücre Tohumlu Kanallar

Büyüme faktörlerini içeren fibrin matrisi tam omurilik kesisi sitelerine aşılı nöral kök hücrelerini korumak için kullanılmıştır. Aşılı hücreler tamamen lezyon boşluğu doldurdu ve uzun mesafelerde konak omuriliğe aksonlarını uzatıldı nöronlar da dahil olmak üzere birden fazla nöral hücre tipleri, ayrışmıştır.

Şiddetli Spinal Kord Yaralanması sonra fibrin ve Büyüme Faktörü kokteyller ile Nöral Kök Hücre Survival ve Farklılaşma Tanıtım

Biz lezyon yerinde içine aşılama sekiz hafta embriyonik beyin nöral kök hücre T4 omurilik kesilen sıçanlarda kardiyovasküler parametreleri kaydetmek için bir radyo-telemetrik sisteminin kullanılması için bir protokol mevcut. Telemetri doğru bilinçli serbestçe hareket spinal kord yaralı sıçanlarda kardiyovasküler fonksiyonu değerlendirmek için gelişmiş bir tekniktir.

A Radyo-telemetrik Sistemi Omurilik transeksiyonu ve Embriyonik Nöral Hücre Greftler Kök Sıçanlarda Kardiyovasküler Fonksiyonu Monitör

Omurilik yaralanması ciddi morbidite ve mortalitesi yüksek bir neden travmatik bir durumdur. Bu çalışmada detaylı olarak nöral kök hücrelerin bir nakli ardından farelerde omurilik yaralanması bir kontüzyon modelini tarif.

Omurilik Yaralanması Deneysel Kontuzif Modelinde Sinir Kök Hücre Nakli

Ciddi omurilik yaralanmaları sıklıkla doku defektlerine neden olur. Akut yaralanmadan sonra ve tam omurilik transeksiyonundan beş hafta sonra mekanik bir mikrokonektör sisteminin implantasyonu yoluyla sıçanlarda doku adaptasyonunu, rejeneratif yanıtları ve fonksiyonel iyileşmeyi teşvik etmek için bu tür boşlukları başarılı bir şekilde kapatmak için iki olasılık tanımlanmıştır.

Deneysel Stratejileri Akut ve Kronik Lezyon sonra Yaralı Omurilik Büyük Doku boşlukları doldurmak için

Burada, kemirgen siyatik sinirindeki Schwann hücrelerine (SC'ler) gen transferi için in vivo bir teknik sunuyoruz. Bu basit teknik, miyelinizan SK'lerin geliştirilmesi ve sürdürülmesinde yer alan sinyalleme mekanizmalarını araştırmak için kullanışlıdır.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

Elektroporasyon genler çıkarlarının hücrelere teslim etmek için etkili bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım içinde vivo yetişkin fare dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar üzerinde uygulayarak, biz axon yenilenme içinde vivoçalışmaya bir modeli açıklar.

Soruşturma memeli Axon rejenerasyon: Vivo Elektroporasyon yetişkin fare Dorsal kök gangliyon

Bu video sıçanlarda nakli vaskülopati (TVP) gelişimini incelemek için basit bir model olarak spontan aort nakli modeli göstermektedir.

Ortotopik Aort Nakli: Rat Modeli Kronik Vaskülopati Geliştirme Çalışması

Öğrenin sıçan spinal kord yaralanmalarında PVDF-TrFE borular ve Schwann hücreleri kullanarak tam kesik arası köprü oluşturma yöntemini. Bu teknik akson rejenerasyonunu teşvik ederek fonksiyonel iyileşme sağlar.

Nakli Schwann hücreleri kopuk sıçan Spinal Kord kütükleri arasında boşluk Axon rejenerasyon teşvik için köprü için PVDF-TrFE borular içinde (Video) | JoVE Journal

Nakli Schwann hücreleri kopuk sıçan Spinal Kord kütükleri arasında boşluk Axon rejenerasyon teşvik için köprü için PVDF-TrFE borular içinde

Daha fazla video keşfet